La capture de l’ADN chez les bactéries à Gram négatif

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Génome d’Helicobacter. pylori

Depuis sa découverte en 1984 de nombreuses souches de H. pylori ont été séquencées. Le chromosome bactérien, d’une taille approximative de 1.7 Mpb, affiche un pourcentage de G+C de 35 à 40%. Approximativement 90% du génome de la bactérie code pour des gènes. Les 10% restants correspondent à des séquences intergéniques, des ARN stables ou des séquences répétées non codantes. Le génome de la souche 26695 comporte 1627 gènes dont deux copies des gènes ARN 16S, 23S et 5S ainsi que plusieurs éléments mobiles (Alm et al., 1999). Environ 50% des souches de H. pylori isolées de patients possèdent un ou plusieurs plasmides cryptiques qui ne semblent coder ni pour des gènes de résistance ni pour des facteurs de virulence.

Infection et pathogenèse

Prévalence et mode d’infection

La prévalence de l’infection à H. pylori est inversement corrélée à la situation socio-économique de la population (Malaty et Graham, 1994). Ainsi 80% de la population de certains pays en développement est infectée par Helicobacter pylori contre moins de 40% dans les pays développés. Le mécanisme exact d’infection par lequel H. pylori est acquis demeure inconnu. Les hôtes naturels de H. pylori sont l’humain et certains primates non humains. Bien qu’il n’existe aucune preuve concluante de l’existence d’une transmission zoonotique, H. pylori a pu, dans de rares cas, être isolé chez des animaux de compagnie (Dore et al., 2001 ; Handt et al., 1994). Les nouvelles infections sont considérées comme étant le résultat d’une transmission interhumaine par voie orale ou fécale-orale. Il est généralement admis que l’acquisition survient pendant la petite enfance probablement via les membres proches de la famille.

L’infection par Helicobacter pylori

Après avoir pénétré dans un nouvel hôte, H. pylori va s’établir au niveau de la muqueuse gastrique. Installée dans la couche de mucus protectrice, la bactérie va sécréter de l’uréase afin de contrer l’acidité de l’estomac et ainsi créer un microenvironnement propice à son développement (Weeks et al., 2000). La colonisation par H. pylori entraine toujours une réponse du système immunitaire. Cette réponse se traduit notamment par une inflammation au niveau de la muqueuse gastrique cliniquement nommée gastrite aigue. Bien que H. pylori induise une gastrite chez tous les individus infectés, seule une minorité d’entre eux affiche les signes cliniques de cette colonisation. La réaction immunitaire n’est malheureusement pas suffisante pour éliminer toute trace de la bactérie. Ainsi toute personne infectée par H. pylori demeurera infectée à vie en absence de traitement. L’infection est alors persistante et la gastrite devient chronique (Graham et al, 2004).

Les pathologies causées par H. pylori

Une fois que la colonisation est devenue persistante, la pathologie peut évoluer avec le temps vers un ulcère (15% des cas) ou un cancer de l’estomac (1% des cas) (figure 3). L’évolution vers l’une de ces deux pathologies semble être déterminée par le niveau d’acide sécrété par l’individu infecté (Kusters et al., 2006).

Ulcère

Chez les sujets où la sécrétion d’acide est d’un niveau élevé à normal, H. pylori va être cantonné au niveau de l’antre gastrique où peu de cellules sécrétrices d’acide sont présentes. Dans ce cas, la pathologie aura tendance à évoluer vers un ulcère gastrique ou un ulcère du duodénum selon la zone où l’inflammation est la plus sévère. H. pylori est ainsi responsable de 85% des ulcères gastriques et 95% des ulcères duodénaux (Kusters et al., 2006).

Cancer de l’estomac

Chez les sujets où la sécrétion d’acide est diminuée, H. pylori va pouvoir envahir le corps gastrique et ainsi être en contact rapproché avec la muqueuse. L’inflammation chronique va causer une atrophie et une métaplasie de la muqueuse gastrique augmentant le risque d’adénocarcinome gastrique. Il est estimé que la colonisation par H. pylori augmente le risque de cancer de l’estomac d’un facteur 10. L’infection à H. pylori est également la première cause de développement du lymphome du MALT de l’estomac. Si le mécanisme à l’origine de la survenue du lymphome par la bactérie demeure inconnu, il est cependant démontré que l’éradication de H. pylori permet d’augmenter fortement le taux de rémission (Zullo et al., 2010). La bactérie est aujourd’hui classée comme un carcinogène de groupe 1 par l’organisation mondiale de la santé.

Autres pathologies

L’infection par H. pylori est également associée à d’autres pathologies extra gastriques telles que l’anémie ferriprive (Huang et al., 2010) ou le purpura thrombopénique idiopathique (Asashi et al,. 2008). A l’heure actuelle, le mode d’action par lequel la bactérie influerait sur l’évolution de ces pathologies demeure indéterminé. Cependant, il a été clairement démontré que l’éradication d’Helicobacter pylori chez les patients souffrant de ces pathologies menait à une amélioration significative de leur état. L’existence d’un lien de cause à effet entre la présence de H. pylori et la survenue d’autres pathologies (lymphomes autres que le lymphome du MALT, cancer colorectal, diabète, maladie de peau,…) a été proposée à de nombreuses reprises par différentes études sans qu’aucune preuve solide ne puisse pour le moment être apportée.

Diagnostic

De nombreuses techniques sont aujourd’hui disponibles pour détecter une infection par H. pylori. Dans la majorité des cas on préférera utiliser des tests non-invasifs comme le test respiratoire UreA qui détecte l’activité uréase de H. pylori ou un test antigène fécal qui recherche la présence d’antigènes de H. pylori à partir d’échantillons de fèces. Une sérologie pour détecter les Ig-G spécifiques de la bactérie peut également être réalisée mais cette dernière méthode ne permet pas de déterminer si l’infection est active. Les approches invasives telles que l’endoscopie sont employées pour obtenir du matériel biopsique tout en évaluant le degré de la pathologie. L’identification de H. pylori pourra être réalisée directement par coloration de l’échantillon de biopsie. La bactérie pourra par la suite être cultivée en laboratoire si des tests de résistance à certains antibiotiques doivent être réalisés. Les techniques de FISH et de PCR peuvent également être utilisées comme méthodes diagnostiques. Le FISH permet de détecter H. pylori par hybridation, directement sur l’échantillon de biopsie, d’une sonde d’ADN fluorescente spécifique d’une séquence d’ADN de la bactérie. La technique de PCR est réalisée sur des extraits d’ADN totaux issus d’échantillons de salive, fèces ou de biopsie. Bien que extrêmement sensible et spécifique, le diagnostic par PCR peut donner de faux positifs si des contaminations surviennent (pour revue, voir Testerman et Morris, 2014).

