La biosynthèse des peptides non ribosomaux et des polycétides par des machineries enzymatiques multi-domaines

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Diversité des souches d’Escherichia coli

Escherichia coli est une espèce de bactérie en forme de bacille de la famille des Enterobacteriaceae. C’est un organisme modèle en génétique, biologie moléculaire et microbiologie. Cette espèce versatile peut être aussi bien commensale de l’homme que pathogène (Kaper et al., 2004). Plusieurs classifications rendent compte de la diversité de cette espèce. En particulier, l’espèce est divisée en groupes phylogénétiques ou phylogroupes et la plupart des souches appartiennent aux phylogroupes A, B1, B2 et D (Escobar-Páramo et al., 2004). Le mode de vie d’une souche est relié à son histoire évolutive et donc à son phylogroupe. Ainsi, les souches commensales appartiennent généralement au phylogroupe A. Les souches pathogènes sont également divisées en différents pathotypes selon la maladie qu’elles génèrent et la combinaison de facteurs de virulence qu’elles possèdent (Kaper et al., 2004 ; Gatsios et al., 2021). Par exemple, il existe six pathotypes d’E. coli causant des diarrhées. Les souches pathogènes extra-intestinales d’E. coli (ExPEC) causent des infections urinaires et des méningites et sont généralement associées au phylogroupe B2 (Russo & Johnson, 2000).

Génotoxicité des souches pks+ d’E. coli

Les souches pks+ d’E. coli génèrent des cassures double-brin de l’ADN des cellules eucaryotes

Figure 1. L’infection transitoire de cellules HeLa par des souches pks+ d’E. coli induit un phénotype de mégalocytose et un arrêt du cycle cellulaire. Adapté de Nougayrède et al., 2006. A) Des cellules HeLa ont été infectées pendant 4 heures par des bactéries E. coli à une multiplicité d’infection de 100 puis lavées et examinées par coloration Giemsa 72 heures après infection. La souche DH10B est une souche de laboratoire alors que la souche IHE3034 est une souche ExPEC possédant l’îlot pks. BAC : chromosome artificiel bactérien vide, BAC-pks : BAC contenant l’îlot pks. Barre d’échelle : 50 μm. B) Schéma du cycle cellulaire. C) Des cellules HeLa synchronisées en phase G1/S ont été incubées pendant 4 heures avec des souches DH10B-BAC ou DH10B-BAC-pks et la progression du cycle cellulaire a été analysée par cytométrie en flux plusieurs heures après l’infection.
L’effet génotoxique de certaines souches d’E. coli sur des cellules de mammifères a été démontré pour la première fois en 2006 par Nougayrède et al. (Nougayrède et al., 2006). L’équipe a remarqué que certaines souches d’E. coli du phylogroupe B2, telle que la souche ExPEC IHE3034 isolée d’un patient souffrant d’une méningite, induisent chez des cellules de mammifères en co-culture un phénotype de mégalocytose, c’est-à-dire un accroissement du volume du cytoplasme et du noyau associé à une absence de mitose (Figure 1A). Des mutagénèses ont permis l’identification de l’îlot génomique pks, d’une taille de 54 kilobases, comme étant responsable du phénotype de mégalocytose. Un îlot génomique est une portion de génome acquise par transfert horizontal et l’acquisition de l’îlot pks chez E. coli sera décrite dans la partie II.1 ci-dessous. L’îlot pks a été cloné dans un chromosome bactérien artificiel (BAC-pks) et des expériences de complémentation ont démontré que cet îlot est suffisant pour induire le phénotype de mégalocytose chez les cellules en co-culture (Figure 1A). Ce phénotype n’est pas induit par l’incubation avec un lysat ou un surnageant de cultures de souches pks+ d’E. coli et nécessite un contact entre la cellule eucaryote et la bactérie. L’inhibition de l’internalisation de la bactérie dans la cellule eucaryote n’abolit pas le phénotype induit de mégalocytose. Ces résultats suggèrent que les bactéries possédant l’îlot pks produisent une toxine, la colibactine, responsable du phénotype de mégalocytose observé chez les cellules eucaryotes avec lesquelles elles ont été co-cultivées.
Le phénotype de mégalocytose rappelle l’effet des cyclomodulines, qui sont des toxines bactériennes perturbant le cycle cellulaire des cellules eucaryotes (Nougayrède et al., 2005). Par exemple, les cyclomodulines Cif (« cycle inhibiting factor ») et CDT (« cytolethal distending toxin ») inhibent le cycle cellulaire. Au cours du cycle cellulaire, les cellules eucaryotes répliquent leur ADN pendant la phase S et se divisent pendant la mitose (Figure 1B). Le passage d’une phase à l’autre est régulé par des points de contrôle. Des cellules HeLa contrôles suivent le cycle classique et répliquent leur ADN puis se divisent en moins de 24 heures alors que des cellules HeLa infectées par des souches pks+ répliquent leur ADN plus lentement et ne se divisent plus, ce qui indique qu’elles n’ont pas passé avec succès le point de contrôle G2/M (Figure 1C). Certaines cellules entrent en apoptose.
Le passage de la phase G2 à la mitose est régulé par le point de contrôle G2/M, qui est déclenché notamment par des cassures double-brin (Figure 1B). L’analyse de l’ADN des cellules eucaryotes par électrophorèse en conditions alcalines a montré que les souches pks+ induisent des cassures double-brin dans l’ADN des cellules HeLa (Nougayrède et al., 2006). Des analyses biochimiques ont montré que les souches pks+ d’E. coli induisent l’autophosphorylation de la kinase ATM (de l’anglais « ataxia telangiectasia mutated ») (Bakkenist & Kastan, 2003). La phosphorylation détectée des protéines H2AX et Chk2 indique que toute la voie de signalisation initiée par l’autophosphorylation d’ATM est déclenchée par les souches pks+. La déphosphorylation de Chk2 est nécessaire au passage de la phase G2 à la mitose. En résumé, les bactéries pks+ induisent des cassures double-brin de l’ADN des cellules HeLa, ce qui initie la voie de signalisation ATM et in fine bloque l’entrée en mitose des cellules HeLa. L’induction de cassures double-brin et l’activation de la voie de signalisation ATM sont confirmées in vivo sur des portions d’intestin de souris incubées avec des souches pks+ d’E. coli (Cuevas-Ramos et al., 2010).

