Soutenance mémoire
La chromatographie d’échange d’ions ou chromatographie ionique a connu un essor important ces dernières décennies. Cet essor est notamment dû à l’apparition de solutions commerciales performantes de suppression permettant la neutralisation de la phase mobile et l’élimination des contre-ions avant la détection. Par conséquent, un développement de phases stationnaires contenant des échangeurs forts et un couplage à la spectrométrie de masse ont été rendus possible. Tout d’abord utilisée pour des analyses de petits anions inorganiques dans les eaux, les applications de la chromatographie ionique se sont ensuite étendues à des matrices plus complexes.
La métabolomique est basée sur l’identification et la quantification de métabolites permettant d’acquérir des connaissances supplémentaires sur le métabolisme. Elle conduit également à la compréhension de l’effet de contraintes externes sur le métabolisme et l’identification de nouveaux biomarqueurs de maladies afin d’en faciliter le diagnostic. L’analyse de métabolites est complexe, notamment en raison d’une grande diversité de structures moléculaires, de propriétés physico chimiques et de concentrations au sein d’un échantillon. Ces différences de propriétés physico-chimiques et plus particulièrement la polarité et l’état d’ionisation induisent l’obligation d’utiliser plusieurs méthodes chromatographiques orthogonales pour la séparation des métabolites. La chromatographie ionique, par sa spécificité vis-à-vis des composés ionisés et/ou ionisables peut jouer un rôle important dans ce type d’étude.
LES VOLUMES ET VARIANCES
Le volume mort et la variance totale
Le volume mort VM qui est défini comme le volume de phase mobile (PM) contenu dans le système chromatographique équipé d’une colonne entre la vanne d’injection et le détecteur peut être calculé selon l’Équation 1.
Équation 1 ?M = ?M × ?
Avec ?M le temps mort en min et d le débit en mL/min .
Les volumes et variances extra-colonne
Les volumes extra-colonne peuvent être calculés selon le même principe que les volumes morts mais pour un système sans colonne. Ces volumes participent à l’élargissement des pics et dépendent du système chromatographique utilisé. Afin de déterminer la contribution des volumes extra-colonne à la perte d’efficacité, il est important de déterminer la variance extracolonne σ²e-c pour chaque système chromatographique utilisé [1]. Pour cela, la colonne est remplacée par un raccord union sans volume mort et le chlorure de sodium est injecté.
La variance extra-colonne représente la somme des variances de l’injecteur, du détecteur et des tubulures. La variance de l’injecteur dépend du volume injecté et du mode d’injection. L’augmentation du volume d’injection Vinj entraîne un gain en sensibilité mais une perte d’efficacité et donc de résolution. En revanche, pour des composés très retenus, l’effet des volumes extra-colonne est diminué ; il est donc possible d’augmenter le volume injecté sans subir trop de perte d’efficacité selon la rétention des composés. La variance extra-colonne liée au détecteur dépendent de la constante de temps ? choisie et du volume de sa cellule Vcell et de sa géométrie. La constante de temps est un paramètre électronique du détecteur et sa valeur contribue au carré à l’élargissement des pics . Ainsi, si sa valeur est élevée, les pics seront plus larges. Sa valeur doit donc être réduite au maximum sans générer un bruit de fond trop important. Les effets des tubulures sont également très importants en chromatographie. Les volumes morts au niveau des connections doivent être minimisés pour optimiser l’efficacité du système. Aussi, la longueur lt mais surtout le diamètre des tubulures qui contribuent au carré à la variance extra colonne doivent être réduits au maximum entre la vanne d’injection et l’entrée de la colonne et celui reliant la sortie de la colonne au détecteur.
Le volume de délai
Ces travaux se partageant sur différents systèmes chromatographiques, un autre paramètre doit être rappelé : le volume de délai [2]. Ce volume est calculé à partir du temps de délai entre le gradient programmé et le gradient effectif après les pompes et/ou la chambre de mélange . En effet, le volume de délai étant dépendant d’un système, lors d’une transposition de méthode d’un système à un autre un retard d’établissement du gradient non désiré peut se créer dans la colonne. Ce phénomène peut provoquer d’importants changements de rétention et/ou de sélectivité. Ce délai se mesure sur un système sans colonne en imposant un gradient où la concentration en NaOH augmente rapidement. L’augmentation en NaOH, sans courant de suppression, entraîne l’augmentation du signal de la ligne de base en fonction du temps. Le temps de rétention de la rupture de pente de la ligne de base multiplié par le débit correspond au volume de délai. La transposition d’une méthode sur un système doit se faire pour un rapport temps de délai sur temps mort constant .
LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE
Le terme « chromatographie ionique » a longtemps été utilisée au sens large et désignait toutes les techniques reposant sur les interactions ioniques. De nos jours, la chromatographie ionique désigne communément la chromatographie d’échange d’ions. C’est dans ce sens que ce terme sera employé au cours de ces travaux. Les échantillons analysés dans ces travaux étant chargés négativement, c’est exclusivement la chromatographie d’échange anionique qui sera détaillée ci-dessous.
PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE
La séparation résulte donc de l’affinité des ions et de la PM pour la PS. Plus un ion a d’affinité pour la PS, plus le temps de rétention est important. En chromatographie ionique cette affinité dépend, dans l’ordre de :
– La densité de charge de l’ion solvaté : Lorsque le soluté s’ionise dans la PM aqueuse, des interactions ion-dipôle conduisent à la formation d’une nouvelle structure. Plus l’ion est de petite taille, plus l’hydratation sera importante. La densité de charge et la rétention seront donc plus faibles. De manière générale, plus la valence d’un ion est importante, plus l’ion sera retenu.
– La polarisabilité : relate la capacité d’un ion à se déformer sous l’influence d’un champ électrique. Plus un ion aura un rayon ionique important, plus il sera polarisable et plus il sera retenu.
En réalité, si l’échange d’ions est l’interaction principale qui intervient dans la rétention en chromatographie ionique, ce n’est pas la seule : des interactions non ioniques interviennent également. Les interactions non ioniques les plus importantes peuvent être attribuées à des liaisons de type Van der Waals (interactions dipolaires), ?-? ou anions- ? et des interactions hydrophobes. En chromatographie ionique les interactions secondaires sont difficiles à identifier clairement et à estimer.
LES PHASES STATIONNAIRES
Les phases stationnaires étudiées dans ces travaux étant exclusivement des phases stationnaires comportant des échangeurs forts d’anions et compatibles avec une PM hydroxyde, ce sont principalement ces technologies qui seront décrites ici. En chromatographie ionique, les phases stationnaires sont composées deux parties : le substrat et le groupement échangeur. Ces derniers sont principalement des groupements ammoniums quaternaires en chromatographie d’échange d’anions.
Les caractéristiques des phases stationnaires
Les colonnes sont généralement caractérisées par leur capacité d’échange d’ions, c’est-à-dire leur nombre de site échangeurs d’ions par gramme de résine (en meq/g) ou pour tout le volume de colonne (en meq/col). Les colonnes de chromatographie ionique se différencient également selon le substrat utilisé, le groupement fonctionnel et le type de greffage. L’influence des caractéristiques des PS utilisées pour les colonnes (taille, distribution de la taille, porosité…) sur les grandeurs chromatographiques en IC suit les mêmes principes qu’en HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance)[7] . La tendance actuelle pour les phases stationnaires de chromatographie liquide consiste à diminuer le diamètre de particules pour obtenir des colonnes plus efficaces et des séparations plus rapides. Seulement la diminution du diamètre des particules entraine également une augmentation de la pression et un compromis doit être fait lors du choix de la PS. En chromatographie ionique, les particules sont généralement de tailles plus importantes que les particules de silice utilisées en HPLC. Les plus petites particules sont actuellement de 4 µm en IC ce qui fait des colonnes IC des colonnes moins efficaces que les colonnes d’HPLC. De nos jours, une grande attention est portée sur la distribution en tailles de particules car une distribution trop large conduit à une perte d’efficacité et des performances chromatographiques [8]. Ce phénomène est d’autant plus important que les particules sont fines. La porosité d’une colonne comprend le volume entre les particules de PS et le volume des pores des particules. Une forte porosité permet d’augmenter la surface d’échange mais également de diminuer la pression induite par la colonne. En revanche, la diffusion des solutés dans les interstices induit un élargissement des pics et donc une perte d’efficacité. Au début de la chromatographie ionique, afin de limiter le signal de la PM en l’absence du suppresseur, des électrolytes faibles étaient utilisés avec des colonnes de faibles capacités. Avec l’apparition du suppresseur, l’utilisation de colonnes de plus forte capacité a été rendu plus aisée. De nos jours, la recherche tend vers des colonnes avec des capacités de plus en plus élevées et donc de plus en plus rétentives. Cela a mené à la synthèse des phases stationnaires échangeuses d’anions que l’on connait actuellement et qui sont décrites ci-dessous.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I – GENERALITES
I.1. RAPPEL SUR DES GRANDEURS CHROMATOGRAPHIQUES
I.1.1 LES VOLUMES ET VARIANCES
I.1.1.1 Le volume mort et la variance totale
I.1.1.1 Le volume et la variance de la colonne
I.1.1.2 Les volumes et variances extra-colonne
I.1.1.3 Le volume de délai
I.1.2 LE FACTEUR DE RETENTION K
I.1.3 LE FACTEUR D’ASYMETRIE AS
I.1.4 LA SELECTIVITE ?