Traitement

Bien que H. pylori soit sensible à de nombreux antibiotiques in vitro, l’utilisation d’une monothérapie in vivo ne permet pas une éradication de la bactérie. La clarythromycine, qui est l’antibiotique le plus efficace sur H. pylori, n’offre ainsi qu’un taux d’éradication de 40% en monothérapie. Le manque d’efficacité de ces monothérapies est principalement dû à l’environnement composant la niche de la bactérie (faible pH, mucus). Les recommandations actuelles consistent donc en une trithérapie constituée de deux antibiotiques (AB) et d’un inhibiteur de pompe à protons (IPP). Selon les pays, cette trithérapie peut être modifiée en quadrithérapie par ajout du métal lourd bismuth. Le mode d’action exact de cette molécule n’étant pas encore clairement établi, elle demeure interdite d’utilisation dans certains pays. Après avoir été interdit à la fin des années 70, l’utilisation du bismuth est de nouveau autorisée en France depuis 2013. Le dernier type de traitement utilisé est une thérapie séquentielle composée d’une bithérapie (AB + IPP) pendant 5 jours suivi d’une trithérapie (IPP + 2AB) pendant 5 à 10 jours. Les molécules majoritairement utilisées dans toutes ces thérapies sont les tétracyclines, amoxicillines, imidazoles (métronidazoles) et certains macrolides (clarythromycine). L’application de ces différentes thérapies permet un taux d’éradication de 70 à 80%. Toutefois, le nombre de souches résistantes aux antibiotiques et notamment vis-à-vis de la clarythromycine et du métronidazole n’a cessé d’augmenter au cours de ces dernières années. Cette augmentation est probablement due à l’utilisation de ces antibiotiques dans le traitement d’autres pathologies, et à la haute variabilité génétique de la bactérie (Papastergiou, Georgopoulos and Karatapanis, 2014).

Variabilité génétique de H. pylori

Helicobacter pylori est une espèce bactérienne dont le génome est l’un des plus variables (Suerbaum et Josenhans, 2007 ; Go et al., 1996) (Tableau 1). Cette importante variabilité serait un moyen pour la bactérie de s’adapter spécifiquement à l’individu infecté ainsi qu’aux changements de son microenvironnement.

Principe de la transformation bactérienne

La transformation bactérienne est divisée en trois étapes que sont la capture, l’internalisation et l’intégration d’ADN exogène. Bien que les systèmes de capture de l’ADN soient globalement similaires entre les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif, la présence de deux membranes et d’un espace périplasmique impose l’existence de certaines différences. Ces systèmes sont présentés dans la figure 5. Chez les bactéries à Gram positif, l’ADNdb est capturé par un pilus constitué de l’assemblage ordonné de la protéine ComGC. Cet ADNdb est réceptionné par ComEA avant d’être dégradé par une nucléase (EndA chez S. pneumoniae) en ADN simple brin. Une fois l’ADNsb généré, il est internalisé dans le cytoplasme via le canal ComEC. Chez les bactéries à Gram négatif, la capture de l’ADN n’est pas un processus continu mais semble être un mécanisme à 2 étapes (Seitz et Blokesch, 2014 ; Stingl et al., 2010). Le pilus dédié à la transformation, qui est constitué de sous unités PilE, traverse la membrane externe via le pore de sécrétion PilQ. Dans un premier temps, le pilus va capturer et transporter l’ADN dans le périplasme au travers de pilQ. Une fois dans le périplasme, l’ADNdb est réceptionné par la protéine ComE où il est dégradé en ADNsb par une protéine inconnue chez les bactéries à Gram négatif. Ce n’est qu’une fois que l’ADNdb est dégradé en ADNsb que la bactérie va pouvoir procéder à la seconde étape qui consiste à transporter l’ADN dans le cytoplasme via le canal ComA. Dans le cytoplasme, l’ADN est processé de manière similaire que ce soit chez les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif. L’ADNsb est protégé d’une dégradation par la fixation des protéines Ssb puis DprA et par le recrutement consécutif de la protéine RecA. Cette dernière va polymériser le long de l’ADNsb et permettre l’intégration dans le génome de la bactérie par recombinaison homologue (Johnston et al., 2014) (figure 6A).
Certaines protéines supplémentaires sont nécessaires à la capture de l’ADN (ComGB, ComGA, PilG, PilF). ComFA est une translocase ATPase dépendante uniquement identifiée chez les bactéries du phylum des firmicutes et impliquée dans le passage de l’ADN dans le cytoplasme. PG : peptidoglycane. (Johnston et al., 2014)

La Transformation de plasmide

En règle générale, la machinerie d’internalisation ne fait pas le distinguo entre l’ADN chromosomique et l’ADN plasmidique. Le plasmide est capturé sous forme double brin et est transporté dans le cytoplasme en multiples fragments d’ADNsb. Les deux facteurs limitants du transfert de plasmides entre bactéries sont la reconstitution d’un plasmide entier et la présence dans la cellule receveuse d’une machinerie de réplication adaptée au dit plasmide (Lorenz et Wackernagel, 1994). Le processus d’établissement des plasmides dans les cellules bactériennes a été relativement peu étudié mais certains travaux ont tout de même été réalisés chez B. subtilis et S. pneumoniae. A l’heure actuelle nous disposons de trois modèles de reconstitution de plasmide. Dans le premier modèle, des multimères d’ADNsb seraient internalisés en configuration « head-to-tail ». Le brin complémentaire serait alors synthétisé par la machinerie de réplication de la bactérie et le plasmide serait re-circularisé par hybridation (Figure 6C). Dans un second modèle, il est proposé qu’un des deux brins du plasmide soit internalisé puis qu’à un moment la machinerie d’internalisation change de brin et fasse entrer le brin complémentaire. Les deux brins d’ADNsb s’hybrideraient et se re-circulariseraient pour reformer un plasmide entier (Kidane et al., 2012). Il est toutefois possible que les brins d’ADN internalisés soient trop courts pour pouvoir reconstituer une molécule entière. On suppose dans ce cas, que les fragments d’ADNsb recombinent entre eux afin de former une molécule partiellement hybridée de pleine taille, qui peut alors être répliquée (Figure 6D) (Kidane et al., 2009). Outre ces trois modèles, un plasmide peut être reconstitué par un processus nommé « facilitation ». La transformation par facilitation est un mécanisme qui permet à un plasmide simple brin possédant des séquences homologues avec le chromosome bactérien de s’hybrider sur ce dernier (Figure 6B). Pour ce faire, il est nécessaire que les séquences homologues soient situées aux extrémités de l’ADNsb de part et d’autre de la séquence manquante. Une fois hybridé, le brin envahissant va initier sa réplication en utilisant le chromosome bactérien comme matrice et ainsi combler son « gap ». Les brins envahissants ne sont pas intégrés et les molécules d’ADN chromosomiques et plasmidiques sont séparées tandis que le plasmide réplique le brin complémentaire manquant (Lopez et al., 1982).