Les souches pks+ d’E. coli induisent des alkylations de l’ADN et des ponts inter-brin

Des cassures double-brin de l’ADN peuvent être causées par un mécanisme de réparation de certaines lésions à l’ADN, les ponts inter-brin (de l’anglais « interstrand crosslink ») (Deans & West, 2011). L’activation de la voie de signalisation ATM pourrait donc être une conséquence d’autres dommages infligés à l’ADN par les bactéries pks+ d’E. coli. L’équipe de Nougayrède a montré que des cellules HeLa co-cultivées avec des souches pks+ d’E. coli sont protégées de la génotoxicité bactérienne par l’ajout d’ADN extracellulaire de façon dose-dépendante (Bossuet-Greif et al., 2018). L’analyse biochimique de l’ADN extra-cellulaire a révélé que cet ADN contient des ponts inter-brin, suggérant que la colibactine produite par les souches pks+ est responsable de la formation de ponts inter-brin sur l’ADN. Les ponts inter-brin sont formés par alkylation de deux nucléotides localisés chacun sur un brin. Ils empêchent l’ouverture de l’ADN par l’hélicase au moment de la réplication, la bloquant. Les E. coli pks+ induisent la voie de l’anémie de Fanconi, une voie de réparation de l’ADN utilisée par les cellules eucaryotes en réponse à des ponts inter-brin, qui est en lien avec d’autres voies de réparation (Bossuet-Greif et al., 2018).

Les souches pks+ d’E. coli génèrent des aberrations chromosomiques

Les souches pks+ induisent des ponts inter-brin et des cassures double-brin mais également des dommages plus importants de l’ADN, qui pourraient provenir d’une réparation incomplète des dommages initiaux. Des aberrations chromosomiques sont observées sur des portions d’intestin de souris exposées aux bactéries pks+ (Cuevas-Ramos et al., 2010) et sont également observées sur des organoïdes humains infectés par les souches pks+ d’E. coli (Iftekhar et al., 2021). Les dommages à l’ADN générés par les souches pks+ d’E. coli ainsi que leur localisation intestinale suggèrent un lien entre ces souches et le cancer colorectal.

