La circulation sanguine – propriétés intrinsèques du globule rouge

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La circulation sanguine – propriétés intrinsèques du globule rouge

Le globule rouge est unique parmi les cellules humaines : il est anucléé et ne contient aucun organite. La membrane plasmique, son unique composant structurel, assure ses différentes fonctions mécaniques, antigéniques et de transport grâce à sa composition particulière qui sera détaillée dans un premier paragraphe. Un deuxième paragraphe présentera les propriétés caractéristiques permettant au globule rouge de résister aux aléas de la circulation sanguine. Enfin, le dernier paragraphe décrira rapidement le métabolisme érythrocytaire nécessaire à sa survie.

Composition et organisation de la membrane du globule rouge

L’organisation structurelle de la membrane du globule rouge lui permet de subir des déformations réversibles dans la circulation sanguine tout en conservant l’intégrité de sa structure. Une importante caractéristique de ces déformations est qu’elles n’impliquent pas de changement significatif de la taille de la surface membranaire : une augmentation de la surface cellulaire de 3 à 4% conduit à la lyse cellulaire. Malgré cela, un globule rouge normal peut se déformer avec une extension linéaire pouvant aller jusqu’à 250%, ce qui démontre une grande élasticité de la structure membranaire.
Ces propriétés inhabituelles sont dues à la structure composite de la membrane du globule rouge. Elle est en effet constituée d’une membrane plasmique reliée par des protéines transmembranaires à un réseau protéique élastique bidimensionnel, le squelette membranaire.
La membrane plasmique
La structure de la membrane plasmique est celle d’une membrane cellulaire classique : elle est constituée d’une bicouche lipidique où s’intercalent des protéines. La bicouche lipidique est composée en égales proportions de cholestérol et de phospholipides. Le cholestérol est distribué équitablement entre les deux couches, tandis que les phospholipides sont disposés de façon asymétrique.
Les protéines transmembranaires
Plus de 50 protéines transmembranaires ont été identifiées dans le globule rouge. Elles sont présentes en différentes quantités, allant de quelques centaines à un million de copies par cellule. Plus de la moitié d’entre elles portent les antigènes des différents groupes sanguins, comme notamment Band3, la glycophorine (GP) A, GPC, Rh, Rh-associated glycoprotein (RhAG), XK, Kell, Duffy, CD44, CD47, l’aquaporine 1 (AQP1), Lutheran (Lu) et ICAM-4 (intracellular adhesion molecule-4) (Reid and Mohandas, 2004).
Toutes ces protéines membranaires ont des fonctions diverses. Certaines assurent les échanges avec le milieu extérieur comme Band3 (échangeur Cl-/HCO3-), l’aquaporine AQP-1 (transporteur d’eau), ou GLUT-1 (transporteur du glucose) (Liu et al., 2011). D’autres sont impliquées dans l’adhésion cellule-cellule ou cellule-matrice extracellulaire comme ICAM-4, Lu, ou CD44. D’autres, comme la protéine Duffy, sont des récepteurs aux chimiokines (Chaudhuri et al., 1994).
Le squelette membranaire
Le squelette membranaire est formé d’un réseau de protéines qui tapissent la face interne de la membrane plasmique. Il est relié à la membrane plasmique par des interactions avec les domaines cytoplasmiques des protéines transmembranaires. Une interaction directe de plusieurs protéines du squelette avec des lipides membranaires permet des ancrages supplémentaires. Le cœur structural du réseau squelettique est formé par les filaments d’α-spectrine et de β-spectrine. Ces filaments sont reliés entre eux par un complexe jonctionnel constitué d’actine, de protéine 4.1R, de tropomyosine, de dématine, d’adducine et de tropomoduline (Mohandas and Gallagher, 2008).
Les complexes membranaires
Il existe deux complexes macromoléculaires majeurs importants pour l’intégrité structurelle de la membrane reliant la membrane plasmique au squelette membranaire : un basé sur l’ankyrine R, l’autre sur la protéine 4.1R. L’ankyrine R interagit d’une part avec les domaines cytoplasmiques de Band3 et RhAG, et d’autre part avec la spectrine, pour former le « complexe ankyrine R » (Bruce et al., 2003). Ce complexe macromoléculaire contient également la protéine 4.2, GPA, Rh, CD47 et ICAM-4. La protéine 4.1R s’associe avec GPC, p55, Duffy, XK et Rh pour former le « complexe 4.1R » au niveau du complexe jonctionnel (Salomao et al., 2008). Des études récentes ont montré que 4.2, Band3 et GLUT-1 sont aussi localisées au niveau du complexe jonctionnel : 4.2 via son interaction avec l’α-spectrine, Band3 via son interaction avec l’adducine, et GLUT-1 par interaction avec l’adducine et la dématine (Liu et al., 2011).
Un modèle schématique représentant la composition et l’organisation des protéines de la membrane érythrocytaire est présenté en Illustration 7.