La recombinaison homologue

La recombinaison homologue est un mécanisme permettant un échange entre deux molécules d’ADN homologues ou homéologues. Chez les bactéries, la recombinaison homologue possède deux fonctions. Elle permet l’intégration d’ADN exogène dans le génome et elle permet de réparer certaines lésions de l’ADN. Les dommages principalement réparés par ce mécanisme sont des cassures d’ADN simple-brin et des cassures d’ADN double-brin. Le mécanisme par lequel se produit la recombinaison homologue est toujours dépendant de la protéine RecA mais les médiateurs impliqués dans le recrutement de cette dernière varieront en fonction du type de substrat (Figure 7). Dans le cas d’une réparation de cassure simple-brin, le complexe RecFOR va venir se fixer à la jonction ADNsb/ADNdb et va permettre la polymérisation de RecA le long du filament d’ADNsb. Le nucléofilament formé, va alors pouvoir détecter les séquences homologues et initier l’échange de brins (Michel et al., 2007). Dans le cas d’une cassure double-brin, c’est le complexe AddAB (ou RecBCD selon l’espèce bactérienne) qui va se fixer aux extrémités de la cassure et va entamer une étape de dégradation de l’ADN. Après rencontre d’un site spécifique nommé Chi, la dégradation du brin 3’ va cesser produisant la création d’une extrémité 3’ sortante. RecA va se fixer et polymériser sur cette extrémité et initier la recombinaison avec la séquence homologue (Dillingham et Kowalczykowski, 2008). Il convient de noter que les sites Chi n’ont été identifiés que pour un petit nombre d’espèces bactériennes. Dans le cas de l’intégration d’une séquence d’ADN exogène lors de la transformation, le médiateur, qui va permettre le recrutement de RecA n’est pas AddAB ou RecFOR mais un autre médiateur nommé DprA (Mortier-Barrière et al., 2007). DprA est une protéine dimérique indispensable à la transformation bactérienne (Quevillon-Cheruel et al., 2012) . Bien que DprA soit conservée dans 84% des 317 génomes bactériens séquencés en juin 2006, toutes ces espèces ne sont pas compétentes ou du moins n’ont pas encore été démontrées comme telles (Mortier-Barrière et al., 2007). Mis à part son rôle dans le recrutement de RecA, DprA est également impliquée dans la protection de l’ADN et semble capable de stimuler l’activité des méthylases (Bergé et al., 2003 ; Dwivedi et al., 2013).

Limitation de la transformation par les mécanismes biologiques.

Bien que l’acquisition de nouveaux gènes offre un avantage indéniable d’un point de vu évolutif, cela comporte également certains risques. Une intégration incontrôlée de séquences d’ADN hétérologues pourrait notamment finir par menacer l’intégrité du génome bactérien. Pour diminuer ce risque, les bactéries disposent de certains outils qui permettent de limiter l’intégration de séquences hétérologues pour privilégier les séquences d’ADN provenant d’espèces bactériennes proches ou identiques. Ces mécanismes, qui ne sont pas toujours bien compris, varient en fonctions des espèces bactériennes.
– Le premier mécanisme limitant la transformation est la reconnaissance des séquences DUS (DNA Uptake Sequence). Ces séquences DUS sont des séquences nucléotidiques spécifiques dispersées le long du chromosome de certaines espèces bactériennes telles que Haemophilus influenza ou Neisseria gonorrhoeae et qui sont reconnues par des récepteurs situés à la surface de la bactérie (Voir chapitre III). Le seul récepteur à avoir été identifié à ce jour est la piline mineure ComP de N. gonorrhoeae (Cehovin et al., 2013). Ainsi,un ADN qui ne possède pas la séquence DUS correcte ne pourra être transformé par la bactérie. Bien que certaines séquences soient partagées par plus d’une espèce bactérienne, les DUS permettent en général de restreindre la transformation à des fragments d’ADN de la même espèce (Chen et Dubnau, 2004).
– Le second mécanisme qui permet de limiter la transformation naturelle est le système de restriction-modification (R/M). Les systèmes R/M sont composés de deux enzymes. La première est une enzyme de restriction qui va cliver de petites séquences nucléotidiques spécifiques situées sur des ADNdb non méthylés. La deuxième est une méthylase qui va méthyler l’ADN double brins chromosomique afin de protéger ce dernier de l’action de l’enzyme de restriction. Ces systèmes sont présents dans 90% des génomes bactériens séquencés et ont été historiquement décrits comme un moyen pour la bactérie de se protéger contre les bactériophages par destruction de l’ADN infectieux (Roberts et al, 2009). Il est aujourd’hui admis que ces systèmes de R/M peuvent également limiter le transfert de séquences d’ADN hétérologues de façon plus ou moins importante en fonction des espèces bactériennes. Bien que certains modèles aient été proposés, le mode exact d’action de ces enzymes et l’étape à laquelle elles interviennent demeurent inconnus. (Johnston et al., 2013).

La transformation chez les bactéries à Gram positif

La transformation bactérienne chez les bactéries à Gram positif a principalement été étudiée chez S. pneumoniae et B. subtilis. Ces deux espèces partagent énormément de caractéristiques communes vis à vis de la transformation mais cependant certaines différences existent.

Le processus d’internalisation

Pour les deux espèces bactériennes, l’ADN capturé est séquence indépendante. Lors de la capture, l’ADN est fragmenté en des fragments d’ADNdb d’une taille approximative de 6kb pour S. pneumoniae et 13.5 à 18kb pour B. subtillis (Lorenz et Wackernagel, 1994 ; Dubnau, 1999). Une fois capturé, l’ADNdb est dégradé en ADNsb par une nucléase. Les produits de la dégradation sont relâchés dans le milieu extracellulaire sous forme de bases libres pour B. subtilis et d’oligonucléotides pour S. pneumoniae. Chez S. pneumoniae, l’ADNsb est transporté dans le cytoplasme selon une polarité 3’→5’ alors que le brin complémentaire est dégradé selon une polarité 5’→3’. Les vitesses de dégradation et de transport d’une molécule unique d’ADN ont été déterminées et apparaissent être similaires (90-100 nt/s à 31°C) (Mejean et Claverys, 1993). Cette similarité suggère un couplage entre le transport d’un brin et la dégradation de l’autre. Aucune polarité d’entrée n’a été déterminée pour B. subtilis mais la vitesse d’entrée de l’ADN a été estimée à 80nt/s à 37°C (Maier et al., 2004). La taille moyenne des fragments d’ADN intégrés chez B. subtilis est d’environ 8.5kb contre 6.3kb pour S pneumoniae (Lorenz et Wackernagel, 1994 ; Croucher et al., 2011).

La machinerie d’internalisation

La machinerie d’internalisation des bactéries à Gram positif (voir figure 5) a principalement été caractérisée chez B. subtilis avec quelques études complémentaires chez S. pneumoniae. Le pseudopilus dédié à la transformation est évolutivement associé à la famille des pili de type 4 et est majoritairement constitué des protéines ComGC mais également, en proportion plus restreinte, des protéines ComGD, ComGE et ComGG. Les pili de type IV sont majoritairement impliqués dans les interactions entre cellules bactériennes, l’adhésion aux cellules hôtes et la mobilité. Le pseudopilus serait capable de capturer l’ADN libre dans le milieu extracellulaire et de lui faire traverser le peptidoglycane. En dépit du manque de preuves expérimentales, on suppose que le passage de l’ADN s’effectuerait par la rétractation du pilus (Chen et Dubnau, 2004). La nucléase EndA, qui est associée à la dégradation de l’ADNdb en ADNsb, a uniquement été identifiée chez S. pneumoniae (Mejean et Clavery, 1993). De la même manière, la nucléase NucA qui est une endonucléase de surface impliquée dans le clivage de l’ADNdb a été identifiée chez B. subtilis mais pas chez S. pneumoniae (Provvedi et al., 2001). NucA serait impliquée dans la création d’une extrémité libre sur l’ADNdb afin de faciliter la prise en charge de l’ADN par la machinerie de translocation. Des études par microscopie à fluorescence suggèrent que la machinerie d’internalisation est localisée au milieu de la cellule chez S. pneumoniae et au pôle chez B. subtillis (Figure 8) (Bergé et al., 2013 ; Hahn et al., 2005).
Figure 8: Localisation de la capture d’ADN fluorescent chez S. pneumoniae et B. subtilis. A) L’ADN fluorescent en rouge localise principalement au milieu des cellules chez S. pneumoniae. (Bergé et al., 2013) B) L’ADN fluorescent en rouge localise principalement aux pôles des cellules chez B. subtilis. Le signal vert correspond à la fluorescence fournit par ComGA-GFP. (Hahn et al., 2005)