Implication des souches pks+ d’E. coli dans le cancer colorectal

Le cancer colorectal

Le côlon est la portion du tube digestif après l’intestin grêle. Il possède une fonction de récupération d’eau et de propulsion des fèces vers le rectum. Le côlon et le rectum ont une histologie semblable. Le cancer est une maladie causée par la prolifération anarchique de cellules qui forment in fine une masse nommée tumeur. Le cancer colorectal (CCR) est le deuxième cancer le plus meurtrier et 916 000 décès ont été attribués au CCR dans le monde en 2020 (Organisation mondiale de la santé). Il peut être guéri s’il est détecté précocement. Seulement 5 % des CCR sont héréditaires (Kwak & Chung, 2007) et les 95 % restants sont sporadiques, c’est-à-dire causés par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux.
La transformation d’un épithélium sain en une tumeur est divisée en étapes et les mutations génétiques clés initiant le passage d’une étape à l’autre sont bien connues (Vogelstein et al., 2013) (Figure 2). La plupart de ces mutations sont des substitutions d’un seul nucléotide. La première mutation est généralement celle du gène suppresseur de tumeur APC (de l’anglais « adenomatous polyposis coli ») dans une cellule épithéliale. Ce gène doit son nom à la polypose adénomateuse familiale, une forme héréditaire du CCR causée par une mutation du gène APC. Cette mutation participe à l’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt, normalement activée constitutivement uniquement dans les cellules souches et induit donc la prolifération de la cellule mutée, générant un adénome précoce. Une mutation d’un deuxième gène, tel que le gène KRAS (de l’anglais « kristen rat sarcoma viral oncogene homolog ») augmente encore la capacité proliférative des cellules mutées. Une troisième mutation dans des gènes tels que P53 génère une tumeur maligne ou carcinome, qui peut envahir d’autres parties du corps en formant des métastases.
Plusieurs facteurs de risque sont identifiés pour le cancer colorectal tels que l’alimentation trop riche, le surpoids ou l’inflammation chronique de l’intestin. Les maladies inflammatoires de l’intestin, comprenant la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont d’ailleurs un facteur de risque pour le CCR (Stidham & Higgins, 2018). Ces dernières années, les preuves du rôle du microbiote intestinal dans l’initiation et le développement du CCR se sont accumulées (Tilg et al., 2018). Des dysbioses sont associées au CCR et certaines espèces bactériennes sont particulièrement retrouvées chez les patients ayant un CCR, notamment Fusobacterium nucleatum, Bacteroides fragilis et certaines souches d’Escherichia coli.

Etudes épidémiologiques

Plusieurs études épidémiologiques démontrent que les souches pks+ d’E. coli sont plus associées à des patients ayant un CCR qu’à des patients contrôles. Une première étude montre que les souches pks+ d’E. coli sont retrouvées dans 55 % des biopsies de patients avec CCR et dans seulement 19 % des patients contrôles ayant des diverticules sur la surface du côlon (Buc et al., 2013). Des valeurs très similaires sont retrouvées par étude des selles de patients avec CCR ou patients contrôles (Eklöf et al., 2017). Les souches pks+ sont également significativement plus retrouvées chez les patients souffrant de maladie inflammatoire de l’intestin et de polypose adénomateuse familiale (Dejea et al., 2018).
Ces chiffres suggèrent un lien entre les souches pks+ d’E. coli et le CCR mais ne démontrent pas une causalité. On pourrait par exemple supposer que l’environnement tumoral confère un avantage sélectif aux souches pks+ d’E. coli.

Effet des souches pks+ d’E. coli sur des modèles murins

Afin de démontrer une causalité des souches pks+ dans l’initiation ou la progression du CCR, plusieurs expériences ont été menées sur des modèles murins. Une première étude a investigué l’effet des souches pks+ d’E. coli sur un modèle de souris mimant le contexte du CCR (souris IL10-/- traitées par l’azoxyméthane) (Arthur et al., 2012). Les souches pks+ d’E. coli ont un effet pro-tumoral dans ce contexte pro-inflammatoire et en présence d’un carcinogène. L’effet pro-tumoral des souches pks+ d’E. coli a également été démontré chez des souris Min, un autre modèle animal de CCR (Bonnet et al., 2014). Ces études démontrent que les souches pks+ d’E. coli favorisent la progression du CCR dans les modèles murins.
Afin de tester l’effet des souches pks+ dans un contexte non pro-tumoral, des souris aseptisées (« germ free ») ont été infectées par des E. coli pks+ ou pks- puis l’ADN des cellules épithéliales du côlon de ces souris a été extrait (Wilson et al., 2019). Des adduits de l’ADN avec la molécule de colibactine sont détectées uniquement dans les cellules des souris infectées par les souches pks+, ce qui montre que l’effet génotoxique des souches pks+ se produit en l’absence de conditions pro-tumorales et suggère que les souches pks+ jouent également un rôle dans l’initiation du CCR.