Propriétés constitutives de résistance du globule rouge

En exerçant sa fonction de distributeur de l’oxygène aux tissus, le globule rouge subit des contraintes mécaniques continuellement au cours de sa vie sans être pour autant détérioré structurellement. Des études biophysiques étendues ont identifié trois caractéristiques constitutives du globule rouge comme étant les régulateurs majeurs de sa capacité à subir les déformations nécessaires : 1) la géométrie de la cellule, en particulier le ratio surface/volume cellulaire, 2) la viscosité cytoplasmique déterminée par la concentration intracellulaire en hémoglobine, 3) la déformabilité de la membrane.
Géométrie cellulaire
Le globule rouge biconcave normal possède un excédent de surface de 40% comparé à une sphère de même volume. Sans cet excédent, la cellule ne peut pas se déformer, car toute variation de l’état sphérique à volume constant implique une augmentation de la surface, que ne permettent pas les propriétés de la bicouche lipidique. Toute perte de surface par vésiculation, fragmentation cellulaire ou augmentation du volume cellulaire compromet la capacité de la cellule à se déformer et induit son élimination prématurée de la circulation.
Le maintien du volume cellulaire est assuré par divers transporteurs d’ions associés à la membrane. Le maintien de la surface membranaire est assuré par :
– la stabilité du squelette membranaire : elle dépend de l’intensité de l’interaction entre les filaments de spectrine (Liu and Palek, 1980) et des interactions qui définissent le complexe jonctionnel (Marchesi et al., 1990) ;
– une forte cohésion entre la bicouche et le squelette membranaire. Cette cohésion empêche la formation de vésicules, donc la perte de surface membranaire. Elle est assurée par le système de liaisons « verticales » décrit précédemment entre la bicouche lipidique et le squelette membranaire,
notamment par les complexes « ankyrine R » et « 4.1R ». De plus, grâce à leurs interactions directes avec les protéines du squelette, les phosphatidyl-sérines (PS) et le PIP2 contenus dans la bicouche peuvent réguler la fonction mécanique de la membrane. En effet, des études ont montré que les PS se lient aux spectrines α et β (Manno et al., 2002), et que le PIP2 augmente l’interaction de la protéine 4.1R avec la β-spectrine (An et al., 2005).
Viscosité cytoplasmique
La capacité d’un globule rouge normal à changer rapidement sa forme en réponse aux contraintes d’écoulement de la circulation sanguine est gouvernée par la viscosité cytoplasmique. Celle-ci est déterminée par la concentration intracellulaire en hémoglobine.
Chez l’homme, en moyenne, la concentration cellulaire en hémoglobine d’un globule rouge normal est de 33 g/dL, mais d’une cellule à l’autre, elle peut varier de 27 à 37 g/dL. La viscosité d’une solution d’hémoglobine augmente fortement à partir de 37 g/dL (Mohandas and Chasis, 1993). C’est pourquoi une augmentation de la concentration d’hémoglobine au dessus de 37 g/dL diminue fortement la vitesse de récupération de la forme initiale de la cellule après des déformations (Evans et al., 1984). Ainsi, une augmentation de la viscosité cytoplasmique compromettra la capacité de la cellule à s’accommoder rapidement aux étroits capillaires de la microcirculation, ainsi que son efficacité à distribuer l’oxygène aux tissus.
La capacité du globule rouge à réguler sa concentration en hémoglobine dans des limites étroites, dépend de manière critique de sa capacité à contrôler son volume. Comme le volume du globule rouge est déterminé principalement par son contenu total en cation, les transporteurs ioniques jouent un rôle important dans la régulation de la viscosité cytoplasmique (Milanick and Hoffman, 1986; Brugnara, 1997; Lew and Bookchin, 2005).
Déformabilité membranaire
Une caractéristique unique de la membrane du globule rouge est sa grande élasticité, qui lui permet de répondre rapidement aux contraintes de la circulation sanguine. Le réseau squelettique, en particulier la spectrine, a un rôle critique dans l’élasticité membranaire. En effet, des études ont montré que l’interaction entre les filaments de spectrine alterne entre les états ouvert et fermé en fonction de la déformation membranaire (An et al., 2002).

