La biologie de la bioluminescence

  LA BIOLOGIE DE LA BIOLUMINESCENCE

GENERALITES SUR LA BIOLUMINESCENCE

La recherche fondamentale sur la bioluminescence a porté sur la manière dont certains organismes vivants parviennent à convertir de l’énergie chimique en lumière visible. De manière générale, le terme de luciférase est donné aux enzymes responsables de la réaction d’émission de lumière chez les bactéries, les coléoptères, les dinoflagellés et les cnidaires bien que les enzymes de ces différents systèmes ne présentent pas d’homologie entre elles. Le substrat de la réaction, un groupement prosthétique appelé luciférine, ne présente pas non plus d’analogie entre les différents systèmes bioluminescents sur le plan de la structure chimique . Cependant, il y a un aspect qui relie tous ces différents systèmes au niveau moléculaire : Toutes ces formes de bioluminescence impliquent une réaction d’oxydation catalysée par les luciférases entre l’oxygène moléculaire (O2) et les luciférines pour donner une molécule appelée oxyluciférine .

A chaque fois qu’un photon visible est émis à température ambiante par un organisme vivant ou par une réaction chimique dans un tube à essai, la réaction conduisant à la formation de l’état excité, puis par la suite à l’émission, doit être très exergonique. En effet, un photon à 500 nm (vert) correspond à une énergie de 60kcal par mol, c’est-à dire environ 8 fois l’énergie libérée lors de l’hydrolyse de l’ATP en ADP. L’émission réelle de lumière par chimioluminescence ou bioluminescence est une étape finale extrêmement rapide constituée habituellement d’une réaction en plusieurs étapes dont l’avant-dernière produit l’oxyluciférine dans un état excité. Toutes les réactions mettent en jeu un intermédiaire réactionnel composé d’un péroxyde de luciférine lié à la luciférase (Figure 1.2). La rupture de cette liaison fournit l’énergie nécessaire à l’émission de lumière (pour revue, Wilson et Hastings, 1998). Dans certains systèmes modèles (coléoptère et cnidaires, dont l’aequorine), l’hydropéroxyde donne un nouvel intermédiaire possédant un cycle dioxétanone (Figure 1.2). Ces intermédiaires (cycle à 4 atomes) sont riches en énergie et se dégradent en CO2 et un composé carbonylé, la plupart du temps excité, libérant ainsi une grande quantité d’énergie pour un coût initial faible (la rupture de la liaison O-O).

L’état excité de cet émetteur possède une très brève durée de vie. Il retient l’énergie de la réaction pendant quelques nanosecondes avant de la libérer sous la forme d’un photon. Cet état excité ne peut pas être distingué de l’état excité singulet (1er état excité) qu’on trouve en fluorescence qui résulte de l’absorption d’un photon par le chromophore dans l’état fondamental. C’est pour cette raison qu’en principe, le spectre d’émission par chimioluminescence correspond au spectre de fluorescence du produit de la réaction de la luciférine (oxyluciférine).Comme corollaire à cela, la réaction de bioluminescence ne peut pas être efficace si l’émetteur présente une faible efficacité de fluorescence. Dans une réaction luciférase/luciférine, les évènements cinétiques se déroulant à une échelle supérieure à la nanoseconde reflètent les processus précédant la formation de l’émetteur excité et non sa rapide désactivation radiative.

La luciférase peut elle-même influer sur le spectre d’émission en modifiant l’environnement du chromophore et donc ses états d’excitation. Chez la luciole, la substitution de certains acides aminés de la luciférase conduit à un décalage important du spectre d’émission. Dans les bactéries et les cnidaires, les chromophores de protéines accessoires associées aux luciférases peuvent servir d’émetteurs alternatifs comme c’est le cas de la GFP chez les cnidaires .

La biologie cellulaire et la régulation de la bioluminescence diffèrent selon les systèmes bioluminescents (Morin et Hastings, 1971). Dans certains cas comme les bactéries, le système luciférase est distribué dans tout le cytoplasme, tandis que chez d’autres, des cellules spécialisées, appelées photocytes, possèdent des organelles responsables de l’émission de lumière. Tandis que les bactéries émettent de la lumière en continu, dans beaucoup de systèmes, la luminescence se présente sous la forme de flash d’une durée typique de 0,1-1s. Cela nécessite une régulation rapide de la réaction dans laquelle les réactifs sont séquestrés de manière appropriée et mobilisés très rapidement.

