La chromatographie liquide a haute performance Shimadzu/DAD

La chromatographie liquide a haute performance Shimadzu/DAD

LES PRINCIPALES METHODES POUR LE DOSAGE DES MEDICAMENTS :

Les méthodes du dosage des médicaments peuvent être séparées en deux grands groupes : les méthodes immunologiques et les méthodes chromatographiques A- Méthodes immunologiques : Principe général: Utilisation d’anticorps (poly ou mono clonaux) dirigés contre le médicament à doser. Méthode utilisant la réaction antigène (médicament)/anticorps en quantité limitée. Faisant appel à des courbes d’étalonnage – La méthode EMIT(Enzyme MultipliedImmuno-assay Technique) Dosage Immuno-enzymatique, c’est-à-dire le marqueur est une enzyme : Le médicament entre en compétition pour l’anticorps avec un antigène marqué par l’enzyme. Le site enzymatique est masqué lors de la liaison avec l’anticorps, l’enzyme est active sur son substrat quand l’antigène est à l’état libre et la lecture est obtenue dans l’UV par la réduction de nicotinamide di-nucléotide (NAD), cofacteur de la réaction, qui se transforme en NADH absorbant à 340 nm. • plus il y a de médicament dans l’échantillon : • plus la quantité d’enzyme active sera importante • plus la quantité de substrat hydrolysée sera importante, • plus l’absorbance dans l’ultra-violet sera élevée. • Méthode très bien adaptée aux dosages de petites molécules, – La méthode CEDIA (Cloned Enzyme DonorImmuno-Assay): Il s’agit du même principe que la méthode EMIT, sauf que l’enzyme utilisée est une enzyme bactérienne scindée en deux fragments inactifs par génie génétique : un fragment enzyme accepteur (EA) et un fragment enzyme donneur (ED), l’association spontanée de ces deux fragments donne une enzyme active. – la méthode FPIA (Fluorescence PolarizationImmuno-Assay)

Performances et critères de choix d’une méthode d’analyse

Limites de détection et de quantification La limite de détection d’une méthode d’analyseest la plus petite quantité d’analyte qui peut être détectée mais pas nécessairement quantifiée comme une valeur exacte La limite de quantification est la Quantité la plus faible d’analyte dans un échantillon qui peut être déterminée quantitativement avec une fidélité et une exactitude appropriée – Justesse ; exactitude et reproductibilité Etroitesse d’accord entre la valeur trouvée et la valeur acceptéesoit comme valeur conventionnellement vraie soit comme valeur de référence La reproductibilité exprime la variabilité inter laboratoires (études collaboratives) habituellement appliquées à la standardisation de la méthodologie – fidélité (répétabilité) Etroitesse d’accord entre une série demesures obtenues dans des conditions prescrites à partir de prises d’essais multiples provenant d’une même échantillon homogène La répétabilité exprime la fidélité évaluée dans des conditions opératoires identiques et dans un court intervalle de temps – Domaine de linéarité et sensibilité Capacité dans un intervalle donné d’obtenir desrésultats de dosage directement proportionnels à la concentration ou à la quantité d’analyte dans l’échantillon – Robustesse Capacité du protocole de rester non affectée par des variations faibles mais délibérément introduites dans les paramètres de la méthode; fournit une indication sur sa fiabilité dans des conditions normales d’utilisation Capacité de la méthode de permettre uneévaluation non équivoque de l’analyte en présence de composants qui sont susceptibles d’être présents – Coût (investissement et fonctionnement) Il est bien évident que rechercher l’exactitude du résultat aura un certain coût : – Pouvoir disposer d’une méthode juste demandera un investissement non négligeable pourl’étudier, en vue de sa validation… ou alors on fera appel, si elle existe, à une méthode deréférence qui ne sera pas forcément la mieux adaptée à l’environnement du laboratoire, sil’on doit en particulier effectuer de grandes séries d’analyses. Mais la justesse ne sera pasforcément une nécessité, si l’on peut se contenter de valeurs relatives destinées à êtrecomparées entre elles dans le cadre d’une étude particulière menée au sein du laboratoire. – De même, la répétabilité a un prix, qui se traduit le plus souvent dans l’achat de matérielde précision et d’instruments de mesure plus sophistiqués. Or cette recherche de laprécision n’a souvent pour but que d’obtenir une variance attachée à la répétition desanalyses telle que les effets qu’on veut mettre en évidence ne soient pas masqués.

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Table des matières

INTRODUCTION
– PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
– Présentation du lieu du Stage
– Les principales méthodes du dosage des médicaments
– Méthodes Immunologiques
– Méthodes dites « Manuelles »
– Méthodes Colorimétriques
– Électrophorèse Capillaire (EC)
– HPLC (High Performance Liquid Chromatography )
– La Rifampicine
– Suivie thérapeutique de la Rifampicine
– Choix et validation d’une méthode
– PARTIE PRATIQUE
– MATERIEL ET METHODE
– Objet et domaine d’application
– Matériel
– La chromatographie liquide a haute performance Shimadzu/DAD
– Description de la HPLC SHIMADZU/DAD
– Produits
– Phase Mobile
– Pré-colonne
– Colonne
– Préparation des échantillons
– Conditionnement de l’analyse
– RESULTATS ET DISCUSSION
– Optimisation de la méthode analytique
– Validation de la méthode analytique
– Spécificité/ sélectivité
– Linéarité
– La fidélité : Répétabilité
– Justesse
– Limite de détection
– Limite de Quantification
– Dosage de La Rifampicine
– Discussion
– Conclusion