Métabolisme et enzymes érythrocytaires

Les besoins énergétiques du globule rouge sont faibles comparé à une cellule nucléée. Toutefois, l’absence d’organelles telles que la mitochondrie est palliée par tout un arsenal enzymatique chargé des besoins métaboliques du globule rouge. Ces systèmes enzymatiques participent à la survie et la fonction du globule rouge en fournissant l’énergie nécessaire pour maintenir l’intégrité de la membrane et donc sa forme biconcave, assurer les échanges membranaires avec le milieu extérieur, lutter contre les agents oxydants et assurer sa fonction de transporteur d’oxygène. L’énergie du globule rouge provient entièrement de la dégradation du glucose (Illustration 8). La principale voie de dégradation du glucose est la glycolyse anaérobie (voie d’Embden-Meyerhoff) qui dégrade 90% du glucose. Pour chaque molécule de glucose dégradée, elle génère 2 molécules d’ATP alors que la glycolyse aérobie en produit 36. L’ATP est indispensable pour le fonctionnement des pompes du globule rouge, notamment les pompes à sodium (Na/K-ATPase). La glycolyse anaérobie produit également du NADH qui est essentiel pour maintenir le taux de méthémoglobine à un faible niveau : il sert de donneur d’ions d’hydrogène pour la réduction de la méthémoglobine en hémoglobine (voir § I.3.2.). Les enzymes clés de la glycolyse sont l’hexokinase, la phospho-fructo-kinase (PFK), la glycéraldéhyde-3-phospho-déshydrogénase (G3PDH) et la pyruvate-kinase. Le déficit de l’une de ces enzymes peut être responsable d’une anémie hémolytique héréditaire. La voie accessoire qui dégrade 10% du glucose est la voie des pentoses phosphates. Elle se branche sur la voie principale au niveau du glucose-6-phosphate (G6P). Elle assure, entre autres, la formation de NADPH qui permet de lutter contre les agents oxydants. La production de NADPH dépend de la première étape de la voie impliquant la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD). Un déficit de cette enzyme entraîne également une anémie hémolytique.

La rate, le foie et la moelle osseuse – destruction des globules rouges ou érythrophagocytose

La durée de vie moyenne des globules rouges est de 120 jours chez l’homme et 40 jours chez la souris. Ils sont ensuite détruits par des cellules phagocytaires : les macrophages. Ces macrophages sont stationnés dans les capillaires de la rate principalement, mais également dans le foie et la moelle osseuse.
Arrivés au terme de leur vie, les érythrocytes sénescents sont porteurs d’anomalies de structure et de morphologie. La perte de l’élasticité membranaire les immobilise dans les capillaires et les exposent aux macrophages. Les phosphatidyl-sérines (PS) de la membrane plasmique, habituellement confinées sur la face interne, sont exposées sur la couche externe et reconnues par les macrophages. Cette perte d’asymétrie conduisant à l’exposition des PS est d’ailleurs supposée jouer un rôle dans la destruction prématurée des érythrocytes thalassémiques et drépanocytaires (Kuypers et al., 1998; Yasin et al., 2003). Les macrophages reconnaissent également des clusters de Band3 sur la membrane (Low et al., 1985).
L’hémolyse physiologique est intra-tissulaire donc extra-vasculaire : l’hémoglobine n’est donc pas libérée dans les vaisseaux sanguins. Lorsque les globules rouges sont phagocytés par les macrophages, la membrane est digérée et l’hémoglobine libérée est aussitôt dégradée par les enzymes du macrophage. Les acides aminés de la globine sont récupérés par l’organisme, le fer est stocké dans les macrophages, puis réutilisé, et le reste de l’hème (la porphyrine) est transformé en bilirubine. La bilirubine libre se lie à l’albumine, passe dans le sang, est transformée par le foie en bilirubine conjuguée puis éliminée sous forme de stercobilinogène.

Pathologies du globule rouge

Il existe deux types de pathologies affectant les globules rouges : les polyglobulies et les anémies. Les polyglobulies sont définies par un excès d’érythrocytes. Elles sont dues à une augmentation de la production d’érythrocytes due à une suractivation des voies de signalisation. Cette suractivation peut être de cause intrinsèque à la cellule comme dans la polyglobulie de Vaquez où elle est due dans la majorité des cas (>80%) à une mutation de la protéine JAK2 (JAK2-V617F) (James et al., 2005). On parle alors de polyglobulie primitive. Dans d’autres cas, la suractivation peut être due à une augmentation du taux d’Epo circulante qui va alors stimuler de façon aberrante la production érythrocytaire. On parle alors de polyglobulie secondaire.
Les anémies sont caractérisées par un déficit en globules rouges. Ce chapitre détaillera les différents types d’anémies existants ainsi que leurs causes, après avoir présenté les principales constantes érythrocytaires.

Constantes érythrocytaires

Lors d’une numération sanguine, différents paramètres sont mesurés :
– le Taux d’Hémoglobine : il définit la présence d’une anémie.
– le Nombre d’érythrocytes,
– l’Hématocrite : elle correspond au pourcentage relatif du volume des cellules circulant dans le sang par rapport au volume total de sang.
Ces trois paramètres serviront ensuite à calculer les constantes suivantes :
– Volume Globulaire Moyen (VGM) : il représente la taille des érythrocytes, et correspond au rapport Hématocrite / Nb d’érythrocytes.
– Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (CCMH) : c’est la concentration moyenne d’hémoglobine par érythrocyte. Elle est calculée par le rapport Taux d’Hb / Hématocrite.
– Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine (TCMH) : elle représente la quantité d’hémoglobine moyenne contenue dans un érythrocyte, et correspond au rapport Taux d’Hb / Nb d’érythrocytes.
Le taux de réticulocytes peut également être mesuré, il reflète la production nouvelle d’érythrocytes.