Signature mutationnelle induite par les souches pks+ d’E. coli

Deux études publiées en 2020 ont déterminé la signature mutationnelle des souches pks+ d’E. coli et ont identifié cette signature dans une portion des CCR, démontrant ainsi le rôle des souches pks+ dans l’initiation de certains CCR (Pleguezuelos-Manzano et al., 2020 ; Dziubańska-Kusibab et al., 2020). La première étude a utilisé un outil novateur, les organoïdes, qui sont des structures tri-dimensionnelles mimant un organe, un intestin dérivé de cellules épithéliales humaines dans cette étude (V. S. W. Li, 2020) (Figure 3). Des E. coli pks+ ou délétées d’un gène essentiel à la génotoxicité, clbQ (pksΔclbQ) ont été injectées dans le lumen de deux organoïdes. Après seulement un jour d’exposition, les dommages à l’ADN décrits
précédemment sont détectés uniquement chez les organoïdes exposés à la souche pks+ d’E. coli. Des injections d’E. coli pks+ ou pksΔclbQ ont alors été répétées pendant cinq mois afin de mimer une exposition à long terme par les souches bactériennes. Plusieurs organoïdes ont été dérivés des organoïdes initiaux et leurs génomes ont été séquencés entièrement. Des mutations spécifiques sont alors identifiées uniquement dans les organoïdes exposés à la souche pks+ d’E. coli.
Deux sortes de mutations sont détectées : les substitutions d’une seule base (« single-base substitution », SBS) et des délétions dans des séquences riches en base thymine. Les SBS sont principalement retrouvées sur la base thymine localisée dans des motifs ATA, ATT et TTT (la base mutée est soulignée) présentant une base adénine 3 paires de bases en aval de la base thymine. Ces signatures mutationnelles ont été recherchées dans les séquences de tumeurs. Un enrichissement significatif (5-10 %) est retrouvé dans les tumeurs de CCR, ainsi que dans certains autres types de tumeurs. Les mutations connues des gènes causant le CCR ont été analysées afin d’établir un lien entre cette signature et l’initiation du CCR. La signature est retrouvée dans 2.4 % (112/4712) des mutations de gènes clés dans l’initiation et la progression du CCR. 52 mutations touchent le gène APC, gène clé dans la carcinogénèse du CCR. Ces résultats, confortés par l’étude de Dziubańska-Kusibab et al., suggèrent la causalité des souches pks+ E. coli dans certains CCR (Dziubańska-Kusibab et al., 2020). Cette signature mutationnelle est compatible avec la structure et le mécanisme d’action de la colibactine (voir II.3 ci-dessous).

Les souches pks+ d’E. coli induisent la transformation tumorale de cellules épithéliales de côlon

Des organoïdes ont également été utilisés pour démontrer la capacité de transformation de cellules saines en cellules tumorales par les souches pks+ d’E. coli (Iftekhar et al., 2021). Une exposition courte (quelques heures) d’organoïdes dérivés de cellules épithéliales primaires de côlon de souris par des E. coli pks+ confère à ces organoïdes des caractéristiques de cellules cancéreuses du CCR. Notamment, la voie de signalisation Wnt est constitutivement active dans ces cellules. De plus, ces cellules prolifèrent anormalement et présentent des signes de dédifférenciation. Le séquençage du génome des organoïdes ayant la voie Wnt activée constitutivement a également révélé plusieurs aberrations chromosomiques, qui sont retrouvés dans une majorité des CCR sporadiques (Cancer Genome Atlas Network, 2012). La signature mutationnelle n’a pas été identifiée dans ces organoïdes, suggérant que la signature mutationnelle et les aberrations chromosomiques résultent de mécanismes différents.

Modèle du rôle des souches pks+ d’E. coli sur le cancer colorectal

La co-culture de souches pks+ d’E. coli avec des cellules eucaryotes génère plusieurs types de dommages à l’ADN dans ces cellules : ponts inter-brin, cassures double-brin, mutations et aberrations chromosomiques. Le modèle présenté à la Figure 4 résume l’impact des souches pks+ d’E. coli produisant la colibactine sur l’ADN des cellules eucaryotes (Berger & Meyer, 2021). L’effet génotoxique direct de la colibactine est le pontage inter-brin de l’ADN (Xue et al., 2019). Selon ce modèle, deux cas de figure se présentent alors. Dans le premier cas, les ponts sont suffisamment peu nombreux pour être réparés par les mécanismes de réparation de la cellule, ce qui génère des cassures double-brin et des mutations. La signature mutationnelle détectée dans une faible proportion de cancers serait la marque des dommages dus à la colibactine imparfaitement réparés par la cellule. Dans le deuxième cas, les ponts sont tellement nombreux que la cellule ne peut pas tous les réparer, ce qui bloque la réplication et entraîne des aberrations chromosomiques. Ce modèle suggère que la signature mutationnelle présente dans 5-10 % des CCR ne serait que la partie émergée de l’iceberg et que la colibactine produite par les souches pks+ d’E. coli pourrait jouer un rôle dans une bien plus large proportion des CCR.
On peut signaler ici que les souches pks+ d’E. coli sont acquises très tôt au cours de la vie, par des contacts mère-enfant à la naissance ou lors de l’allaitement (Tsunematsu et al., 2021). Une détection précoce de cette souche pourrait être envisagée en prévention du cancer colorectal.

