La biologie de reproduction

La biologie de reproduction

Développement des follicules : Phase indépendante des gonadotrophines
Transition des follicules primordiaux aux follicules primaires

Le recrutement/activation des  follicules primordiaux dans le vaste groupe de la réserve ovarienne commence dès qu’ils sont formés et d’autres vont attendre des mois et des années avant leur démarrage. À la suite de la puberté, certains follicules qui commencent leurs développements pourront se rendre jusqu’à l’ovulation. L’activation du follicule primordial est un processus plus ou moins bien connu qui fait appel à un déséquilibre entre l’inhibition et l’activation du follicule primordial. Il est mal compris pourquoi chaque jour, une petite portion de follicules primordiaux commence leur développement pour devenir des follicules primaires et de quelle façon ils sont sélectionnés. Toutefois, leur sélection semble faire intervenir les voies de signalisation PTEN (phosphatase and TENsin homolog), PI3K (phosphoinositide 3-kinase) et TSC/mTOR (tuberous sclerosis complex-mammalian target of rapamycin), qui sont connues pour être impliquées dans la régulation de l’activation et l’inhibition du démarrage de la croissance des follicules primordiaux (Reddy et al., 2005). Suite à son activation, un follicule primordial devient un follicule primaire lorsque la simple couche de cellules de granulosa entourant l’ovocyte prolifère et devient cubique (LinternMoore and Moore, 1979). La transition du follicule primordial en follicule primaire est aussi accompagnée de l’augmentation du diamètre de l’ovocyte et du recrutement des cellules génitrices de la thèque à partir des cellules du stroma. Certains facteurs produits par les cellules de granulosa sont impliqués dans le recrutement des cellules du stroma (Hirshfield, 1991).

Transition des follicules primaires en follicules secondaires

Lorsque le follicule contient plus que deux couches de cellules de granulosa, il devient un follicule secondaire ou préantral. À cette étape, il y a une augmentation accrue du diamètre folliculaire qui passe de 20 μm à entre 150 et 400 μm, selon l’espèce (150 μm chez la vache et 200 μm chez la femme). Cette augmentation du diamètre folliculaire est principalement due à l’augmentation du diamètre de l’ovocyte jusqu’à son diamètre final de 120 μm, chez la vache et chez la femme)(van den Hurk et al., 1997). L’augmentation du diamètre ovocytaire est due en partie à l’accumulation des réserves de protéines essentielles pour les futurs stades de maturation ainsi que les premiers jours de développement suite à la fécondation; cette étape représente une phase de cytodifférenciation (Picton et al., 1998). En plus de l’augmentation du diamètre de l’ovocyte, les cellules de la granulosa prolifèrent ce qui augmente davantage la dimension du follicule et sa complexité. Les cellules de la stroma s’organisent sur la région externe de la membrane basale du follicule et deviendront les cellules de la thèque du follicule. La prolifération des cellules de la thèque mènera à la formation de deux couches distinctes, une couche interne, hautement vascularisée et une couche externe, appelée la capsule fibreuse. Les cellules de la thèque ont plusieurs rôle durant la folliculogenèse, elles sont responsable de la production d’androgène (voir section sur la stéroïdogénèse) et supporte la croissance du follicule via la production d’une multitude de facteurs essentiels à la vascularisation (revue dans Young and McNeilly, 2010).
La transition du follicule primaire en follicule secondaire est totalement indépendante des gonadotrophines, même s’il est possible de détecter des récepteurs aux gonadotrophines à ce stade (Fortune and Eppig, 1979). La transition de primaire à secondaire est plutôt due aux facteurs intraovariens produits par le follicule (Kol and Adashi, 1995), ce qui inclut deux facteurs de la famille des facteurs de transformation et croissance bêta (TGFB, transforming growth factor beta), GDF9 (Elvin et al., 1999; Nilsson and Skinner, 2002) et BMP15 (Yan et al., 2001).