La régulation de l’entrée en compétence

S. pneumoniae et B. subtilis sont deux espèces bactériennes naturellement transformables mais pas constitutivement compétentes. En effet, B. subtilis devient compétente uniquement pendant sa phase stationnaire et S. pneumoniae uniquement durant sa phase exponentielle. Chez cette dernière, la compétence se développe de manière simultanée dans à peu près toutes les cellules bactériennes, dure 15 min puis disparait rapidement (Claverys et al., 2006). Chez B. subtilis la compétence se développe lentement et uniquement chez 10% à 20% des cellules de la culture (Maamar et Dubnau, 2005). L’entrée en compétence de ces deux bactéries est dépendante de l’activation du régulon de compétence comprenant les gènes nécessaires à la transformation (Figure 9). L’activation de ces régulons est, pour les deux bactéries, déclenchée par la sécrétion et la détection d’un peptide. Dans le cas de S. pneumoniae, c’est un petit peptide de compétence de 17 acides aminés appelé CSP (codé par ComC), pour « Competence Stimulating Peptide », qui est sécrété pendant la phase exponentielle. La fixation de ce peptide sur la protéine ComD va entraîner l’autophosphorylation de cette dernière et le transfert d’un phosphate à un régulateur partenaire nommé ComE. Ce dernier va alors activer l’expression de comX qui est le facteur sigma régulant l’expression des gènes de compétence chez S. pneumoniae. Chez B. subtilis le facteur de compétence est d’abord synthétisé sous une forme inactive de 55 acides aminés avant d’être clivé et secrété. Le peptide qui ne fait alors plus que 10 acides aminés va stimuler ComP qui va alors céder un phosphate à son partenaire ComA. ComA-P va activer la transcription de comS, ce qui va permettre l’accumulation de ComK, l’activateur transcriptionnel des gènes de compétence (Clavery et al., 2006).
Figure 9: Induction de la compétence chez S. pneumoniae et B. subtilis. Les gènes com comprennent les gènes impliqués dans l’internalisation et l’intégration de l’ADN exogène. En rouge : voies de signalisation entre cellules. En bleu : contrôle transcriptionnel En mauve : Contrôle post-transcriptionnel. (Claverys et al., 2006)

L’entrée en compétence chez S. pneumoniae : un quorum sensing?

Le quorum sensing (QS) est un phénomène biologique permettant une régulation synchronisée de l’expression de gènes particuliers au sein d’une population bactérienne en fonction de la densité de cette population. Ce phénomène repose sur la capacité des bactéries à communiquer entre elles via l’utilisation de molécules signal. Les systèmes d’induction de la transformation de S. pneumoniae et B. subtilis ont donc souvent été considérés dans la littérature comme un exemple de quorum sensing. (Waters et Bassler, 2005). Cet état de fait, vis-à-vis de S. pneumoniae, a cependant été remis en cause par Claverys et ses collègues dans une revue parue en 2006 (Claverys et al., 2006). En s’appuyant sur des résultats présentés dans cette revue, ils démontrent que chez S. pneumoniae l’induction de la compétence après un choc alcalin se produit toujours 40 à 45 min après inoculation et cela indépendamment de la densité de la population. Il semble de plus possible que le niveau de CSP dans le milieu extracellulaire ne soit pas uniquement le résultat de l’augmentation de la population bactérienne. En effet, on sait aujourd’hui que des blocages de la fourche de réplication induisent une augmentation du nombre de copies de l’opéron comCDE par cellule et donc une augmentation du niveau de CSP (Slager et al., 2014). Puisqu’une molécule qui ne s’accumule pas passivement ne peut être rapporteur d’une population cellulaire, cela signifie que CSP n’est pas toujours impliqué dans un phénomène de quorum sensing.

La régulation de la sortie de la compétence

Concernant la sortie de l’état de compétence, les connaissances sont assez limitées. Chez S. pneumoniae il a été démontré que la répression des gènes de compétence reposait sur des boucles de rétrocontrôles (figure 10). La première boucle de rétrocontrôle implique la protéine ComE. Lors de sa phosphorylation, ComE-P devient capable d’induire l’expression de l’opéron comCDE, comX et comW (Martin et al., 2013). L’augmentation de l’expression de ComE mène à une augmentation du rapport ComE/ComE-P. Hors, si ComE-P est capable d’agir comme activateur transcriptionnel vis-à-vis de comCDE, comX et comW, ComE non phosphorylé est capable de réprimer l’expression de ces mêmes gènes. La répression de l’expression de comX va logiquement mener à une répression de l’expression des gènes de compétence et une sortie de l’état de compétence. Il faut noter que l’augmentation de l’expression de comD pourrait également participer à l’augmentation du rapport ComE/ComP par déphosphorylation de ComE-P (Figure 10A). La seconde boucle de rétrocontrôle mise en évidence implique DprA (Mirouze et al., 2013). Cette protéine, qui est exprimée lors de la compétence, serait capable d’interagir avec ComE-P. Cette interaction mènerait à une inhibition de l’activité transcriptionnelle de ComE-P et donc à l’inhibition de l’expression des gènes de compétence. Le mode d’action exact par lequel DprA inhibe ComE-P n’est pas encore déterminé. (Figure 10B)

La transformation chez les bactéries à Gram négatif

A la différence des bactéries à Gram positif, où deux modèles d’étude dominent, la caractérisation du processus de transformation chez les bactéries à Gram négatif a été réalisée sur un grand nombre d’espèces bactériennes différentes. Les premières études ont initialement été centrées sur les bactéries du genre Haemophilus et Neisseria, mais par la suite, des groupes de recherches se sont attelés à l’étude des mécanismes de transformation d’autres espèces bactériennes telles que H. pylori, V. cholerae et dans une moindre mesure Legionella pneumophilia, Pseudomonas sutzuri et les bactéries du genre Acinobacter. Cette multiplicité des modèles a logiquement mené à l’acquisition de connaissances inégales en fonction de l’espèce bactérienne considérée et à l’impossibilité d’imposer un modèle en adéquation avec l’ensemble des bactéries à Gram négatif. Cela a cependant permis de mettre en évidence que même si le mécanisme de transformation est un processus commun à de nombreuses bactéries, chaque espèce possède ses propres spécificités.