Implication des souches pks+ d’E. coli dans d’autres types de cancers

La signature mutationnelle des souches pks+ d’E. coli est également retrouvée dans des tumeurs du côlon mais aussi dans une faible fraction de tumeurs de la tête et du cou, ainsi que des tumeurs des voies urinaires (vessie ou reins) (Pleguezuelos-Manzano et al., 2020). Ces deux sites sont des sites d’infection par E. coli donc les souches génotoxiques pks+ d’E. coli pourraient jouer un rôle dans certains de ces cancers.
Deux études récentes ont commencé à établir un lien de causalité entre les souches pks+ d’E. coli et un cancer autre que le CCR. Une première étude a d’abord montré que les souches pks+ d’E. coli sont particulièrement retrouvées chez les patients atteints d’infection urinaire (Chagneau et al., 2021). Un modèle murin d’infection urinaire a permis de démontrer la génotoxicité d’une souche isolée d’un patient ayant une infection urinaire sur les cellules urothéliales. Une deuxième étude a suggéré une association entre les souches pks+ d’E. coli et l’initiation du cancer de la prostate (Shrestha et al., 2021). Environ la moitié des cancers de la prostate sont caractérisés par une fusion entre les gènes TMPRSS2 et ERG conduisant à une surexpression de l’oncogène ERG (Tomlins et al., 2005). Les souches pks+ d’E. coli sont détectées dans certains spécimens de prostatectomie et semblent capables d’induire des cassures chromosomiques dans les gènes TMPRSS2 et ERG, suggérant que certains cancers de la prostate pourraient être causés par une infection précoce par des souches pks+ d’E. coli.

Autres effets des souches pks+ d’E. coli

L’intérêt biologique de l’îlot pks pour la bactérie le possédant est une question centrale. En effet, l’induction ou la promotion de cancer chez son hôte n’apporte pas de bénéfices évidents à une bactérie, il semble donc peu probable que l’effet carcinogène soit la seule fonction physiologique de l’îlot pks. Plusieurs études suggèrent l’importance des souches possédant l’îlot pks dans l’écologie du microbiote, qui est un environnement complexe composé de nombreuses espèces microbiennes. Une première étude a démontré un effet antibiotique modéré des souches pks+ d’E. coli contre plusieurs souches de Staphylococcus aureus, en particulier contre des souches multi-résistantes aux antibiotiques (Faïs et al., 2016). Le mécanisme de l’effet antibiotique n’a pas été déterminé à l’époque mais une étude récente suggère fortement que cet effet reposerait sur l’induction du cycle lytique de prophages intégrés dans le génome de S. aureus (Silpe et al., 2022).
Figure 5. Le cycle lytique et le cycle lysogénique du phage lambda. D’après l’ouvrage de biologie Campbell, 2012. La colibactine produite par les souches pks+ d’E. coli est un des facteurs déterminant le passage du cycle lysogénique au cycle lytique.
Les bactériophages sont des virus infectant les bactéries (Campbell, 2012) (Figure 5). Après infection, le virus peut entrer dans un cycle lysogénique, c’est-à-dire que l’ADN du phage s’intègre dans le chromosome bactérien et devient un prophage. Le virus peut également entrer dans un cycle lytique, c’est-à-dire détourner la machinerie bactérienne pour synthétiser de nouveaux phages et finalement lyser la cellule hôte. Les souches pks+ d’E. coli induisent l’initiation du cycle lytique chez plusieurs espèces de bactéries contenant des prophages intégrés dans leur génome, en particulier chez des souches d’E. coli, de S. aureus, de Salmonella enterica ou encore d’Enterococcus faecium. L’ajout d’ADN extracellulaire diminue l’induction du cycle lytique du phage, aussi appelée induction du prophage, suggérant que les dommages à l’ADN générés par la colibactine déclenchent cette induction du prophage. Par ailleurs, certaines bactéries possèdent uniquement un gène de l’îlot pks, le gène clbS codant la protéine de résistance à la colibactine ClbS (Bossuet-Greif et al., 2016 ; Tripathi et al., 2017). Silpe et al. ont démontré l’effet protecteur de ClbS chez des souches pks- contre l’induction du prophage par les souches pks+. L’effet d’induction du prophage par des souches pks+ pourrait expliquer les changements de composition du microbiote observés chez des souris après introduction d’une souche pks+ d’E. coli (Tronnet et al., 2020).
Une autre étude a montré un effet bactéricide des souches pks+ contre des souches de Vibrio cholerae, l’entéropathogène responsable de la maladie du choléra (Chen et al., 2022). Comme pour la génotoxicité des cellules eucaryotes et l’induction du prophage des cellules bactériennes, un contact est nécessaire entre la bactérie pks+ et l’autre cellule. L’effet bactéricide repose sur les cassures double-brin dans le génome des Vibrio cholerae mais le rôle des prophages n’a pas été étudié dans cette étude.
Enfin, l’îlot pks confère un effet anti-inflammatoire à certaines souches le possédant, notamment la souche d’E. coli Nissle 1917 utilisée comme probiotique (Olier et al., 2012). Commercialisé sous le nom de Mutaflor®, ce probiotique est utilisé depuis plus d’un siècle dans le traitement de certaines maladies intestinales dont la rectocolite hémorragique (Schultz, 2008). Il a été démontré qu’un lipopeptide produit par l’îlot pks confère à la souche ses propriétés analgésiques (Pérez-Berezo et al., 2017). Toutefois, la souche Nissle 1917, comme les autres souches pks+, est génotoxique in vitro et in vivo et la sûreté de ce traitement est aujourd’hui questionnée (Nougayrède et al., 2021). Il semblerait donc que, chez la souche Nissle 1917, l’îlot pks soit responsable de la biosynthèse de plusieurs métabolites ayant une variété d’actions biologiques.

