La chromatographie en phase liquide des peptides et des protéines

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Modes d’administration

Les protéines thérapeutiques, contrairement aux petites molécules, ne sont pas actives après administration par voie orale 22-24. Cette perte d’activité est due aux enzymes gastriques et à la muqueuse gastro-intestinale, qui représente une barrière pour l’absorption des macromolécules solubles comme les peptides et les protéines. Les modes d’administration privilégiés pour ces molécules sont donc les injections intraveineuses, sous-cutanées, ou encore intramusculaires. Les injections en intraveineuse permettent d’éviter les dégradations et permettent d’atteindre de fortes concentrations dans l’organisme. Les injections en souscutané et en intramusculaire peuvent diminuer la biodisponibilité des protéines en raison du faible débit sanguin, de leur dégradation au niveau du site d’injection ou de leur diffusion dans les tissus, mais sont plus simples d’emploi. D’autres modes d’administration comme la voie intra-nasale ou l’inhalation sont également utilisés. Ces méthodes sont extrêmement faciles d’emploi et permettent de profiter de zones d’absorption fortement vascularisées de grande surface (environ 75 m² pour la méthode par inhalation). Comme toute méthode d’administration, elle présente également des inconvénients puisque des protéases sont également présentes dans la muqueuse pulmonaire, et certaines protéines peuvent avoir des effets indésirables sur les tissus des poumons 25;26. Enfin, des résultats encourageants ont été obtenus pour améliorer la biodisponibilité de protéines thérapeutiques administrées par voie orale. De nombreux obstacles sont inhérents à cette voie d’administration, comme par exemple la stabilité des composés dans la sphère gastro-intestinale, le temps de transit ou encore le taux d’absorption en fonction de la taille de la protéine et de la perméabilité des membranes 27. Pour contourner ces obstacles, des stratégies ont été développées pour augmenter l’absorption des protéines soit en affaiblissan temporairement la barrière intestinale, en utilisant des transporteurs qui créent un complexe avec la protéine28, ou encore en encapsulant les produits dans des micro- ou nano particules résistantes aux dégradations enzymatiques23.
Un autre problème, l’immunogénicité, tend à limiter l’action des protéines thérapeutiques : dans certains cas extrêmes, la réaction allergique peut aller jusqu’au choc anaphylactique qui met en jeu la vie du patient.

Immunogénicité des protéines thérapeutiques

L’immunogénicité d’une protéine est sa capacité à entraîner une réaction immunitaire. La formation d’anticorps dirigés contre les protéines thérapeutiques est fréquemment observée lors de traitements à administrations répétées, notamment s’il s’agit d’une protéine animale 29. Cette immunogénicité est recherchée dans le cas des vaccins, mais dans les autres cas, on cherche à l’éviter. La présence de ces anticorps peut modifier la biodisponibilité, la vitesse d’élimination et le profil pharmacocinétique de la protéine thérapeutique, en formant un complexe anticorps-protéine dont la durée de vie dans le plasma sera différente de celle de la protéine seule. Le mode d’administration de ces protéines recombinantes est connu pour influer sur l’immunogénicité, et les injections extravasculaires sont davantage susceptibles d’induire la production d’anticorps que les injections intraveineuses, certainement en raison de la formation d’agrégats ou de précipités dans la zone d’injection. Outre l’attention apportée aux glycosylations et autres modifications post-traductionnelles pour mimer au mieux les protéines endogènes, une autre approche pour réduire l’immunogénicité utilise une modification chimique en couplant la protéine au polyéthylène glycol (PEG) : c’est la « PEGylation »30;31. Ces polymères modifient la taille des protéines et engendrent une gêne stérique qui perturbe la reconnaissance par le système immunitaire.