I.1.5 L’EFFICACITE N
I.1.6 LA RESOLUTION R
I.2. LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE
I.2.1 PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE
I.2.2 LES PHASES STATIONNAIRES
I.2.2.1 Les caractéristiques des phases stationnaires
I.2.2.2 Les substrats
I.2.2.3 La dérivation chimique
I.2.2.4 Les résines greffées
I.2.2.5 La modification de la surface du substrat
I.2.2.6 Les résines hyper-ramifiées
I.2.2.7 Les résines pelliculaires
I.2.3 L’APPAREILLAGE
I.2.3.1 La détection conductimétrique
I.2.3.2 Le suppresseur
I.2.3.3 Le générateur d’éluant
I.3. LE COUPLAGE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE (IC-MS)
I.3.1 LA SOURCE D’IONISATION
I.3.2 LES ANALYSEURS
I.3.2.1 L’analyseur simple quadripôle
I.3.2.2 L’analyseur triple quadripôle
I.4. LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE AU FORMAT CAPILLAIRE
I.4.1.1 Les tubulures
I.4.1.2 Le suppresseur
I.4.1.3 Les colonnes
I.4.1.4 Les autres modules
CONCLUSION
CHAPITRE II – CARACTERISATION DE PHASES STATIONNAIRES
ARTICLE I – COMPARISON OF RETENTION MECHANISMS OF DIFFERENT COMMERCIALIZED COLUMNS AND INFLUENCE OF THE FORMAT
CONCLUSION
CHAPITRE III – L’ANALYSE DE METABOLITES PAR CHROMATOGRAPHIE IONIQUE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE
III.1. ÉTAT DE L’ART
III.1.1 LA PLACE DE LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE DANS LA METABOLOMIQUE
III.1.1.1 L’analyse de métabolites par GC-MS
III.1.1.2 L’analyse de métabolites par SFC-MS
III.1.1.3 L’analyse de métabolites par électrophorèse capillaire (CE)
III.1.1.4 L’analyse de métabolites par chromatographie liquide (HPLC)
III.1.2 LE COUPLAGE DE LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE
ARTICLE II – ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY COUPLED TO ELECTROSPRAY-MASS SPECTROMETRY: AN EFFICIENT TOOL FOR FOOD, ENVIRONMENT, AND BIOLOGICAL ANALYSIS
III.1.3 LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE POUR L’ANALYSE DE FLUIDES BIOLOGIQUES
III.2. LES METABOLITES PRIMAIRES ETUDIES
III.3. OPTIMISATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE IC-MS
III.3.1 OPTIMISATION DE LA METHODE IC-MS SUR UN COUPLAGE AVEC UN ANALYSEUR TRIPLE QUADRIPOLE
III.3.1.1 Choix de la phase stationnaire
III.3.1.1 Le couplage IC-MS
III.3.1.1 Étude de l’influence du pH sur la détection
III.3.2 OPTIMISATION DE LA METHODE IC-MS SUR UN COUPLAGE AVEC UN ANALYSEUR SIMPLE QUADRIPOLE
III.3.2.1 Optimisation du gradient d’élution
III.3.2.1 Suppresseur
III.4. ÉTUDE DE LA MODIFICATION CHIMIQUE DES MEMBRANES DU SUPPRESSEUR
ARTICLE III – DEVELOPMENT OF AN ION CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY METHOD FOR SMALL ORGANIC ACIDS ANALYSIS, IMPORTANCE OF SUPPRESSOR ROLE
III.5. ÉTUDE REALISEE SUR DES FLUIDES BIOLOGIQUES
III.5.1 ESSAIS PRELIMINAIRES SUR DES ECHANTILLONS COLLECTES
III.5.1.1 Analyse des métabolites dans la salive
III.5.1.2 Analyse des métabolites dans l’urine
III.5.2 PERFORMANCES DE LA METHODE POUR L’ANALYSE DES METABOLITES DANS L’URINE
III.5.2.1 Étude de la linéarité
III.5.2.2 Étude de l’effet de matrice
III.5.2.3 Étude de la répétabilité
III.5.2.4 Estimation des limites de détection
III.5.2.5 Estimation des limites de quantification
III.6. TRANSPOSITION AU FORMAT CAPILLAIRE
III.6.1 STRATEGIE DE TRANSPOSITION DE LA METHODE
III.6.2 MODIFICATIONS DE L’APPAREILLAGE
III.6.3 ÉVALUATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE TRANSPOSEE
III.6.3.1 Étude de la linéarité
III.6.3.2 Étude de répétabilité
III.6.3.3 Estimation des limites de détection et de quantification
CONCLUSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