La biosynthèse de la colibactine par l’îlot génomique pks

Distribution et acquisition de l’îlot pks chez les bactéries

L’îlot pks a été décrit principalement chez des Entérobactéries commensales de l’homme. Il a été découvert chez E. coli mais a été reporté chez d’autres Entérobactéries telles que Klebsiella pneumoniae, Citrobacter koseri et Enterobacter aerogenes (Putze et al., 2009). L’organisation et l’identité génétique de l’îlot pks sont très conservées parmi ces Entérobactéries (Figure 6). En particulier, l’îlot pks du pathogène opportuniste Klebsiella pneumoniae présente une identité de séquence de 100 % avec celui d’E. coli, suggérant que les souches pks+ de K. pneumoniae pourraient également jouer un rôle dans le CCR (Strakova et al., 2021).
Figure 6. Relations phylogénétiques entre les bactéries possédant l’îlot pks et comparaison de l’organisation génétique de l’îlot chez ces bactéries. D’après Engel et al., 2015. Les souches en bleu (Pseudovibrio FO-BEG1), violet (Frischella perrara PEB0191) et vert (Enterobacteriaceae) possèdent l’îlot pks. Les gènes orthologues sont connectés entre eux par des blocs gris. Les gènes sans homologues sont représentés en blanc. AM : amidase, DH : déshydrogénase, EP : protéine d’efflux, H : hydrolase, MobB : protéine de mobilisation B, PE : peptidase, PPT : phosphopantéthéinyl-transférase, SAM : protéine liant la S-adénosylméthionine, T : « carrier protein », TE : thioestérase.
L’îlot pks a également été décrit chez deux symbiontes bactériens n’appartenant pas à la famille des Entérobactéries, une souche de Frischella perrara isolée d’une abeille (Engel et al., 2015) et une souche de Pseudovibrio isolée d’un corail (Bondarev et al., 2013). Malgré une faible identité de séquence avec l’îlot pks des Entérobactéries, l’organisation génétique de l’îlot chez ces souches est globalement conservée avec celle des Entérobactéries (Figure 6). La génotoxicité de la souche pks+ de Frischella perrara a même été démontrée in vitro (Engel et al., 2015).
A l’exception de Frischella perrara, l’îlot pks des autres souches est bordé par des éléments génétiques mobiles, en particulier des gènes qui codent des transposases et des intégrases, témoignant d’une acquisition par transfert horizontal de gènes (Engel et al., 2015) (Figure 6). Chez la plupart des souches d’E. coli du phylogroupe B2, cet îlot est inséré au niveau du locus de l’ARNt asnW (Auvray et al., 2021). Ce locus est situé à proximité de l’îlot génomique codant la biosynthèse du sidérophore yersiniabactine, indiquant que l’îlot pks a suivi une trajectoire évolutive similaire à cet îlot (Wami et al., 2021).

Organisation et régulation de l’îlot pks

L’îlot pks code 19 protéines, toutes essentielles à la génotoxicité de la souche d’E. coli le possédant, à l’exception de la protéine de transport ClbM, pouvant probablement être complémentée par une autre pompe à efflux (Nougayrède et al., 2006 ; Mousa et al., 2016). La majorité des protéines codées par l’îlot sont des enzymes qui participent directement à la biosynthèse de la colibactine (Figure 7). La peptidase ClbP (Dubois et al., 2011 ; Cougnoux et al., 2012) et l’hydrolase ClbS (Bossuet-Greif et al., 2016 ; Tripathi et al., 2017) sont deux protéines permettant à la bactérie productrice de se protéger contre l’effet génotoxique de la colibactine. ClbQ est une thioestérase hydrolysant les intermédiaires attachés aux protéines de biosynthèse de la colibactine (Guntaka et al., 2017). Deux protéines, ClbA et ClbR, sont codées sur le brin opposé du brin où sont codées toutes les autres protéines Clb. ClbA est une enzyme qui modifie post-traductionnellement certaines enzymes de biosynthèse de la colibactine et ClbR est l’activateur transcriptionnel de l’îlot pks (Wallenstein et al., 2020).
Les 19 protéines codées par l’îlot sont traduites à partir de sept transcrits dont quatre polycistroniques (Homburg et al., 2007). Les protéines ClbB, ClbH et ClbQ sont codées à partir d’ARNm monocistroniques. Les protéines codées par des ARNm polycistroniques sont ClbC à
ClbG, ClbI à ClbN, ClbO-ClbP et ClbA-ClbR. L’unité génétique codant ClbA et ClbR a été acquise postérieurement au reste de l’îlot génomique et apparaît essentielle pour la régulation de la biosynthèse de la colibactine (Wami et al., 2021).
Un paramètre important pour la régulation de l’expression de l’îlot pks est la disponibilité en fer. En effet, l’expression de ClbA et de ClbR est diminuée dans un milieu riche en fer (Tronnet et al., 2017 ; Wallenstein et al., 2020). Par conséquent, la production de colibactine est réduite dans un milieu riche en fer (Tronnet et al., 2017). Les voies de biosynthèse de la colibactine et du sidérophore yersiniabactine sont connectées par la phosphopantéthéinyl-transférase ClbA, capable de modifier post-traductionnellement les enzymes de la biosynthèse de la yersiniabactine dont la voie de biosynthèse ne possède pas d’enzyme équivalente (Martin et al., 2013). L’effet synergique de la colibactine et de la yersiniabactine pourrait augmenter la virulence des souches possédant les îlots génomiques permettant la biosynthèse de ces deux métabolites.
D’autres facteurs physiologiques impactent l’expression des gènes de l’îlot pks et/ou la production de colibactine. Par exemple, la spermidine, une polyamine abondante dans les tissus cancéreux, favorise la génotoxicité des souches pks+ (Chagneau et al., 2019). L’inflammation active la transcription des gènes de l’îlot pks dans des souris modèles du CCR (Arthur et al., 2014). La régulation de la biosynthèse de la colibactine par de nombreux facteurs physiologiques souligne l’importance de ce métabolite pour la bactérie le produisant (Dougherty & Jobin, 2021).