Zona Pellucida Lors de la phase préantrale, l’ovocyte sécrète des glycoprotéines qui forment une couche condensée transparente autour de lui-même, qu’on appelle la zone pellucide. Cette couche peut devenir une matrice constituée entre autres, de trois types de glycoprotéines (ZP1, ZP2 et ZP3) et permet de séparer l’ovocyte des cellules de la granulosa qui l’entourent (Takagi et al., 1989) sans altérer le réseau de communication.
Jonctions communicantes Des contacts avec la granulosa et l’ovocyte restent maintenus à l’aide de ponts cytoplasmiques qui pénètrent la zona, connus sous le nom de projection transzonale (TZP) et forment un nombre incroyable de jonctions GAP créant ainsi un réseau d’échange et de communication fonctionnel essentiel au développement de l’ovocyte (Hussein et al., 2006; Gilchrist et al., 2008). Les jonctions intercellulaires sont composées de protéines de type connexine (Cx). Les jonctions communicantes GAP facilitent la communication bidirectionnelle entre l’ovocyte et les cellules de granulosa; elles permettent le transport de nutriments, de précurseurs métaboliques, de molécules d’informations (ARNm, hormones, neurotrophines et facteurs de croissance) et des signaux méiotiques (Buccione et al., 1990).
On retrouve deux types de connexine soit la Cx37 et la Cx43 (Valdimarsson et al., 1993). La Cx37 est majoritairement présente entre les cellules de granulosa et l’ovocyte tandis que la Cx43 assure la communication entre les cellules du cumulus et de la granulosa et n’est pas présente entre l’ovocyte et les cellules du cumulus (Simon et al., 1997). Ces deux connexines sont essentielles pour le bon développement du follicule; les souris mutantes nulles de la connexine 37 sont stérile et démontrent un arrêt du développement ovocytaire avant la phase de méiose, une perte de maturation folliculaire (arrêt à la phase préantrale), un développement inapproprié du corps jaune et un échec de l’ovulation (Simon et al., 1997). Les souris mutantes de la connexine 43 meurt rapidement après la naissance et démontrent une déficience dans leurs cellules germinales et un arrêt de la croissance du follicule primaire, démontrant ainsi le rôle de la connexine 43 et des cellules de granulosa au début de la folliculogenèse (Juneja et al., 1999).
 Développement des follicules : Phase dépendante des gonadotrophines D’un point de vue fonctionnel, la folliculogenèse peut se subdiviser en deux phases successives, la phase indépendante des gonadotrophines, qui représente plus de 75 % de la durée totale du développement folliculaire et la phase dépendante des gonadotrophines qui est néanmoins plus rapide. C’est au cours de la deuxième phase que l’ovocyte acquiert sa compétence méiotique et développementale.

Gonadotrophines et leurs récepteurs

Les gonadotrophines sont des hormones formées de deux sous-unités glycoprotéiques alpha et bêta qui agissent sur les fonctions des gonades. La sous-unité alpha est spécifique à l’espèce. De plus, elle est commune au sein des gonadotrophines de la même espèce. À l’opposé, la sous-unité bêta est spécifique à chaque gonadotrophine. Deux des hormones sont sécrétées par l’hypophyse antérieure et jouent un rôle essentiel et distinctif dans le système reproducteur : l’hormone folliculo-stimulante (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH). Leurs actions dépendent de leurs liaisons et de l’activation de leurs récepteurs, le récepteur à la FSH (FSHR) et le récepteur à la LH (LHR). Il existe aussi une gonadotrophine chorionique semblable à la LH, sécrétée par le placenta. La chorionique humaine (hCG), sécrétée chez les femmes enceintes et la chorionique équine (eCG), anciennement appelée PMSG (« Pregnant mare serum gonadotropin ») sécrétée chez la jument gestante.À partir du follicule secondaire ou préantral, le follicule devient strictement dépendant de l’action des deux gonadotrophines FSH et LH d’une façon temporelle. En dessous d’un certain niveau de FSH ou de LH, les follicules ne peuvent plus se développer et entrent en atrésie, ainsi l’exposition des follicules préantraux à la FSH est favorable pour leurs survie (Cortvrindt et al., 1997). Contrairement au stade primaire, le follicule exprime des récepteurs fonctionnels FSHR et LHR et est désormais strictement dépendant des gonadotrophines. L’analyse des récepteurs membranaires à la fin de la phase préantrale et au début de la phase antrale du follicule révèle que seulement les cellules de la thèque interne peuvent lier la LH tandis que seulement les cellules de la granulosa peuvent lier la FSH. Les souris mutantes nulles pour FSH et son récepteur (FSHR) sont toutes deux infertiles et démontrent un arrêt folliculaire au stade préantral (Burns et al., 2001) et les ovaire sont significativement plus petit en plus de démontré des anormalie vaginale et utérin (Abel et al., 2000). Les souris mutantes du récepteur à la LH sont infertiles ayant aussi des follicules arrêtés au stade préantral (Zhang et al., 2001).