Classification des anémies

L’anémie est définie par une diminution du taux d’hémoglobine sanguin. Le taux d’hémoglobine minimal est de 13 g/dL chez l’homme, et 12 g/dL chez la femme. Chez la souris, il dépend du fond génétique et de l’âge des individus.
Il existe différents types d’anémies ayant des causes multiples qui sont résumées dans l’illustration 10. Ces anémies peuvent être dues :
– à une production insuffisante d’érythrocytes : on parle alors d’anémie arégénérative. Dans ce cas, l’érythropoïèse est insuffisante et le taux de réticulocytes est inférieur à la normale (<2,5%) ;
– à une perte ou une destruction accélérée des globules rouges : on parle alors d’anémie régénérative. Dans ce cas, l’érythropoïèse est efficace et stimulée par le stress érythroïde, le taux de réticulocytes est alors supérieur à la normale (>2,5%).

Les cytokines, hormones et la signalisation intracellulaire

L’efficacité de l’érythropoïèse dépend de la présence et de l’action coordonnée de nombreux facteurs de croissance assurant la survie, l’expansion et la maturation des progéniteurs érythroïdes. Parmi ces facteurs, on trouve des cytokines hématopoïétiques comme l’interleukine-1 (IL-1), l’IL-3, l’IL-4, l’IL-9, l’IL-11, le Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF), et la Thrombopoïétine (TPO). L’IL-3 agit, en synergie avec le GM-CSF, sur la prolifération des progéniteurs multipotents et des BFU-e. L’IL-9 et l’IL-11 permettent la prolifération des BFU-e mais également la maturation des CFU-e. La TPO, en conjugaison avec d’autres cytokines, permet d’augmenter la prolifération des progéniteurs érythroïdes (Birkmann et al., 1997).
D’autres facteurs non hématopoïétiques comme l’Insuline et l’Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) ont un rôle dans l’érythropoïèse. En effet, il a été montré que l’Insuline et/ou l’IGF-1 sont nécessaires au développement correct des CFU-e humaines in vitro (Sawada et al., 1989; Boyer et al., 1992), et qu’ils stimulent tous deux la prolifération des BFU-e tardives et CFU-e (Miyagawa et al., 2000). Le rôle de l’IGF-1 sera plus amplement détaillé dans le paragraphe II.1.4.
De plus, les glucocorticoïdes, hormones lipophiles régulant divers processus physiologiques, semblent également jouer un rôle dans l’érythropoïèse. En effet, in vitro, ils permettent la formation de colonies érythroïdes murines (Golde et al., 1976) et augmentent la prolifération des cellules érythroïdes en présence de faibles quantités d’Epo (Udupa et al., 1986). De plus, une étude in vivo a montré que le récepteur aux glucocorticoïdes (Glucocorticoid Receptor – GR) est essentiel à l’expansion des progéniteurs érythroïdes immatures pendant l’érythropoïèse de stress induite par hémolyse ou hypoxie (Bauer et al., 1999).
Il existe également des cytokines inhibant l’érythropoïèse telles que le Tumor Necrosis Factor α (TNFα) et l’interféron γ qui, libérés par les macrophages au cours de la réponse inflammatoire, ont une action négative sur la prolifération des CFU-e et des proérythroblastes.
Cependant, les deux principales cytokines ayant un rôle essentiel dans l’érythropoïèse sont le Stem Cell Factor (SCF) et l’érythropoïétine (Epo).
L’érythropoïèse est régulée principalement par le Stem Cell Factor (SCF) et l’érythropoïétine (Epo). Le SCF induit des signaux de survie et de prolifération permettant l’expansion des progéniteurs précoces. L’Epo agit dès le stade BFU-e pour stimuler la prolifération, la survie et la différenciation des progéniteurs érythroïdes.
Le SCF est une cytokine hématopoïétique qui agit via son récepteur spécifique c-Kit pour induire des signaux de survie et retarder la différenciation permettant ainsi la prolifération et l’expansion des progéniteurs érythroïdes immatures (Muta et al., 1995).
Le rôle de l’érythropoïétine dans l’érythropoïèse sera détaillé dans la suite de ce chapitre.