Elucidation de la structure de la molécule génotoxique, la colibactine

Malgré des efforts considérables, la faible production de colibactine par les souches pks+ et son instabilité n’ont pas encore permis d’isoler la molécule de colibactine afin d’en élucider directement sa structure (Williams et al., 2020). Plusieurs stratégies ont toutefois permis la détermination indirecte de la structure de la colibactine. Il a rapidement été établi que les bactéries pks+ ne synthétisent pas directement la génotoxine mais une molécule non toxique, la pré-colibactine contenant un motif protecteur N-myristoyl-D-asparagine (Brotherton & Balskus, 2013). L’export de la pré-colibactine dans le périplasme par ClbM (Mousa et al., 2016) et le clivage du motif protecteur par la peptidase ClbP (Dubois et al., 2011) génèrent la molécule de colibactine. Plusieurs molécules de pré-colibactines ont été isolées à partir de cultures à grande échelle de souches pks+ΔclbP d’E. coli mais il a ensuite été démontré que certaines de ces molécules étaient des artefacts causés par la mutation de clbP (Williams et al., 2020).
Les recherches sur la structure de la colibactine ont alors reposé sur une stratégie différente, l’isolation et l’élucidation de fragments d’ADN endommagés par la colibactine (Williams et al., 2020). La structure d’un adduit entre la colibactine et une adénine a d’abord été déterminée par deux groupes indépendants (Xue et al., 2018 ; Wilson et al., 2019). Peu après, c’est la structure du pont inter-brin généré par la colibactine entre deux adénines qui a été caractérisée par les deux groupes (Xue et al., 2019 ; Jiang et al., 2019). Ces caractérisations structurales ont été permises par une multitude d’expériences, notamment des marquages isotopiques, de la spectrométrie de masse en tandem et de la synthèse chimique.