La capture de l’ADN chez les bactéries à Gram négatif

A la différence d’Acinobacter, N. gonorrhoeae et H. influenza capturent préférentiellement l’ADN provenant d’espèces proches ou identiques. Cette sélection s’effectue par la reconnaissance de séquence DUS de 10 à 12 nucléotides (Elkins et al., 1991 ; Danner et al., 1980). Il a été démontré que chez H. influenza, le contenu en A+T encadrant la séquence DUS influence les chances de capture de la molécule d’ADN. Il apparait ainsi que des séquences d’ADN riche en A+T étaient capturées 48 fois plus qu’une séquence riche en G+C (Danner et al., 1982). Il semblerait toutefois que la capture de l’ADN puisse parfaitement être réalisée en absence de toutes séquences DUS chez N .gonorraheae (Duffin and Seifert, 2010). Ceci est également le cas pour H. influenza mais uniquement en conditions de pH acide (Goodgal et Mitchell, 1984). Chez N. gonorrhoeae, l’impact des séquences DUS sur la capture d’ADN n’est pas proportionnel à la fréquence de transformation. Il a donc été supposé que les séquences DUS puissent jouer un rôle secondaire mais pour l’instant inconnu, en aval de l’internalisation (Duffin and Seifert, 2010). Bien que Pseudomonas stutzeri ne possède pas de séquence DUS, il semble exister chez cette bactérie un mécanisme lui permettant de reconnaitre l’ADN étranger. Ainsi, même si la bactérie est capable de capturer l’ADN étranger et l’ADN de sa propre espèce, la fréquence de recombinaison avec de l’ADN hétérologue est bien plus faible que celle observée avec de l’ADN homologue (Carlson et al., 1983). A la différence des autres modèles bactériens, N. gonorrhoeae et P. stutzeri sont également capables de capturer et transformer de l’ADNsb. L’efficacité de transformation de ce substrat apparait toutefois diminuée d’un facteur 20 à 60 chez P. stutzeri (Meier et al., 2002)
– Le système de restriction/modification chez N. gonorrhoeae.
N. gonnorrhoeae possède un système de restriction modification particulièrement efficace sur les plasmides exogènes mais pas sur l’ADN chromosomique. Ceci s’expliquerait par le fait que l’ADN chromosomique est transporté sous forme simple brin alors que les plasmides sont reconstitués dans le cytoplasme sous forme double-brin. Le système R/M n’étant efficace que sur l’ADNdb il pourrait limiter la transformation par plasmide mais pas celle par un chromosome. L’ADNsb ne serait pas dégradé lors de la formation de l’hétéroduplex d’intégration grâce à la méthylation du brin résident (Hamilton et Dillard, 2006). Il faut noter que si ce modèle d’action peut fonctionner chez N. gonorrhoeae, cela n’est pas le cas pour les espèces bactériennes dont le système R/M est actif sur la transformation par de l’ADN chromosomique.

La machinerie d’internalisation des bactéries à Gram négatif

La machinerie de transformation des bactéries à Gram négatif et précédemment présentée dans la figure 5, a été principalement caractérisée chez N. gonorrheae. L’existence de cette machinerie chez les autres modèles bactériens a été extrapolée à partir de recherches de gènes homologues par analyse bio-informatique et d’expériences de génétique. Le complexe comprend un pseudo pilus qui, comme pour S. pneumoniae et B. subtilis, est évolutivement associé à la famille des pili de type IV. Ce filament est le résultat de la polymérisation de la protéine PilE par l’ATPase PilF. PilG joue également un rôle dans la biogénèse du pilus. Lors de sa polymérisation, le pilus s’étend vers la membrane externe jusqu’à traverser le pore formé par la sécrétine PilQ. Cette dernière protéine est évolutivement associée aux systèmes de sécrétion de type II. Il est proposé qu’une fois que l’ADN est fixé par le pilus de transformation, le pilus va être dépolymérisé par PilT afin de permettre l’entrée de l’ADN dans le périplasme. PilT est une autre ATPase impliquée dans la mobilité par rétractation de pili mais non nécessaire à la biogénèse du pseudopilus. Une dernière protéine, nommée PilC, semble être impliquée dans la stabilisation des pili (Chen et Dubnau, 2004). La protéine impliquée dans la dégradation de l’ADNdb en ADNsb n’a été identifiée chez aucune des bactéries à Gram négatif.

La régulation de la compétence chez N. gonorrhoeae

N. gonorrhoeae est une des espèces bactériennes connues pour être constitutivement compétentes. A l’heure actuelle aucun facteur ou stimuli exogène n’a été identifié comme à l’origine de cette compétence. L’ADN transformé par N. gonorrhoeae provient principalement de cellules sœurs autolysées mais peut dans certaines souches être le résultat de sécrétions d’ADN endogène par un système de sécrétion de type IV (Hamilton et al., 2005). Les mécanismes de régulation de ces phénomènes sont pour le moment inconnus.

La régulation de la compétence chez H. influenzae

H. influenzae est une bactérie qui devient compétente lors de son entrée en phase stationnaire ou lorsque les cellules sont transférées sur un milieu de culture pauvre en nutriments. Il a été démontré que l’addition d’AMP cyclique durant la phase exponentielle induisait l’entrée en compétence et que les protéines réceptrices d’AMP cyclique (CRP) étaient essentielles à l’entrée en compétence (Wise et al., 1973 ; Chandler, 1992). Le régulon impliqué dans l’entrée en compétence a été identifié en 2005 par Redfield et ses collègues (Redfield et al., 2005). Le régulon est composé de 13 unités transcriptionnelles possédant toutes une séquence régulatrice de 22pb nommée CRP-S (site de fixation pour CRP). Etonnamment, l’expression de ces gènes n’est pas seulement conditionnée par la fixation de CRP (protéine réceptrice d’AMPc) mais également par l’action de la protéine Sxy. Bien que le mode d’action exact par lequel l’AMPc, CRP et Sxy parviennent à réguler l’expression des gènes de compétence demeure inconnu, un modèle d’action a été proposé par le groupe de recherche de R. J. Redfield (Cameron et al., 2008). Dans ce modèle, l’AMPc et CRP sont nécessaires à l’induction du gène sxy par fixation de CRP sur la séquence promotrice de sxy. La transcrit de sxy possède d’ordinaire une structure secondaire en tige boucle. La présence de cette structure secondaire inhibe la traduction de l’ARNm de sxy et serait ainsi impliquée dans la régulation de l’expression de sxy. Redfield et ses collègues proposent qu’en conditions de famine, la transcription des ARNm s’effectue plus lentement en raison du manque de nucléotides. Ce ralentissement permettrait la fixation des ribosomes sur le l’ARNm avant que la structure en tige boucle ne puisse se former. Ainsi, en conditions défavorables, la traduction des ARNm de sxy serait plus élevée et le niveau de la protéine serait augmenté. Une autre hypothèse est que la régulation de l’expression de sxy soit réalisée par un phénomène de riboswitch impliquant cette structure en tige boucle. (Cameron et al., 2008).

La régulation de la compétence chez V. cholerae (figure 13)

Pendant de nombreuses années V. cholerae a été considérée comme une espèce bactérienne non compétente. Il a fallu attendre 2005 pour que Meibom et ses collègues démontrent que V. cholerae est capable de transformer de l’ADN lorsque de la chitine est présente dans le milieu de culture (Meibom et al., 2005). Il existe plusieurs mécanismes impliqués dans la régulation de l’entrée en compétence chez V. cholerae.