L’érythropoïétine et son récepteur

L’érythropoïétine (Epo) est le principal régulateur de l’érythropoïèse. Elle agit sur la survie, la prolifération et la différenciation des progéniteurs érythroïdes. C’est une glycoprotéine de 34kDa, purifiée pour la première fois en 1977 à partir d’urine de patients anémiques (Miyake et al., 1977). La plupart des facteurs de croissance hématopoïétiques sont produits constitutivement et agissent localement. L’Epo, en revanche, est l’un des deux facteurs de croissance hématopoïétiques, avec la thrombopoïétine, se comportant comme une hormone. Elle est en effet produite par le rein et agit sur les progéniteurs érythroïdes dans la moelle osseuse (Spivak, 2005).
Au cours du développement embryonnaire, l’Epo est d’abord produite par le foie. Le rein prend progressivement le relais pour devenir, chez le mammifère adulte, le principal organe producteur d’Epo (Koury et al., 1988). La production d’Epo est régulée au niveau transcriptionnel par le taux d’oxygène fourni aux organes. En effet, l’hypoxie, via le facteur HIF1 (Hypoxia-inducible factor 1), est le seul régulateur physiologique de l’expression du gène de l’érythropoïétine. En cas d’hypoxie tissulaire, HIF1α entre dans le noyau, se dimérise avec HIF1β et transactive, entre autres, le gène de l’érythropoïétine (Jewell et al., 2001). L’augmentation de la production d’Epo permet alors l’augmentation de la production d’érythrocytes. La fin de l’hypoxie (normoxie, ou en cas d’hyperoxie), ou l’augmentation de la viscosité sanguine induit une diminution de la production d’Epo. Il n’existe pas de stockage de l’Epo. Une augmentation du taux d’Epo sérique représente l’entrée dans la circulation sanguine d’hormone nouvellement synthétisée. Comme beaucoup de facteurs de croissance hématopoïétiques, l’Epo est métabolisée par ses cellules cibles après liaison à son récepteur et internalisation.
L’Epo agit sur ses cellules cibles via son récepteur spécifique : le récepteur à l’Epo (Epo-R). Ce dernier est exprimé dans les progéniteurs érythroïdes de la moelle osseuse, ainsi que dans plusieurs tissus non-hématopoïétiques comme les myocytes, les neurones corticaux et les épithéliums prostatiques, mammaires et ovariens (Richmond et al., 2005). Dans le lignage érythroïde, l’Epo-R est exprimé à la surface des progéniteurs dès le stade BFU-e mature. Son expression augmente au cours de la différenciation, elle est maximale aux stades CFU-e et proérythroblaste puis diminue et disparaît au stade érythroblaste polychromatophile (Spivak, 2005).
Le récepteur à l’Epo appartient à la famille des récepteurs aux cytokines de classe I (Mayeux et al., 1990). Ces récepteurs possèdent un domaine transmembranaire unique et un domaine cytoplasmique dépourvu d’activité tyrosine kinase intrinsèque. Celle-ci est assurée par la protéine Janus Kinase 2 (JAK2), associée de manière constitutive au domaine intracellulaire du récepteur. Le domaine cytoplasmique contient 8 résidus Tyrosine.
L’Epo-R existe à l’état dimérisé à la surface des cellules. La fixation de l’Epo sur son récepteur entraîne un changement conformationnel conduisant à l’activation des protéines JAK2 par trans-phosphorylation. Les protéines JAK2 ainsi activées vont phosphoryler les tyrosines du domaine intracellulaire de l’Epo-R qui serviront alors d’ancrage à plusieurs protéines à domaine SH2 (Src homology 2) telles que STAT5a/b, SHP1, SHP2, SHIP, la sous-unité régulatrice p85α de la PI3K, Grb2, la tyrosine kinase Lyn, ainsi que les régulateurs négatifs de la signalisation SOCS (Suppressor of Cytokine Signaling). Ces protéines seront à leur tour activées par phosphorylation, entraînant l’activation de plusieurs voies de signalisation intracellulaire, notamment les voies STAT5, Ras/MAPK, et PI3K/Akt.
Le couple Epo/Epo-R joue un rôle essentiel dans l’érythropoïèse. En effet, des souris invalidées pour le gène de l’Epo (Epo-/-) ou de l’Epo-R (Epo-R-/-) présentent une érythropoïèse primitive réduite et meurent à 13 jours de développement embryonnaire (E13) d’une sévère anémie. L’Epo et l’Epo-R sont donc indispensables à l’érythropoïèse définitive. Les foies fœtaux de ces souris contiennent des BFU-e et CFU-e. L’Epo et l’Epo-R ne sont donc pas essentiels à l’engagement dans la lignée érythroïde ni à la prolifération et la différenciation des progéniteurs précoces. Ils sont par contre nécessaires à la prolifération et la survie des CFU-e ainsi qu’à leur différenciation terminale (Wu et al., 1995b).

Les voies de signalisation activées par le couple Epo/Epo-R

Description générale

Dans le lignage érythroïde, le couple Epo/Epo-R induit la survie, la prolifération et la différenciation des progéniteurs par l’activation d’un certain nombre de voies de signalisation telles que la PLCγ, PI3K/Akt, Src/Lyn, Grb2/Ras/MAPK, JAK2/STAT5. Ces différentes voies de signalisation sont résumées dans l’illustration 14.
Le couple Epo/Epo-R induit la prolifération, la survie et la différenciation cellulaire via diverses voies de signalisation. La fixation de l’Epo sur son récepteur Epo-R conduit à la phosphorylation (ovale vert) des protéines JAK2 qui elles-mêmes phosphorylent les 8 résidus Tyrosine (Y) du récepteur. Ceci permet alors l’activation des différentes voies de signalisation comme les voies JAK2/STAT (cadre en noir), Ras/MAPK (cadre rose) ou PI3K/Akt (cadre vert).
Dans ce travail, nous nous focaliserons plus particulièrement sur le rôle de la voie PI3K/Akt.