Table des matières

Résumé de thèse
Thesis abstract
Liste des Tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations et des sigles
Remerciements
Avant-propos
1. Introduction
1.1. La biologie de reproduction
1.2. Système reproducteur femell
1.3. Puberté
1.3.1. Hormones sexuelles
1.4. Le cycle ovarien
1.4.1. Phase folliculaire
1.4.2. Ovulation
1.4.3. Phase lutéale
1.5. Folliculogenèse
1.6. Formation des gamètes femelles : Stade embryonnaire
1.6.1. Cellules germinales embryonnaires (PGCs)
1.6.2. Follicule primordial
1.7. Développement des follicules : Phase indépendante des gonadotrophines
1.7.1. Transition des follicules primordiaux aux follicules primaires
1.7.2. Transition des follicules primaires en follicules secondaires
1.7.2.1. Zona Pellucida
1.7.2.2. Jonctions communicantes
1.8. Développement des follicules : Phase dépendante des gonadotrophines
1.8.1. Gonadotrophines et leurs récepteurs
1.8.2. Transition du follicule préantral au follicule antral
1.8.3. Recrutement, sélection et dominance du follicule
1.8.3.1. Stéroïdogénèse
1.9. Phase pré-ovulatoire : Pic pré-ovulatoire et ovulation
1.9.1. Pic de LH
1.9.2. Production de progestérone
1.9.3. Expansion du cumulus
1.9.4. Rupture de la paroi folliculaire et ovulation
1.9.5. Réaction inflammatoire
1.10. Phase lutéale
1.10.1. Formation du corps jaune
1.10.2. Lutéolyse
1.11. Concept de qualité des ovocytes
1.12. Maturation de l’ovocyte
1.12.1. Maturation nucléaire
1.12.2. Maturation cytoplasmique
1.12.3. Maturation moléculaire
1.13. Techniques de reproduction assistée
1.13.1. Production animale et élevage sélectif
1.13.2. Manipulation hormonale et transfert d’embryon
1.13.3. Stimulation ovarienne chez la vache
1.13.4. Coasting
1.13.5. Stimulation ovarienne chez la génisse
1.14. Évaluation de la compétence des ovocytes
1.14.1. Méthodes morphologiques
1.14.2. Méthodes moléculaires
1.14.2.1. Analyse des cellules de la granulosa
1.15. Hypothèse et objectifs
2. Effect of cow age on the in vitro developmental competence of oocytes obtained following FSH stimulation/coasting treatments
2.1. Résumé
2.2. Abstract
2.3. Introduction
2.4. Material and methods
2.4.1. Experimental design
2.4.2. Chemicals
2.4.3. Ovarian stimulation treatment and oocyte recovery
2.4.4. In vitro maturation
2.4.5. IVF
2.4.6. In vitro culture
2.4.7. Statistical analysis
2.5. Results
2.5.1. Effect of donor age on the number and size of follicles recovered
2.5.2. Effect of donor age on oocyte developmental competence
2.5.3. Effect of donor age on morula and blastocyst formation
2.5.4. Variability of individual responses to ovarian stimulation in terms of total number of aspirated follicles and blastocyst yield
2.6. Discussion
2.7. Acknowledgements
2.8. Disclosure
2.9. References
2.10. Figures
3. Granulosa cell gene expression, oocyte competence and embryo production in FSH-stimulated Holstein cows
3.1. Résumé
3.2. Abstract
3.3. Introduction
3.4. Materials and methods
3.4.1. Ethics statement
3.4.2. Experimental design
3.4.3. Chemicals
3.4.4. Ovarian stimulation treatment and granulosa cell collection
3.4.5. In vitro maturation
3.4.6. In vitro fertilisation
3.4.7. In vitro culture
3.4.8. RNA extraction and amplification