Les immunodosages pour la bioanalyse des protéines

Les immunodosages regroupent l’ensemble des méthodes analytiques quantitatives mettant en jeu la réaction antigène-anticorps 32. Depuis la première description du dosage de l’insuline en 1959 par Rosalyn YALOW et Solomon BERSON 33, de nombreux développements sont intervenues, donnant un essor important à ces méthodes. Les progrès de l’immunologie ont permis, dans un premier temps, d’obtenir des anticorps polyclonaux de bonne qualité, dirigé aussi bien contre des petites molécules que contre des molécules de masse moléculaire élevée. Puis, en 1975, Köhler et Milstein 34 ont obtenu des anticorps monoclonaux, dont l’utilisation améliore notablement la spécificité et la sensibilité des techniques. Pour pouvoir suivre, à l’échelle macroscopique, ces associations antigène-anticorps, un troisième élément est utilisé : le traceur. Celui-ci résulte de la modification de l’anticorps ou de l’antigène par ajout d’un marqueur. Pendant longtemps, seuls les marqueurs radioactifs ont été utilisés, dont la qualité essentielle est liée à leurs propriétés d’émission non modifiées par l’environnement physicochimique, et à la sensibilité de la détection. Cependant, l’utilisation de la radioactivité présente un inconvénient majeur puisqu’elle est restreinte aux seuls laboratoires agréés pour la manipulation de radioéléments. Des développements méthodologiques importants ont permis de remplacer les éléments radioactifs par des enzymes. Ainsi, des dosages immunoenzymatiques (ELISA) ont été développés par Engvall et Perlmann en 1971 35. Aujourd’hui, les marqueurs enzymatiques et les marqueurs luminescents ont pris une réelle importance en pratique courante et ont supplanté les traceurs radioactifs, et d’autres approches ont été développées comme les marqueurs fluorescents ou encore l’amplification par PCR.

Antigènes, anticorps et traceurs

Les techniques immunologiques sont basées sur la formation de complexes antigènes-anticorps. Un antigène est une substance étrangère à l’organisme qui, lorsqu’elle est injectée, induit une réponse immunitaire. Les antigènes peuvent être des microorganismes ou des macromolécules. Pendant l’immunisation, les anticorps produits reconnaissent différentes parties structurales de l’antigène, ce qui permet à un antigène d’établir des interactions avec plusieurs anticorps. Ces zones de reconnaissance sur l’antigène sont nommées épitopes (Figure 6). Des molécules de plus petite taille peuvent être impliquées dans les interactions avec des anticorps. Cependant, ces composés sont incapables d’engendrer une réaction immunitaire lorsqu’ils sont injectés seuls. Pour y remédier et obtenir des anticorps, ces molécules sont liées à des macromolécules immunogéniques transportrices. Parmi ces haptènes, on retrouve des molécules naturelles et synthétiques comme les hormones, les toxines, les médicaments et les pesticides par exemple. Contrairement aux macromolécules antigéniques, les haptènes ne peuvent lier qu’un seul anticorps du fait de leur petite taille, ce qui implique que tous les formats de dosage ne leur sont pas applicables.
Le deuxième élément clé des immunodosages est l’anticorps. Celui-ci fait partie de la classe des immunoglobulines. Les anticorps sont des glycoprotéines exprimées à la surface des lymphocytes B. Les sites d’un anticorps qui réagissent avec un antigène ou un haptène sont appelés paratopes. La forme la plus simple d’un anticorps, représentée par la lettre Y, a deux paratopes spécifiques au même épitope. La purification d’anticorps a permis à Edelman 36 de proposer la première structure d’une immunoglobuline en 1975. La molécule d’anticorps est composée de deux chaînes lourdes identiques, liées entre elles par des ponts disulfures, et de deux chaînes légères