La voie PI3K / Akt

Il existe trois classes différentes de Phosphatidylinositol 3-Kinases (PI3K). Jusqu’à présent, seules les isoformes de classe I ont été impliquées dans l’hématopoïèse. Les PI3K de classe IB étant uniquement exprimées dans les leucocytes (Vanhaesebroeck and Waterfield, 1999), nous nous intéresserons ici aux PI3-Kinases de classe IA.
Les PI3K de classe IA sont constituées d’une sous-unité régulatrice (p85) et d’une sous-unité catalytique (p110). Dans les progéniteurs érythroïdes stimulés par l’Epo, elles peuvent être activées par trois voies alternatives indépendantes : 1) par l’association directe de la sous-unité p85α sur la Tyrosine 479 phosphorylée de l’Epo-R, 2) par le recrutement et la phosphorylation de la protéine Gab via les Tyr343 ou Tyr401 de l’Epo-R, 3) par la phosphorylation de la protéine adaptatrice IRS-2 (Insulin Receptor Substrate-2) (Bouscary et al., 2003). Quel que soit le mécanisme, l’activation de la PI3K est essentielle pour l’érythropoïèse puisque des souris qui n’expriment pas la p85α présentent une érythropoïèse réduite avec une diminution du nombre de BFU-e et CFU-e (Huddleston et al., 2003).
L’activation de la PI3K transforme le PIP2 en PIP3 qui permet le recrutement à la membrane et la phosphorylation de la Sérine/Thréonine kinase Akt (ou PKB pour Protein Kinase B). Le recrutement s’effectue via PDK1 (3-Phosphoinositides-Dependant Kinase 1) qui colocalise avec Akt à la membrane plasmique via son domaine PH (Pleckstrin Homology domain), tandis que le PIP3 est nécessaire à l’exposition des sites de phosphorylation. Akt est alors phosphorylé sur la Thr308 et la Ser473. Ainsi activé, il est ensuite transloqué vers le cytoplasme puis vers le noyau. Akt va alors phosphoryler à son tour ses différentes cibles de manière à les activer ou au contraire les inhiber (Thompson and Thompson, 2004).
La voie PI3K/Akt est impliquée dans plusieurs processus indispensables à la cellule comme la régulation de la prolifération, la survie, le métabolisme, la réorganisation du cytosquelette ou le trafic membranaire. De nombreuses études ont montré que sa dérégulation est impliquée dans une grande variété de cancers, notamment des leucémies (Ringshausen et al., 2002; Kubota et al., 2004; Silva et al., 2008). Les composants de cette voie sont d’ailleurs considérés comme des cibles thérapeutiques prometteuses contre les leucémies (Martelli et al., 2006; Polak and Buitenhuis, 2012). Dans le lignage érythroïde, elle a été montrée comme impliquée dans la survie et la prolifération cellulaire, mais également dans la différenciation érythroïde.
Plusieurs études montrent l’importance de la voie PI3K/Akt dans la survie des cellules érythroïdes. Une étude de Haseyama et al. montre que le LY294002, inhibiteur de la PI3K, induit l’apoptose des CFU-e humaines, suggérant un rôle anti-apoptotique de la PI3K (Haseyama et al., 1999). Une autre étude faite sur des progéniteurs érythroïdes précoces humains montre que l’effet positif de l’Epo sur la survie des cellules est totalement bloqué par le LY294002 (Myklebust et al., 2002). L’effet de la voie PI3K/Akt sur la survie cellulaire s’exerce par plusieurs mécanismes complémentaires.