DIVERSITE DES SYSTEMES BIOLUMINESCENTS

Chez les bactéries 

La bioluminescence bactérienne est un exemple d’une bioluminescence qui n’implique pas un intermédiaire dioxétanone. La luciférase catalyse l’oxydation d’un aldéhyde à longue chaine carbonée et d’une flavine mononucléotide réduite, FMNH2 (Figure 1.1 A). La première étape de la réaction catalytique est la formation d’un complexe hydropéroxyde de flavine–luciférase. Lors d’une seconde étape, l’aldéhyde réagit avec ce complexe pour former un intermédiaire dont la durée de vie détermine la cinétique de la réaction. L’émetteur identifié grâce à son spectre d’émission est le complexe enzyme-(4ahydroxyflavine).

Les luciférases de toutes les bactériennes bioluminescentes étudiées sont des hétérodimères. Elles sont codées respectivement par les gènes luxA et luxB, adjacents, dans l’opéron lux. Cet opéron contient entre autres également les gènes luxC, D et E qui codent pour des protéines qui interviennent dans la synthèse de l’aldéhyde. LuxA et luxB ont été clonés et exprimés en système hétérologue et utilisés comme gène rapporteur. La caractérisation de ce système a permis de mettre en évidence un mode de communication intercellulaire à la base de la détection du quorum. Les bactéries sécrètent une molécule diffusible, aussi appelé autoinducteur, qui agit comme une phéromone. Lorsque la concentration de bactérie en solution est suffisamment élevée, la concentration en autoinducteur est telle qu’elle induit l’expression des gènes de l’opéron lux et les bactéries deviennent alors luminescentes (pour revue Wilson et Hastings, 1998). Ainsi en détectant le niveau d’autoinducteur, les cellules sont capables d’estimer leur densité et d’initier des processus couteux en énergie comme l’expression de la luciférase et de ses partenaires, seulement lorsqu’elles sont suffisamment nombreuses pour être vues (Figure 1.3). C’est le cas des colonies hébergées par l’organe lumineux d’un hôte comme un poisson ou un calmar.

Chez les insectes

La plupart des insectes bioluminescents sont des scarabées (coleoptera) appartenant aux familles des Elateridae (tel que le taupin-click beetle en anglais), Phengodidae (le verchemin-de-fer, railroad worm en anglais) avec ses lanternes rouges et vertes est un exemple spectaculaire) et les Lampyridae, les lucioles (figure 1.4). La chimie de la réaction est probablement la même ou très similaire chez tous les coléoptères car leurs luciférases réagissent toutes pour donner de la lumière avec la luciférine de luciole (firefly luciferin).

La luciférine de luciole est un benzothiazoyl-thiazole (figure 1.1) qui est une molécule complètement différente de la luciférine des cnidaires. Cependant, une dioxetanone est l’intermédiaire crucial riche en énergie de la réaction. Tout d’abord, la luciférase catalyse la condensation de la luciférine avec de l’ATP en présence de Mg2+, puis la réaction de l’adenylate avec l’oxygène et la cyclisation du péroxyde. L’ATP fournit un bon groupe partant, l’AMP. La rupture de la dioxétanone (et non pas l’hydrolyse de l’adenylate) fournit l’énergie (§50kcal/mol) nécessaire pour générer l’état excité de l’oxyluciférine. Bien que la luciférine soit la même chez tous les scarabées, leur émission s’étend sur une large gamme de longueur d’onde, du vert à l’orange (voir au rouge dans le cas du ver-cheminde-fer). Il faut noter que la différence d’énergie entre des photons de 560 et 630 nm est de §6kcal/mol seulement. L’émission dépend probablement de l’énergie de l’état excité de l’oxyluciférine qui est lui-même influencé par la structure tertiaire du site catalytique.

La luciférase de luciole est une protéine monomérique de 62kDA ne possédant pas de groupe prosthétique. Son ADNc et celui de plusieurs autres luciférases de scarabées ont été clonés et exprimés dans E. coli ainsi que dans des cellules eucaryotes.

Chez les dinoflagellés

Les dinoflagellés sont des organismes unicellulaires du plancton pouvant libérer des toxines très puissantes (Figure 1.5). Parmi les nombreux organismes bioluminescents de cette famille, c’est Gonyaulax polyedra qui a été le plus étudié. Étant donné que sa luciférine (Figure 1.1) réagit avec toutes les luciférases de dinoflagellés testés jusqu’à présent, il constitue très probablement un exemple représentatif de ce groupe. La structure de la luciférine de dinoflagellé, élucidée chez Pyrocystis lunula, ne présente aucune homologie avec les autres luciférines. C’est un tétrapyrrole linéaire qui dérive probablement de la chlorophylle et qui est très sensible à l’autooxydation. L’émission de lumière a seulement lieu dans le cas de la réaction enzymatique.