La réaction antigène anticorps

La réaction antigène anticorps est à la base de tous les imunodosages. Cette réaction peut être décrite schématiquement comme une interaction entre une protéine constituée par l’immunoglobuline et une autre molécule pouvant être de nature protéique ou non. A l’échelle atomique, des interactions de type hydrogène, hydrophobes, de Van der Walls, ou ioniques, entre les acides aminés des anticorps et de l’antigène sont mises en jeu. L’énergie de ces liaisons varie entre 4 et 30 kJ/mol: elle est du même ordre de grandeur que l’énergie d’agitation thermique à 37°C (3.9 kJ/mol). Ceci explique la réversibilité de ces liaisons. Le complexe sera stable si le nombre de liaisons qui interviennent est suffisant. A l’échelle macroscopique, ces interactions peuvent être décrites simplement par la loi d’action des masses : Ag Ac k   Ag + Ac   où Ag représente l’antigène, Ac l’anticorps et Ag-Ac le complexe antigène-anticorps formé.
La constante de dissociation est définie par [ ][  [Ag Ac] Ac Ag kk K D =   , où les crochets désigne les concentrations des espèces. Cette constante physico-chimique ne dépend que des molécules en présence, du milieu dans lequel a lieu la réaction, et de la température. Cette grandeur reflète l’affinité (la force de l’interaction) de l’anticorps pour son antigène. Cette affinité sera d’autant meilleure que les interactions au niveau moléculaire seront nombreuses et que leur agencement spatial ser a le plus approprié pour assurer une parfaite complémentarité entre l’antigène et l’anticorps (modèle de la clé dans la serrure). Les facteurs essentiels qui influencent ces liaisons sont ceux que l’on retrouve de manière générale pour toutes les interactions entre protéines ou entre protéines et ligands. Citons en particulier une forte influence du pH, de la concentration ionique, et des solvants qui perturbent les sphères de solvatation et déstabilisent les liaisons hydrogènes.

Principe des immunodosages

Méthodes par compétition

Lorsque l’on met en présence un anticorps (Ac), son antigène (Ag) et ce même antigène marqué (Ag*), il peut se créer deux types de complexe selon que l’anticorps se fixe à l’antigène ou à l’antigène marqué : Ac-Ag et Ac-Ag*. Le principe de ce dosage réside donc dans la compétition entre les deux formes d’antigène. Pour rendre cette technique quantitative, la concentration en anticorps et en molécule marquée est maintenue fixe, et l’augmentation de la concentration en antigène entraîne l’augmentation de la concentration en complexe antigène-anticorps, au détriment de la formation du complexe antigène marqué- anticorps. Si l’on dispose d’une méthode permettant de séparer, sans modifier l’équilibre de la réaction, les composés libres des complexes antigènes-anticorps et antigènes marqués-anticorps, on peut déterminer, grâce au signal délivré par le marqueur, la concentration de l’antigène marqué dans sa forme libre et/ou dans sa forme complexée à l’anticorps. Suivant la nature du dosage, on peut être amené à ne pouvoir conserver que l’une des deux fractions (antigène libre ou antigène lié). En établissant une courbe d’étalonnage avec des concentrations connues d’antigène, on détermine la concentration en antigène pour une solution inconnue par comparaison au signal mesuré.
La valeur portée en ordonnée peut être soit l’intensité du signal (désintégration nucléaire, absorbance) correspondant à la molécule marquée libre (F*) ou liée à l’anticorps (B*), soit un ratio d’intensité (B*/F*, B*/B*0 où B*0 est le signal obtenu en absence d’antigène non marqué).
L’avantage essentiel du dosage par compétition est de pouvoir s’appliquer à n’importe quel type d’antigène, quelle que soit sa taille. C’est en particulier la seule technique permettant de doser les haptènes ne possédant qu’un seul épitope. Cependant, cette méthode nécessite un nombre de sites anticorps constant et identique entre chaque échantillon pour avoir une bonne précision, puisque c’est l’anticorps introduit en défaut qui génère la compétition entre les antigènes. Un deuxième élément limitant pour cette méthode à un seul site de liaison concerne les métabolites et les interférents qui sont susceptibles d’être liés à l’anticorps, et donc de générer un signal qui surestime la quantité d’antigène. Ce manque de spécificité est réduit dans les méthodes immunométriques à deux sites, comme par exemple les méthodes de type sandwich.