D’une part, Akt permet la survie cellulaire en phosphorylant directement des régulateurs de l’apoptose, comme par exemple la protéine pro-apoptotique Bad. Bad est une protéine de la famille Bcl-2, contenant un domaine BH-3 (Bcl-2 Homology Domain 3). Ce domaine permet l’activation d’autres protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 telles que Bax ou Bak. Akt phosphoryle Bad sur la Ser136. Cette phosphorylation entraîne la séquestration cytoplasmique de Bad par les protéines 14-3-3, empêchant ainsi son interaction à la membrane mitochondriale avec les protéines Bcl-2 ou Bcl-XL. Il en résulte une inhibition de l’apoptose (Zha et al., 1996; Datta et al., 1997; Thompson and Thompson, 2004). Akt phosphoryle également la protéine Mdm2. Mdm2 est une ubiquitine ligase E3 permettant l’ubiquitination et la dégradation par le protéasome du suppresseur de tumeur p53. Cette phosphorylation permet la translocation vers le noyau et l’activation de Mdm2, assurant ainsi la down-régulation de p53, empêchant les arrêts du cycle (checkpoints) p53-dépendants et inhibant l’apoptose (Zhou and Hung, 2002). D’autre part, Akt permet également la survie cellulaire en régulant positivement ou négativement l’activité de différents facteurs de transcription. En effet, les facteurs NF-kB ou CREB, par exemple, sont activés par la voie PI3K/Akt, conduisant ainsi à l’augmentation de la transcription de gènes anti-apoptotiques comme cIAP1, cIAP2, Bcl-2 ou mcl-1 (Nicholson and Anderson, 2002).
Une autre cible d’Akt est le facteur de transcription FoxO3A (Forkhead box O3A) ou FKHR-L1. FoxO3A a un rôle pro-apoptotique. Il active en effet la transcription de gènes pro-apoptotiques tels que Bim et FasL (Brunet et al., 1999; Dijkers et al., 2000a), mais également l’inhibiteur du cycle cellulaire p27KIP1(Dijkers et al., 2000b), ou le facteur anti-prolifératif BTG1 (B cell Translocation Gene 1) (Bakker et al., 2004). Tous les membres de la famille FoxO possèdent trois sites de phosphorylation par Akt. La phosphorylation de FoxO3A par Akt modifie sa localisation intra-cellulaire. En l’absence d’Akt activé, FoxO3A est principalement localisé dans le noyau, où il exerce son activité transcriptionnelle. L’activation de la voie PI3K/Akt induit son export du noyau. En effet, les protéines FoxO3A phosphorylées dans le noyau interagissent spécifiquement avec les protéines 14-3-3 qui servent alors de molécules chaperonnes pour les escorter hors du noyau. Une fois dans le cytoplasme, les protéines FoxO3A sont alors dégradées par la voie ubiquitine-protéasome (Plas and Thompson, 2003; Van Der Heide et al., 2004). La phosphorylation de FoxO3A par la voie PI3K/Akt en réponse à l’Epo, et son rôle anti-apoptotique a été montrée dans la lignée érythroleucémique UT-7/Epo ainsi que dans des progéniteurs érythroïdes primaires humains CD34+ (Kashii et al., 2000; Uddin et al., 2000). FoxO3A semble d’ailleurs jouer un rôle important au cours de l’érythropoïèse car des souris déficientes pour ce gène (Foxo3a-/-) présentent une anémie associée à un nombre élevé de réticulocytes (réticulocytose) (Castrillon et al., 2003).
Une autre cible d’Akt est la Sérine/Thréonine kinase Glycogen Synthase Kinase-3 (GSK-3). La GSK-3 est impliquée dans de nombreux processus cellulaires et joue notamment un rôle important dans le métabolisme en inactivant par phosphorylation la glycogène synthase, et dans le cycle cellulaire en induisant la dégradation de la cycline D1. L’activité de la GSK-3 semble être régulée par Akt. En effet, une étude de Cross et al. a montré qu’en réponse à l’insuline, la voie PI3K/Akt phosphoryle la GSK-3, réduisant ainsi son activité (Cross et al., 1995). Par ailleurs, une étude de Somervaille et al. a montré que la GSK-3 semblait impliquée dans l’apoptose des progéniteurs érythroïdes humains CD34+ induite en absence de facteurs de croissance. Cette étude montre également que l’Epo inhibe la GSK-3, permettant la survie des progéniteurs, et que cet effet passe par la voie PI3K/Akt puisqu’il est inhibé par le LY294002 (Somervaille et al., 2001).