Table des matières

LA BIOLUMINESCENCE DE L’AEQUORINE
1 INTRODUCTION
1.1 La biologie de la bioluminescence
1.1.1 Généralités sur la bioluminescence
1.1.2 Diversité des systèmes bioluminescents
1.1.3 Origine de la coelentérazine
1.2 La photoprotéine aequorine
1.2.1 Préparation de l’aequorine
1.2.2 Bioluminescence de l’aequorine indépendante du calcium
1.2.3 Activité luciférase de l’aequorine
1.2.4 Structure de l’aequorine
1.3 Le domaine de liaison du calcium Dans l’aequorine : l’EF-hand
1.3.1 Structure d’un domaine EF-hand
1.3.2 Affinité pour le calcium
1.3.3 Bioluminescence de l’aequorine dépendante du calcium
1.4 Mécanisme de la bioluminescence
1.4.1 De la liaison du calcium à l’émission de lumière
1.4.2 La chimie de la bioluminescence. Les espèces émettrices
1.4.3 L’émission de lumière par le coelentéramide
1.4.4 Transfert d’énergie de biolumnescence par resonance (BRET)
2. RESULTATS : ETUDE DE L’AEQUORINE PAR MUTAGENESE ALEATOIRE ET CRIBLAGE FONCTIONNEL
2.1 Présentation de l’article 1 : “Thermostable mutants of the photoprotéin aequorin obtained by in vitro evolution”
2.1.1 Sélection des mutants Bright et SloDK
2.1.2 Thermostabilité
2.1.3 Déclenchement de la bioluminescence par liaison du Ca2+à l’EF3
Article 1 : Thermostable mutants of the photoprotéine aequorin obtained by in vitro evolution
2.2 Présentation de l’article 2 : “Calcium dépendence of aequorine bioluminescence dissected by random mutagenesis”
2.2.1 Sensibilité calcique
2.2.2 Cinétique de la luminescence et quantité totale de photon
2.2.3 Rôle des résidus Gln168 et Leu170 dans la cinétique de bioluminescence
2.2.4 Dépendance au calcium de la bioluminescence de l’aequorine : un modèle
Article 2 : « Calcium dépendance of aequorine bioluminescence dissected by random mutagenesis » et informations supplementaires
2.3 Remarques générales
IMAGERIE DES ACTIVITES NEURONALES PAR BIOLUMINESCENCE AEQUORINE
1. INTRODUCTION
1.1 Utilisation de l’aequorine comme senseur calcique
1.1.1 Historique
1.1.2 La protéine de fusion GFP-aequorine
1.1.3 Avantages et inconvenients
1.2 Modulation cholinergique dans le néocortex
1.2.1 Architecture du réseau néocortical
1.2.2 L es connexions intracorticales et entrées-sorties
1.2.3. acetylcholine dans le réseau néocortical.
2. MATERIELS ET METHODES
Préparation de pseudovirion sindbis recombinant
Préparation des tranches néocorticales
Enregistrement de la bioluminescence
Enregistrements électrophysiologiques
Analyse des données de bioluminescence
Histochimie
3. RESUTATS :ETUDE DE LA MODULATION CHOLINERGIQUE DANS LE NEOCORTEX PAR IMAGERIE DE BIOLUMINESCENCE AEQUORINE
Caractérisation des réponses bioluminescentes en tranches de néocortex
Expression de GA
Réponses à la stimulation d’un seul neurone
Réponses à l’application de glutamate
Intégrité du réseau excitateur
Intégrité du réseau inhibiteur
Réponses du réseau aux stimulations électriques
Modulation cholinergique du réseau néocortical
Les agonistes muscariniques augmentent l’amplitude et la durée des réponses évoquées
Augmentation d’amplitude des réponses évoquées
Activités persistantes en couche V
Correspondance avec l’activité électrophysiologique
4. DISCUSSION
Imagerie de bioluminescence aequorine
Les effets muscariniques sur l’extension spatiale
Les effets muscariniques sur la durée
L’acétylcholine a-t-elle un effet biphasique inhibiteur/excitateur sur réseau cortical ?
ANNEXE
REFERENCES

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