Méthodes sandwich

Contrairement aux méthodes par compétition, les méthodes de type sandwich utilisent un excès d’anticorps pour lier l’antigène, puis un second anticorps marqué vient se fixer également sur l’antigène pour révéler la liaison entre le premier anticorps et l’antigène. Le premier anticorps peut être par exemple fixé à un support solide (par liaison covalente ou par simple adsorption), et la quantité doit être telle que le nombre de sites de liaison soit supérieur au nombre de molécules d’antigènes présentes dans les solutions étalons ou inconnues. L’antigène va ainsi se fixer sur les sites spécifiques. L’anticorps marqué est ajouté, soit simultanément, soit après une première incubation et un lavage, et se fixe sur l’antigène, préalablement fixé au premier anticorps. L’antigène se trouve ainsi pris en sandwich entre les deux anticorps. Un simple lavage permet de séparer les complexes anticorps-antigèneanticorps marqués des anticorps marqués libres en excès. Pour que l’anticorps marqué puisse se lier à l’antigène déjà engagé dans une réaction avec le premier anticorps, il est nécessaire que les deux anticorps réagissent contre des épitopes différents de l’antigène. On peut employer, à la fois comme anticorps liants et comme anticorps marqués, des anticorps polyclonaux multivalents, ou utiliser des anticorps monoclonaux spécifiques différents. De même que pour les dosages par compétition, les molécules marquées peuvent l’être par exemple par l’intermédiaire de la radioactivité ou par une enzyme. Dans les différents cas de marquage, le signal correspondant au complexe anticorps-antigène-anticorps marqué est un signal croissant en fonction de la quantité d’antigène, alors que pour un dosage par compétition, le signal correspondant au complexe est une fonction décroissante de la quantité d’antigène.
Les avantages des méthodes de type sandwich sont liés à l’utilisation de deux anticorps (monoclonaux si possibles) dont la spécificité de la reconnaissance pour deux sites différents de l’antigène assure la spécificité de la méthode. Pour fournir un « faux positif » correspondant à une autre molécule confondue avec l’antigène, cette molécule doit posséder les deux même épitopes. En choisissant bien les épitopes, les interférences avec d’autres molécules présentant une forte homologie peuvent être réduites. Cependant, ces interférences restent possibles. Dans un dosage par compétition, les antigènes et les antigènes marqués entrent en compétition pour un nombre limité de sites de fixation portés par les anticorps. La sensibilité maximale est obtenue lorsque la concentration de l’anticorps et de l’antigène marqué tend vers zero, alors que pour le format en sandwich, la sensibilité est maximale lorsque la concentration de ces réactifs tend vers l’infini 39. Pour cette dernière technique, les réactifs étant introduits en excès, ces conditions favorisent (sur le plan thermodynamique et cinétique) la formation du complexe et améliore la sensibilité 40. Bien que la méthode sandwich soit plus sensible, elle est cependant moins bien adaptée aux haptènes qui sont souvent trop petits pour pouvoir présenter deux épitopes et réagir avec deux anticorps à la fois, même si un dosage sandwich avec deux sites de fixation pour les anticorps a pu être obtenu avec des peptides comprenant seulement 8 acides aminés 40. Pour les peptides ne comportant que quelques acides aminés, un format de dosage proche du sandwich peut être utilisé. Il consiste à lier covalemment le peptide à l’anticorps après immobilisation (par le glutaraldehyde), puis à rompre la liaison anticorps-antigène pour libérer l’épitope. Le peptide lié au support solide est ensuite révélé par le même anticorps marqué 41.