Table des matières

INTRODUCTION
I. L’érythropoïèse
1. Siège de l’érythropoïèse murine
1.1. Ontogénie
1.2. L’érythropoïèse chez l’adulte
2. Description de l’érythropoïèse au niveau cellulaire
3. Le globule rouge : la cellule fonctionnelle
3.1. La circulation sanguine – propriétés intrinsèques du globule rouge
3.2. Les poumons – fonction du globule rouge
3.3. La rate, le foie et la moelle osseuse – destruction des globules rouges ou érythrophagocytose
3.4. Pathologies du globule rouge
II. Les facteurs moléculaires régulant l’érythropoïèse
1. Les cytokines, hormones et la signalisation intracellulaire
1.1. L’érythropoïétine et son récepteur
1.2. Les voies de signalisation activées par le couple Epo/Epo-R
1.3. Coopérations de l’Epo-R avec d’autres récepteurs
1.4. IGF-1 et érythropoïèse
2. Le facteur de transcription GATA-1 et ses cofacteurs
2.1. Le facteur de transcription GATA-1
2.2. GATA-1 et ses cofacteurs
III. Situation du sujet
RESULTATS
I. Rôle de la phosphorylation de GATA-1 par Akt : établissement d’un modèle moléculaire dynamique
1. Validation des conditions expérimentales pour l’étude de la phosphorylation de GATA-1 par Akt
1.1. Validation d’un anticorps spécifique de la Ser310 phosphorylée pour la visualisation directe de la phosphorylation de GATA-1
1.2. Détermination des conditions optimales pour l’étude de la phosphorylation Epo-dépendante de GATA-1
2. Quel est le rôle de la phosphorylation dans les interactions de GATA-1 avec ses partenaires FOG-1 et pRb ?
2.1. Etude du rôle de la phosphorylation de GATA-1 dans l’interaction GATA-1/FOG-1 par coimmunoprécipitation
2.2. Etude du rôle de la phosphorylation de GATA-1 dans l’interaction GATA-1/FOG-1 par la technique du double hybride chez la levure
2.3. Quel est l’effet de l’augmentation de la quantité de protéines FOG-1 sur l’interaction GATA-1- S310A/FOG-1 ?
3. Quel est le rôle de la phosphorylation dans la régulation des fonctions de GATA-1 ?
3.1. Quel est l’effet de la phosphorylation sur la régulation de la fonction antiproliférative du complexe GATA-1/pRb par FOG-1 ?
3.2. Quel est l’effet de la phosphorylation sur la régulation de la fonction transactivatrice de GATA-1 par FOG-1 ?
II. Application à un modèle de pathologie humaine : restauration in vitro du phénotype induit par la protéine GATA-1-V205G
1. La protéine GATA-1-V205G est-elle phosphorylée par Akt sur la Ser310 ?
2. La phosphorylation constitutive de GATA-1-V205G restaure-t-elle sa capacité à induire une différenciation érythroïde terminale ?
2.1. Création de nouveaux vecteurs codant pour les protéines GATA-1-V205G-S310A et GATA-1 V205GS310D
2.2. La protéine GATA-1-V205G-S310D est-elle capable d’induire une différenciation érythroïde terminale ?
3. L’augmentation de la quantité de FOG-1 restaure-t-elle la différenciation érythroïde induite par GATA-1-V205G-S310D ?
3.1. Etablissement de nouvelles lignées G1E et G1E-ER surexprimant la protéine FOG-1
3.2. Validation physiologique des nouvelles lignées G1E-ER-Fog-1 par induction à l’œstradiol
3.3. La protéine GATA-1-V205G-S310D restaure-t-elle une différenciation érythroïde totale dans les cellules surexprimant FOG-1 ?
III. Application à un modèle physiologique : étude d’un modèle de souris Knock-In exprimant une protéine GATA-1 non phosphorylable par Akt – GATA-1-S310A
1. L’érythropoïèse fœtale des souris gata-1-S310A est-elle équivalente à celle des souris contrôle ?
2. L’érythropoïèse adulte des souris gata-1-S310A est-elle équivalente à celle des souris contrôle ?
2.1. Les globules rouges gata-1-S310A sont-ils équivalents aux contrôles ?
2.2. La production érythrocytaire des souris gata-1-S310A adultes est-elle équivalente à celle des contrôles ?
2.3. Quel est le rôle de l’insuline/IGF-1 et de la transferrine dans l’érythropoïèse des souris gata-1- S310A ?
3. Quel est le rôle de la voie IGF-1 dans l’érythropoïèse des souris gata-1-S310A ?
3.1. Approche expérimentale
3.2. L’inhibition de la voie IGF-1 induit une anémie chez les souris gata-1-S310A
3.3. La morphologie des globules rouges des souris gata-1-S310A semble être modifiée après inhibition
de la voie IGF-1 :
3.4. La teneur en hémoglobine des globules rouges des souris gata-1-S310A semble être modifiée après inhibition de la voie IGF-1 :
3.5. L’anémie des souris gata-1-S310A/PPP est-elle régénérative ou arégénérative ?
4. Compléments de l’étude de l’érythropoïèse des souris gata-1-S310A : résultats préliminaires
4.1. Pourquoi les globules rouges des souris gata-1-S310A ont-ils une durée de vie inférieure à celle des souris contrôle ?
4.2. Pistes d’explications moléculaires de la compensation de l’absence de phosphorylation de GATA-1 chez les souris gata-1-S310A
4.3. Les souris gata-1-S310A adultes ne présentent pas de défauts majeurs de l’érythropoïèse en condition homéostatique à 12 semaines. Qu’en est-il pour des animaux plus âgés ?
4.4. Si les souris gata-1-S310A présentent un défaut de l’érythropoïèse, quel est le potentiel de reconstitution hématopoïétique des cellules souches de ces souris ?
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
1. Comment la phosphorylation de GATA-1 par Akt régule-t-elle la balance entre prolifération et différenciation érythroïde ?
1.1. Comment la phosphorylation de GATA-1 par Akt augmente-t-elle l’affinité GATA-1/FOG-1 ?…..
1.2. La phosphorylation de GATA-1 sur la Ser310 permet la transcription d’une certaine catégorie de gènes
1.3. La phosphorylation de GATA-1 sur la Ser310 est nécessaire pour les dernières étapes de la différenciation érythroïde
2. L’IGF-1 compense les défauts érythroïdes dus à l’absence de phosphorylation de GATA-1191
2.1. Mécanismes de compensation chez la souris
2.2. Un défaut érythroïde compensé par l’IGF-1
2.3. Mécanismes moléculaires et cellulaires proposés
MATERIEL ET METHODES
1. Culture cellulaire
2. Cytométrie
3. Expression de protéines exogènes
4. Biochimie
5. Biologie moléculaire
6. Lignées murines
BIBLIOGRAPHIE

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