Un mécanisme Sxy like (figure 13 A)

Le premier est un mécanisme similaire au système de régulation de H. influenzae. Un récepteur nommé ChiS détecte la présence de chitine dans le milieu extracellulaire et induit l’expression de deux gènes. Le premier code pour un small RNA (sRNA) nommé TfoR. Le second code pour TfoX, une protéine similaire au régulateur de compétence Sxy de H. influenza et qui est nécessaire à l’induction de l’expression des gènes de compétence. L’ARNm de tfoX forme d’ordinaire des structures en tige boucles inhibant sa traduction. TfoR serait capable de s’hybrider avec la partie 5’UTR de l’ARNm de tfoX et d’induire le relâchement de ces tiges boucles pour permettre l’initiation de la traduction de tfoX (Yamamoto et al., 2011). En 2012 Lo Scrudato et Blokesch ont démontré que l’induction de la compétence était également dépendante de la quantité d’AMPc intracellulaire. Bien que la relation entre le niveau d’AMPc et TfoX ne soit pas connue, il est proposé que Tfox puisse agir conjointement avec des CRP comme cela est le cas pour Sxy de H. influenza.

Un mécanisme de quorum sensing (figure 13B)

Le quorum sensing (QS) régule un certain nombre de mécanismes biologiques chez V. cholerae. Il permet notamment d’inhiber la production de facteurs de virulence et la fabrication de biofilms lorsque la densité cellulaire devient élevée (Zhu et al., 2002 ; Hammer et Bassler., 2003). En 2005, Meibom et ses collègues démontrent que la régulation de l’expression de HapR, qui est le régulateur principal du quorum sensing chez V. cholerae, permet de moduler l’efficacité de transformation. Il apparait également que la fréquence de transformation est augmentée en cas de croissance prolongée. On peut dès lors supposer qu’il existe un lien entre régulation de la compétence et quorum sensing. En 2008, Blokesch et Schoolnik constatent que HapR induit l’inhibition de l’expression de la nucléase extracellulaire dns (Blokesch et Schoolnick, 2008). Selon eux, la répression de l’expression de dns permettrait de diminuer la dégradation de l’ADN extracellulaire potentiellement transformable. Cette inhibition semble d’autant plus importante lorsque l’on sait que V. cholerae est capable de transformer des fragments d’ADN allant jusqu’à 42kb (Blokesch et schoolnik, 2007). Il a également été constaté que HapR induisait l’expression de certains gènes de compétence tel que comEA et que son absence inhibait l’entrée en compétence (Antonova et Hammer, 2011). Une étude réalisée en 2012 a prouvé que la majorité des gènes induits par le QS étaient différents de ceux induits par la voie TfoX, soulignant ainsi une collaboration entre les deux voies vis-à-vis de l’induction de la compétence (Lo Scrudato et Blokesch, 2012). Le mécanisme de quorum sensing repose sur la sécrétion et la détection de molécules de signalisation. A ce jour deux molécules ont été identifiées comme jouant un rôle d’auto-inducteur similaire aux peptides CSP de S. pneumoniae et ComX de B. subtilis. La première est nommée CAI-1 (Cholera AutoInducer 1) et est l’inducteur majoritaire de la compétence intra-espèces chez V. cholerae. La seconde molécule, qui est nommé AI-2 (autoinducer 2), est considérée comme un inducteur universel du fait de sa production par de nombreuses espèces bactériennes (Suckow et al., 2011 ; Antonova et Hammer, 2011). Bien que possédant un faible pouvoir inducteur, AI-2 pourrait néanmoins jouer un rôle dans le transfert de gènes. En effet, AI-2 pourrait être sécrétée par d’autres espèces n’appartenant pas au genre vibrio et stimuler l’entrée en compétence de V. cholerae.

Un mécanisme de fratricide

Il a été démontré que lors de son entrée en compétence V. cholerae induisait l’expression d’un système de sécrétion de type VI (T6SS). Ce T6SS va permettre, via l’injection de toxines intracellulaires, de lyser les cellules voisines sensibles et ainsi augmenter la quantité de matériel génétique utilisable pour la transformation (Borgeaud et al., 2015). Ce mécanisme est très semblable au mécanisme de fratricide observé chez S. pneumoniae.

La régulation de la compétence chez le genre Pseudomonas

Pour les bactéries du genre Pseudomonas, l’induction de la compétence se produit lors de l’entrée en phase stationnaire ou lors de la croissance sur milieux limités en carbone, azote et phosphore (Lorenz et Wackernagel, 1990 ; Lorenz et Wackernagel, 1991). P. stutzeri possède une machinerie d’internalisation similaire aux autres bactéries à grams négatifs. Toutefois, des études ont mis en évidence que P. stutzeri co-transcrivait une piline secondaire en plus de sa piline principal. Cette piline secondaire, nommé PilA2, possède 55% d’identité avec pilA1 qui est la piline majeur. Alors que d’ordinaire la délétion des pilines secondaires induit une diminution de la fréquence de transformation chez les bactéries compétentes, la délétion de pilA2 produit étonnamment un phénotype hypertransformable sans pour autant modifier la quantité d’ADN capturé (Graupner et Wackernagel, 2001). Il a donc été proposé que PilA2 soit un facteur antagoniste vis-à-vis de la transformation et que la modulation de son niveau d’expression définisse le degré de transformation de la bactérie.

La machinerie d’internalisation de H. pylori

Une des principales spécificités de H. pylori est sa machinerie d’internalisation. Alors que les autres bactéries compétentes utilisent un pilus de type IV ou un système de sécrétion de type II, H. pylori requiert un système de sécrétion de type IV.

Les systèmes de sécrétion de type IV

Les systèmes de sécrétions de type IV sont ordinairement utilisés pour transloquer des macromolécules bactériennes dans le milieu extracellulaire ou dans d’autres cellules. Cela peut être des protéines injectées dans des cellules de mammifère ou des plasmides transférés lors de la conjugaison. Le système de sécrétion de type IV de référence est le système Vir utilisé par Agrobacterium tumefaciens (figure 14). A. tumefaciens est une bactérie à Gram négatif infectant les plantes et qui est responsable de la maladie nommée « galle du collet ».
La survenue de cette maladie est dépendante de l’injection d’un plasmide Ti (pour Tumor Inducing) dans la cellule végétale. Une fois injecté, une partie du plasmide va s’intégrer dans le génome de la bactérie. Cette intégration dans le génome de la plante va provoquer une multiplication anarchique des cellules et la formation de nodules racinaires caractéristiques de la maladie. Le système de sécrétion Vir est le produit de l’assemblement des protéines VirB1-VirB11 (virB operon) et du récepteur VirD. Le tout forme un canal au travers des enveloppes cellulaires permettant la sécrétion de macromolécules (Lai et Kado, 2000).