La mesure de masse

Le spectre de masse est représenté sous forme d’un diagramme bidimensionnel : le rapport masse/charge est porté en abscisse et l’abondance des ions est portée en ordonnée. Notons ici que l’abondance indiquée est souvent relative, la hauteur des pics étant exprimée en pourcentage de celle du pic le plus intense (pic de base) trouvé dans le spectre de masse. Suivant la résolution de l’analyseur, la masse moléculaire mesurée par spectrométrie de masse peut correspondre à la masse moyenne ou aux masses précises des ions isotopiques

Les abondances isotopiques

Les isotopes sont des atomes qui ont le même nombre de protons mais diffèrent par leur nombre de neutrons. Cette différence entraîne une différence de masse atomique comme par exemple pour le 12C et 13C. Ces isotopes font apparaître des pics dans le spectre de masse sous forme d’amas isotopiques, caractéristiques de la composition élémentaire. L’abondance relative du 12C est de 98,9% et celle du 13C est de 1,1% (ces abondances peuvent varier suivant l’origine de la molécule), et comme le carbone est présent en grande quantité dans les molécules biologiques comme les protéines, la contribution du 13C est significative. Les autres isotopes (2H, 15N, 18O, …) modifient de la même manière la forme de l’amas isotopique. Plus il y a d’atomes dans une molécule, plus l’influence des isotopes est visible sur les spectres de masse. Plus le nombre de carbones est élevé, plus la contribution du carbone 13C est importante : la probabilité de ne trouver aucun 13C dans une molécule (pic monoisotopique) diminue (Figure 9). Le massif isotopique d’une espèce donnée va donc dépendre de sa composition élémentaire, et les abondances relatives observées des différents pics isotopiques peuvent être confirmées par simple calcul statistique des occurrences de ces isotopes. Enfin, l’écart entre chaque pic du massif isotopique est dû à la différence de masse des isotopes mais également à l’état de charge de la molécule. Par exemple, pour un peptide monochargé, l’écart m/z entre chaque isotope sera environ de 1 ; si ce peptide était dichargé, l’écart m/z serait environ de 0,5 et s’il était trichargé, l’écart m/z serait de 1/3.