3.4.9. Sample labelling and microarray hybridisation
3.4.10. Microarray data analysis
3.4.11. Complementary DNA preparation and real-time PCR
3.4.12. Statistical analysis of real-time qPCR results
3.4.13. Ingenuity pathway analysis
3.5. Results
3.5.1. In vitro embryo production
3.5.2. Microarray analysis
3.5.3. Real-time qPCR
3.5.4. Ingenuity pathway analysis
3.6. Discussion
3.7. Declaration of interest
3.8. Funding
3.9. References
3.10. Figures
3.11. Tables
3.12. Supplemental data
4. Effect of heifer age on the granulosa cell transcriptome after ovarian stimulation
4.1. Résumé
4.2. Abstract
4.3. Introduction
4.4. Materials and methods
4.4.1. Ethics statement
4.4.2. Chemicals
4.4.3. Animal
4.4.4. Ovarian stimulation and gamete collection
4.4.5. IVM
4.4.6. IVF
4.4.7. In vitro culture
4.4.8. RNA extraction and amplification
4.4.9. Sample labelling and microarray hybridisation
4.4.10. Microarray data analysis
4.4.11. Functional analysis
4.4.12. Preparation of cDNA and quantitative real-time polymerase chain reaction
4.4.13. Statistical analysis of real-time qPCR results
4.5. Results
4.5.1. Reproductive performance of animals
4.5.2. Microarray analysis
4.5.3. Real-time qPCR validation
4.5.4. Functional analysis (IPA) and NetworkAnalyst
4.6. Discussion
4.6.1. Conclusion and remarks
4.7. Acknowledgements and funding
4.8. Declaration of interest
4.9. References
4.10. Figures
4.11. Supplemental data
5. Expression of atresia biomarkers in granulosa cells after ovarian stimulation in heifers
5.1. Résumé
5.2. Abstract
5.3. Introduction
5.4. Materials and methods
5.4.1. Ethics statement
5.4.2. Data retrieval
5.4.3. Meta-analysis of biomarkers of atresia
5.4.4. Analysis of biological functions and upstream regulators
5.4.5. Ovarian stimulation treatment and granulosa cell collection
5.4.6. RNA extraction
5.4.7. Complementary DNA preparation and quantitative real-time polymerase chain reaction 154 5.5. Results
5.5.1. Meta-Analysis
5.5.2. Functional Analysis
5.5.3. Validation of Meta-analysis Gene Expression
5.6. Discussion
5.6.1. Gene analysis
5.6.2. Functional Analysis
5.6.3. Conclusion
5.7. Acknowledgement
5.8. Funding
5.9. Declaration of interest
5.10. References
5.11. Figures
5.12. Tables
5.13. Supplemental data
6. Follicle capacitation: A meta-analysis to investigate the transcriptome dynamics following FSH decline in bovine granulosa cells
6.1. Résumé
6.2. Abstract
6.3. Introduction
6.4. Materials and Methods
6.4.1. Data retrieval
6.4.2. Microarray meta-analysis association with FSH decline
6.4.3. Network-based meta-analysis
6.4.4. Analysis of biological functions and upstream regulators
6.4.5. Animals, ovarian stimulation and granulosa cells collection
6.4.6. Reverse transcriptase quantitative PCR
6.5. Results
6.5.1. Network-based meta-analysis of genes associated with oocyte competence
6.5.2. Functional Analysis
6.5.3. Validation of Meta-analysis Gene Expression
6.6. Discussion
6.6.1. Effect of FSH decline on oocyte developmental competence
6.6.2. Conclusion
6.7. Acknowledgement
6.8. Grant support
6.9. Declaration of interest
6.10. References
6.11. Figures
6.12. Table
6.13. Supplemental data
7. Conclusion générale
8. Bibliographie

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