Le système de sécrétion de type IV de H. pylori

En 1998, Hofreuter et ses collègues parviennent à identifier deux gènes impliqués dans la transformation bactérienne. Ces deux gènes, nommé comB2 et comB3, codent pour des protéines ayant une forte homologie avec les protéines VirB composant les systèmes de sécrétion de type IV (Hofreuter et al., 1998). Dans les années qui suivent, le laboratoire de Rainer Haas va caractériser ce nouveau système de sécrétion de type IV et démontrer son implication dans la capture de l’ADN lors de la transformation (Hofreuter et al., 2001 ; Karnholz et al., 2006). Aujourd’hui on sait que le système de sécrétion de type IV est codé par deux opérons. Le premier opéron code pour 3 protéines ComB2 à ComB4 tandis que le second code pour 5 protéines ComB6 à ComB10. Des études d’homologie de séquences ainsi que l’analyse topologique de ComB6 ont permis de prédire la structure du complexe ComB (Karnholz et al., 2006). Ce dernier permettrait, comme pour le T4SS d’A. tumefacians, de former un canal traversant les membranes cellulaires (Figure 15). Ainsi ComB2, B4 et B6, qui sont des protéines indispensables à la transformation, seraient respectivement situées à la surface de la membrane externe, associées à la membrane interne et intégrées dans la membrane interne. ComB2 aurait pour rôle de faciliter la capture de l’ADN, tandis que ComB4 est une ATPase probablement impliquée dans la biogénèse du complexe ComB ou dans la translocation de l’ADN exogène. L’absence de ComB6 induirait une déstabilisation complète du complexe T4SS. ComB7 n’est pas essentielle à la transformation mais semble plutôt posséder un effet modulateur par stabilisation du complexe ComB. Des études bio-informatiques et des expériences de génétique ont permis d’identifier l’homologue de ComEC chez H. pylori et de valider son rôle dans la transformation (Yeh et al., 2003, Stingl et al., 2010). Il convient toutefois de noter que la protéine ComEC de H. pylori est beaucoup plus petite et seulement lointainement apparentée aux autres protéines ComEC. En effet, ComEC de H. pylori est constituée de 437 acides aminés contre 746 pour ComEC de S. pneumoniae (Johnston et Claverys, 2014).

Le mécanisme d’internalisation et d’intégration (figure 16)

Le modèle d’internalisation de l’ADN exogène chez H. pylori repose principalement sur nos connaissances du processus de transformation des autres espèces bactériennes ainsi que nos connaissances du T4SS. Bien que de nombreux acteurs doivent encore être identifiés, une étude réalisée par Stingl et ses collègues en 2010 a permis de proposer un processus en deux étapes (Stingl et al., 2010). Dans ce dernier, H. pylori capture l’ADNdb exogène sans distinction de séquences. Une fois capturé, l’ADNdb est transporté dans la périplasme où il serait dégradé en ADNsb. Les protéines impliquées dans la capture de l’ADNdb ainsi que dans sa dégradation restent à identifier. Une fois sous forme simple-brin, l’ADN est transporté dans le cytoplasme par le pore ComEC. L’énergie nécessaire à cette translocation est fournie par une ATPase également inconnue. Une fois dans le cytoplasme, il est postulé que l’ADN est protégé des nucléases par la polymérisation de protéines le long du brin. Alors que chez certaines bactéries, il existe une protéine SsbB dédiée exclusivement à la protection de l’ADN exogène et une protéine SsbA dédiée exclusivement à la protection de l’ADN lors de la réplication, H. pylori ne possède qu’une seule et unique SSB. DprA va par la suite venir se fixer sur le brin d’ADN pour permettre la formation de nucleofilament de RecA et l’intégration du brin d’ADN transformant dans le chromosome bactérien par recombinaison homologue (Ando et al., 1999).

Intégration de l’ADN transformant

En fonction des souches étudiées et de l’origine du substrat d’ADN utilisé, la taille moyenne des séquences d’ADN acquises par transformation chez H. pylori varie entre 420 et 4300pb (Humbert et al., 2011 ; Aras et al., 2002) . Cela est bien petit comparé à des bactéries comme B. subtilis et S pneumoniae qui acquièrent en moyenne des fragments de 8.5kb et 6.3kb. Lors de la caractérisation des mécanismes d’intégration de H. pylori, deux groupes de recherche ont remarqué que, dans 10% des recombinants, le fragment importé du donneur était interrompu par de petites séquences d’ADN du receveur. Ces petites séquences, de tailles variables, ont été nommées séquence ISR (Interspersed Sequences of the Recipient) (Lin et al., 2009 ; Kulick et al., 2008). La présence de gaps d’intégration a déjà été observée chez S. pneumoniae et a été attribuée à des mécanismes de réparation de mismatch ou d’excision de base à la suite de l’invasion du brin donneur dans le chromosome (Guerrini et Fox, 1968). Lin et ses collègues soulignent que puisque H. pylori ne possède pas de système de mismatch repair fonctionnel cette explication est peu probable. Ils suggèrent plutôt que les gaps sont le résultat de multiples événements d’invasions de brins. Bien que Kulick et ses collègues aient démontré que le niveau d’expression de la glycosylase mutY influe sur la fréquence des ISR, il apparait que MutY n’est pas indispensable à leur formation. Il semble donc exister de multiples mécanismes générateurs d’ISR à l’origine de ces intégrations en mosaïque.

Les nucléases impliquées dans la transformation chez H. pylori : impact de la protéine NucT

Que ce soit EndA de S. pneumoniae ou NucA de B. subtilis, ou encore Dns de V. cholerae, les nucléases jouent un rôle important dans la transformation bactérienne. Chez H. pylori, la seule nucléase à avoir été décrite comme jouant un rôle dans la transformation est la protéine périplasmique NucT. Cette protéine a été identifiée en 2004 par O’Rourke et ses collègues comme étant la protéine responsable de la majorité de l’activité nucléase chez H. pylori (O’rourke et al., 2004). Ils ont déterminé que la protéine était associée aux membranes plasmiques et que sa délétion induisait une diminution de la fréquence de transformation d’un facteur 10 à 100. Ils ont également réalisé une caractérisation biochimique sommaire de la protéine et ont ainsi déterminé que c’était une endonucléase thermostable cation-indépendante qui coupe préférentiellement l’ADNsb sans préférence de séquence. Toutefois, aucune caractérisation n’a été réalisée vis-à-vis d’une possible activité exonucléase, de son interaction vis-à-vis de l’ADN ou du mécanisme de coupure. Sept ans plus tard, le laboratoire de Nina Salama a publié une étude qui caractérisait les facteurs impactant la transformation chez H. pylori. Ils sont parvenus à démontrer que la présence d’une protéine NucT active limite la taille des fragments intégrés sans toutefois observer de diminution significative de la fréquence de transformation lorsque le gène est délété (Humbert et al., 2011). Plus récemment les travaux de Liechti et Goldberg ont démontré que NucT était également impliquée dans un mécanisme de recyclage des purines par clivage de l’ADN extracellulaire. Ce mécanisme est indépendant du système ComB. Ils démontrent ainsi que NucT est une protéine nécessaire à la croissance en milieu pauvre et potentiellement indispensable à l’infection (Liechti et Goldberg, 2013). Les auteurs n’ont toutefois pas été capables de déterminer si l’activité de la protéine sur l’ADN extracellulaire était due à sa présence sur la membrane externe ou si la protéine était libérée dans le milieu extracellulaire lors de la mort des cellules bactériennes. Si cette dernière hypothèse s’avérait correcte, alors le rôle de NucT dans le recyclage des purines serait probablement une tache secondaire et son rôle principal resterait à déterminer.

La régulation de la transformation chez H. pylori

Comme expliqué précédemment, les bactéries doivent posséder un moyen de réguler le phénomène de transformation si elles ne veulent pas voir l’intégrité de leurs génomes menacée. Cette balance entre diversité génétique et stabilité génétique peut être ajustée de deux façons. La bactérie peut, soit favoriser l’intégration de séquences inoffensives par l’utilisation de séquences DUS ou des systèmes R/M, soit réguler sa compétence afin de limiter la quantité d’ADN transformé.