Table des matières

Introduction générale et présentation de la thèse
Chapitre I : Introduction aux protéines et à leur quantification 
I.1. Structure et propriétés des protéines
I.1.1. Acides aminés, peptides et protéines
I.1.2. Rôle des peptides et protéines
I.1.3. Biomarqueurs
I.1.3.1. Définition et éléments de caractérisation
I.1.3.2. Validation des biomarqueurs protéiques
I.1.4. Protéines recombinantes
I.1.4.1. Systèmes d’expression pour la production des protéines thérapeutiques
I.1.4.2. Modes d’administration
I.1.4.3. Immunogénicité des protéines thérapeutiques
I.2. Les immunodosages pour la bioanalyse des protéines
I.2.1. Antigènes, anticorps et traceurs
I.2.2. La réaction antigène anticorps
I.2.3. Principe des immunodosages
I.2.3.1. Méthodes par compétition
I.2.3.2. Méthodes sandwich
I.2.4. Avantages et limitations des immunodosages
I.3. La spectrométrie de masse pour l’analyse des protéines
I.3.1. La mesure de masse
I.3.1.1. Les abondances isotopiques
I.3.1.2. Mesure de masse
I.3.2. Les sources d’ions par désorption-ionisation
I.3.2.1. Desorption-ionisation laser assisté par matrice (MALDI)
I.3.2.2. Les sources électrospray (ESI : ElectroSpray Ionisation)
I.3.3. Les analyseurs
I.3.3.1. Généralités et définitions
I.3.3.2. Les modes d’acquisitions en spectrométrie de masse
I.3.3.3. Les triples quadripôles
I.3.3.4. Les analyseurs à temps de vol (TOF)
I.3.3.5. L’Orbitrap
I.3.4. La quantification par LC-MS
I.3.4.1. La chromatographie en phase liquide des peptides et des protéines
I.3.4.2. La quantification des peptides et des protéines par LC/MS
Chapitre II : Evaluation d’un polypeptide thérapeutique 
II.1. Introduction
II.2. Développement d’un dosage par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
II.2.1. Introduction à la quantification des protéines intactes par LC-MS
II.2.1.1. Méthodes de quantification des protéines
II.2.1.2. Analyse de polypeptides par spectrométrie de masse
II.2.1.3. Standard interne
II.2.1.4. Effet matrice
II.2.1.5. Traitement d’échantillons
II.2.2. Approches développées au laboratoire
II.2.2.1. Immunodosage enzymatique
II.2.2.2. Quantification par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse
II.2.3. Développement d’une étape d’immunocapture pour améliorer la sensibilité du dosage de l’Epi-hNE4
II.2.3.1. Immunocapture : considérations théoriques
II.2.3.2. Stratégie analytique adoptée
II.2.4. Article : Dosage par immuno-spectrométrie de masse appliqué à l’Epi-hNE4, une protéine recombinante inhibiteur de l’élastase humaine
II.2.5. Conclusion
II.3. L’immunogénicité des protéines thérapeutiques
II.3.1. Réponse immunitaire
II.3.2. Effets des anticorps anti-protéines thérapeutiques
II.3.3. Evaluation des anticorps anti-protéines thérapeutiques
II.3.3.1. Tests de caractérisation de l’immunogénicité
II.3.3.2. Recommandations
II.3.3.3. Stratégie analytique
II.3.4. Article : Validation d’un test ELISA pour la mesure d’anticorps induits chez le singe dirigés contre Epi-hNE4, un inhibiteur de la neutrophile élastase humaine
II.3.5. Conclusion
Chapitre III : Quantification d’un anticorps thérapeutique par LC-MS 
III.1. Introduction
III.1.1. La quantification des macromolécules
III.1.1.1. Distribution d’états de charges et digestion enzymatique
III.1.1.2. Choix du standard interne
III.1.1.3. Préparation de l’échantillon
iiTable des matières
III.1.2. Les anticorps thérapeutiques
III.1.3. L’anticorps thérapeutique chimérique Cetuximab (Erbitux)
III.1.3.1. Le récepteur du facteur de croissance épidermique
III.1.3.2. Mode d’action de Cetuximab
III.1.3.3. Stratégie analytique
III.2. Article : Immunopurification et quantification de la forme active d’un anticorps thérapeutique chimérique dans le sérum humain par spectrométrie de masse
III.3. Résultats complémentaires
III.3.1. Obtention d’une séquence théorique de Cetuximab
III.3.2. Analyse peptidique de Cetuximab
III.3.2.1. Identification des peptides générés par digestion enzymatique
III.3.2.2. Identification des peptides situés dans les régions hypervariables
III.3.3. Standard interne pour la quantification
III.3.3.1. Choix du standard interne
III.3.3.2. Identification des peptides
III.3.3.3. Réduction, dénaturation et dérivation chimique
III.3.3.4. Adsorption non spécifique
III.4. Conclusions
Chapitre IV : Quantification d’une famille de biomarqueurs par LC-MS 
IV.1. Introduction
IV.1.1. Importance des biomarqueurs
IV.1.2. Spécificités analytiques des biomarqueurs protéiques
IV.1.3. Dosages de peptides endogènes par LC-MS
IV.2. Les apélines : une famille de peptides
IV.2.1. Le récepteur des apélines
IV.2.2. Identification des apélines
IV.2.3. Distribution et rôles physiologiques
IV.2.3.1. Formes endogènes
IV.2.3.2. Distribution des apélines
IV.2.3.3. Rôles physiologiques
IV.2.4. Dosages plasmatiques des apélines chez l’Homme
IV.3. Développements analytiques
IV.3.1. Quantification des apélines 12, 13, p13, 17 et 36
IV.3.1.1. Matériel et méthodes
IV.3.1.2. Résultats
IV.3.2. Stabilité des apélines en plasma
IV.3.2.1. Méthode
IV.3.2.2. Résultat
IV.4. Conclusions –
Conclusion Générale
Annexe
Références bibliographiques 

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