Table des matières

Table des matières
Abréviations
Introduction
Préambule
I. Activités biologiques des souches pks+ d’Escherichia coli du microbiote intestinal
I.1. Le microbiote intestinal et son rôle
I.2. Diversité des souches d’Escherichia coli
I.3. Génotoxicité des souches pks+ d’E. coli
I.4. Implication des souches pks+ d’E. coli dans le cancer colorectal
I.5. Implication des souches pks+ d’E. coli dans d’autres types de cancers
I.6. Autres effets des souches pks+ d’E. coli
II. La biosynthèse de la colibactine par l’îlot génomique pks
II.1. Distribution et acquisition de l’îlot pks chez les bactéries
II.2. Organisation et régulation de l’îlot pks
II.3. Elucidation de la structure de la molécule génotoxique, la colibactine
II.4. Production de la colibactine par l’îlot pks
III. La biosynthèse des peptides non ribosomaux et des polycétides par des machineries enzymatiques multi-domaines
III.1. Importance des métabolites secondaires synthétisés par les NRPS/PKS
III.2. Les NRPS/PKS partagent une organisation commune
III.3. Le domaine « carrier protein »
IV. Structures et fonctions des méga-enzymes NRPS
IV.1. Les domaines enzymatiques des NRPS
IV.2. Les structures des assemblages NRPS monomériques
IV.3. Les structures des assemblages NRPS dimériques
V. Structures et fonctions des méga-enzymes PKS
V.1. Les domaines enzymatiques des PKS
V.2. Les structures des assemblages PKS de type cis-AT
V.3. Les structures des assemblages PKS de type trans-AT
VI. Les hybrides NRPS/PKS
VI.1. Classification des hybrides
VI.2. Interfaces NRPS/PKS
VI.3. Interfaces PKS/NRPS
VI.4. Etat oligomérique des protéines hybrides de type fusionné
Choix du modèle d’étude et objectifs
Matériels et méthodes
I. Matériel biologique
I.1. Vecteurs d’expression
I.2. Souches bactériennes
I.3. Milieux de culture
II. Bio-informatique
II.1. Logiciels utilisés pour l’alignement de séquences et l’analyse des structures
II.2. Analyse de la séquence de ClbK
II.3. Génération de modèles par le logiciel Alphafold2
III. Biologie moléculaire
III.1. Clonage de ClbK et de ses fragments
III.2. Mutagénèse dirigée
IV. Expression et purification de ClbK et de ses fragments
IV.1. Tests d’expression, de solubilité et d’attache à la résine d’affinité
IV.2. Expression et lyse des cultures de ClbK
IV.3. Purification de ClbK
IV.4. Préparation de ClbK pour la microscopie électronique
IV.5. Expression et lyse des cultures de fragments de ClbK
IV.6. Expression de la forme sélénométhionée de la protéine ClbK-PKS
IV.7. Purification de ClbK-PKS
IV.8. Purification de ClbK-PKS-Cy et ClbK-PKS-Acore
V. Caractérisation biochimique et biophysique de ClbK et de ses fragments
V.1. Caractérisation par spectrométrie de masse en conditions dénaturantes
V.2. Caractérisation par diffusion de lumière laser multi-angles couplée à une chromatographie d’exclusion de taille (SEC-MALLS)
V.3. Caractérisation par photométrie de masse
VI. Caractérisation de l’activité enzymologique du domaine d’adénylation de ClbK
VII. Introduction à la diffusion des rayons X en vue d’études structurales
VIII. Caractérisation structurale par cristallographie aux rayons X
VIII.1. Tests de stabilité de la protéine dans différents tampons par essai Thermofluor
VIII.2. Cristallogenèse
VIII.3. Congélation des cristaux et enregistrement des données de diffraction
VIII.4. Traitement des données de diffraction
VIII.5. Phasage et affinement de la structure
IX. Caractérisation structurale par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)
IX.1. Dispositif expérimental et acquisition des données
IX.2. Soustraction du signal de diffusion du tampon
IX.3. Analyse de Guinier
IX.4. Fonction de distribution des distances
IX.5. Graphique de Kratky
IX.6. Modélisation ab initio
X. Caractérisation structurale par microscopie électronique à transmission
X.1. Principe de la méthode
X.2. Coloration négative
X.3. Cryo-microscopie électronique
Résultats
I. Etudes biochimiques et structurales de ClbK entière
I.1. Objectifs de l’étude de ClbK entière
I.2. Mise en place d’un protocole d’expression et de purification de ClbK
I.3. Détermination de l’état oligomérique de ClbK
I.4. Détermination de la préférence de substrat du domaine d’adénylation de ClbK
I.5. Eléments suggérant la présence d’un cofacteur FMN associé à ClbK
I.6. Essais de cristallisation de ClbK
I.7. Analyse structurale de ClbK en solution par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)
I.8. Observation de ClbK en microscopie électronique
I.9. Bilan de l’étude de ClbK entière et perspectives
I.10. Choix d’une stratégie de « dissection-reconstruction » de ClbK
II. Etudes biochimiques et structurales de ClbK-PKS
II.1. Objectifs de l’étude de ClbK-PKS
II.2. Purification de ClbK-PKS
II.3. Détermination de l’état de modification post-traductionnelle de ClbK-PKS
II.4. Détermination de l’état oligomérique de ClbK-PKS
II.5. Cristallisation de ClbK-PKS
II.6. Résolution de la structure de ClbK-PKS*
II.7. Analyse de la structure cristallographique de ClbK-PKS*
III. Etudes biochimiques et structurales d’autres fragments de ClbK
III.1. Objectifs de l’étude d’autres fragments de ClbK
III.2. Purification des fragments ClbK-PKS-LK, ClbK-PKS-Cy et ClbK-PKS-Acore
III.3. Détermination de l’état oligomérique des fragments ClbK-PKS-LK, ClbK-PKS-Cy et ClbK-PKS Acore
III.4. Tentatives d’analyse structurale de ClbK-PKS-Cy
III.5. Bilan de l’études des fragments ClbK-PKS-LK, ClbK-PKS-Cy et ClbK-PKS-Acore et perspectives
Discussion et perspectives
Résumé des informations acquises sur ClbK
Modèle possible de l’architecture de ClbK
Hypothèses sur l’interaction de ClbK avec ses partenaires enzymatiques
Interaction avec l’enzyme ClbG
Interactions avec les autres méga-enzymes Clb
Intérêt des travaux pour l’ingénierie des NRPS/PKS
Références

Télécharger le rapport complet