Sélection des séquences d’ADN transformant

La capture de l’ADN chez H. pylori n’est pas dépendante de la reconnaissance de séquences DUS. La bactérie peut donc capturer n’importe quel type d’ADN indépendamment de son origine. Il existe toutefois des systèmes R/M qui vont permettre de contrôler l’ADN internalisé. Il existe trois types de systèmes R/M chez les bactéries. Le plus étudié d’entre eux et également le plus simple, est le système R/M de type II. H. pylori possède de nombreux systèmes R/M de ce type, mais ces derniers peuvent être souches spécifiques, a phase variable et le plus souvent inactivés par des mutations (Alm et al., 1999 ; Aras et al., 2002). Ainsi, alors que chaque souche de H. pylori possède plus d’une vingtaine de systèmes R/M, seule une petite partie d’entre eux est active. La souche 26695, par exemple, possède 14 systèmes R/M de type II mais seuls 4 d’entre eux sont actifs (Lin et al., 2001). Les travaux réalisés par les laboratoires de Nina Salama et Matin J Blazer ont démontré que le système R/M limitait les échanges d’ADN chromosomique entre des souches non isogéniques par réduction de l’efficacité de transformation et réduction de la taille du fragment intégré. Le fait que l’efficacité de transformation soit diminuée mais pas totalement abolie indique que le clivage de l’ADN transformé est partiel et limité à certains sites (Aras et al., 2002 ; Humbert et al., 2011). Il a en outre été démontré in vitro que DprA pouvait protéger l’ADN des enzymes de restriction par stimulation de l’activité des méthylases (Dwivedi et al., 2013). Bien que ce rôle potentiel de DprA ne doive pas être négligé, il semble pour le moment prématuré d’inclure ce mécanisme dans le processus de transformation. En effet, il faudrait pour cela connaitre avec précision l’étape à laquelle interviennent les systèmes R/M et également parvenir à démontrer l’existence d’un tel rôle in vivo.

Table des matières

Première partie : Helicobacter pylori
I- Caractéristiques générales d’Helicobacter pylori
A- Présentation phylogénétique
B- Découverte d’Helicobacter pylori
C- Caractéristiques physico-biologiques
1- Morphologie et culture
2- Une bactérie pour trois formes
3- Les biofilms
D- Génome d’Helicobacter. pylori
II- Infection et pathogenèse
A- Prévalence et mode d’infection
B- L’infection par Helicobacter pylori
C- Les pathologies causées par H. pylori
1- Ulcère
2- Cancer de l’estomac
3) Autres pathologies
D- Diagnostic
E- Traitement
III- Variabilité génétique de H. pylori
A- Polymorphisme nucléotidique
B- Réarrangements chromosomiques
1- Réorganisation du génome
2- Transferts horizontaux d’ADN
– La conjugaison
– La transduction
– La transformation naturelle
Deuxième partie : La transformation bactérienne
I- La transformation bactérienne
A- Découverte de la transformation bactérienne
B- Pourquoi les bactéries transforment-elles ?
C- Principe de la transformation bactérienne
D- La Transformation de plasmide
E- La recombinaison homologue
F- Limitation de la transformation par les mécanismes biologiques.
II- La transformation chez les bactéries à Gram positif
A- Le processus d’internalisation
B- La machinerie d’internalisation
C- La régulation de l’entrée en compétence
D- L’entrée en compétence chez S. pneumoniae : un quorum sensing?
E- La régulation de la sortie de la compétence
F- Le fratricide microbien chez S. pneumoniae
III- La transformation chez les bactéries à Gram négatif
A- La capture de l’ADN chez les bactéries à Gram négatif
– Le système de restriction/modification chez N. gonorrhoeae
B- La machinerie d’internalisation des bactéries à Gram négatif
– Le transformasome de H. influenzae
C- La régulation de la compétence
1) La régulation de la compétence chez N. gonorrhoeae
2) La régulation de la compétence chez H. influenzae
3) La régulation de la compétence chez V. cholerae (figure 13)
a) Un mécanisme Sxy like (figure 13 A)
b) Un mécanisme de quorum sensing (figure 13B)
c) Un mécanisme de fratricide
4) La régulation de la compétence chez le genre Pseudomonas
Troisième partie : La transformation chez H. pylori
I- Découverte de la transformation chez H. pylori
II- La machinerie d’internalisation de H. pylori
A) Les systèmes de sécrétion de type IV
B) Le système de sécrétion de type IV de H. pylori
C) Le mécanisme d’internalisation et d’intégration (figure 16)
D) Intégration de l’ADN transformant
E) Les nucléases impliquées dans la transformation chez H. pylori : impact de la protéine NucT
III- La régulation de la transformation chez H. pylori
A) Sélection des séquences d’ADN transformant
B) Régulation de la compétence
IV) Projet de thèse
Résultats
I) Visualisation directe de la capture de l’ADN chez H. pylori
A- Présentation des travaux de recherche
B- Article 1
C- Travaux complémentaires sur la visualisation de la transformation
II- Défauts de réparation et compétence
A- Problématique de recherche
B- Visualisation des foci d’ADN sur des cellules fixées
C- La suppression de la voie de réparation par recombinaison homologue induit une augmentation du nombre de foci
D- L’augmentation du nombre de foci est corrélée à une augmentation du nombre de T4SS
E- Analyse du niveau d’expression de ComB8 et ComB10 dans différents fonds génétiques
F- Niveau d’expression du T4SS et niveau de transformation
G- Données complémentaires
1) Etude de DprB
2) Etude du gène HP1473
III- Etude du rôle de la nucléase NucT
A- Problématique de recherche
B- Caractérisation biochimique
1) Production de la protéine NucT pure
2) Détermination du milieu réactionnel
3) NucT est plus active sur l’ADN simple-brin que sur l’ADN double-brin
4) NucT possède une activité endonucléase et 3’exonucléase
5) L’histidine 124 est indispensable à l’activité nucléase
6) NucT est également capable de dégrader les ARN
7) NucT possède une importante affinité pour l’ADN simple brin
C- Localisation de la protéine NucT
D- Phénotype des souches mutées pour nucT
E- Données complémentaires
1) Fluorescence et nucléase : création d’artefacts
2) Recherche de protéines interagissant avec NucT
Discussion et perspectives
I- Visualisation de la transformation
A- Croissance de H. pylori sous microscope
B- ADN-fluorescent et transformation
C- Génération de bactérie GFP
D- La transformation et division cellulaire
E- ComEC est impliquée dans le passage de l’ADN dans le cytoplasme
II- Défauts de réparation et compétence
A- Nombre de foci et quantité d’ADN capturé
B- L’induction de la compétence chez H. pylori
C- Existe-t-il un lien entre niveau d’expression du T4SS et fréquence de transformation ?
D- Détermination des facteurs limitant la transformation
III- Analyse du rôle de NucT
A- NucT est une nucléase très active impliquée dans la transformation
B- L’activité nucléase de NucT ne semble pas impliquée dans la transformation
C- La protéine NucT est localisée de manière homogène le long des membranes cellulaires
D- L’activité nucléase de NucT est-elle impliquée dans le recyclage des nucléotides ?
Matériels et méthodes
Bibliographie

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