La biogénèse des ribosomes

La biogénèse des ribosomes

 LES GÈNES DE L’ARNR

Les 200 copies des gènes de l’ARNr, réparties sur 5 chromosomes, sont organisées en tandem, c’est-à-dire que les unités répétées sont directement adjacentes les unes aux autres. Une unité d’ADNr contient environ 45 kilobases (kb) chez la souris et environ 43 kb chez l’humain. Elle est composée d’abord d’un segment non-transcrit d’environ 30 kb, l’Intergenic Spacer (IGS) qui contient les éléments régulateurs tels que le Spacer promoter (SpPr), l’enhancer repeat, le 47S promoteur ainsi que les terminateurs. Le 47S promoteur se compose de deux parties : l’Upstream Control Element (UCE) et le Core Promoter Element (CPE). Le CPE est la portion minimale requise pour une initiation de la transcription efficace; il est situé au site d’initiation de la transcription (TSS) (Moss et al., 2007). L’UCE, situé à 100 paires de bases (pb) en amont, permet, quant à lui, d’augmenter l’efficacité de la transcription (Learned et al., 1986). Le SpPr est connu pour stimuler la transcription ribosomique par RPI (Moss, 1983; de Winter et Moss, 1986; Caudy et Pikaard, 2002). Par contre, cela nécessite la présence de l’enhancer repeat entre le SpPr et le 47S promoteur (de Winter et Moss, 1987; Paalman et al., 1995). Le SpPr peut aussi servir de plateforme de recrutement pour les molécules de RPI qui sont ensuite livrées au 47S promoteur pour permettre une transcription rapide et efficace (Moss, 1983; Kuhn et Grummt, 1987). Il a été montré que les transcrits provenant de l’IGS sont essentiels à l’établissement et au maintien de la structure hétérochromatinienne d’un sous-ensemble d’ADNr (Mayer et al., 2006). L’unité d’ADNr est composée de plusieurs sites terminateurs : le T0 situé à 170 pb en amont de l’UCE et le situés en aval de la région codante (Grummt et al., 1986; Henderson et Sollner- Webb 1986). L’unité d’ADNr contient aussi une région transcrite comprenant le précurseur des ARNr d’environ 14 kb (le 47S), les External Transcribed Spacer (ETS) aux extrémités de la région transcrite et les Internal Transcribed Spacers (ITS) entre le 28S et le 5.8S et entre le 5.8S et le 18S (Figure

Les ARNr sont extrêmement conservés entre les espèces. Par contre, l’IGS, les ETS et les ITS ne le sont pas (Moss et al., 2007). Le séquençage de nouvelle génération du génome n’est pas parvenu à obtenir la séquence complète des ADNr étant donné leur nature répétitive et leur grand nombre. Par contre, une unité complète de l’ADNr a été publiée chez l’humain et la souris (Gonzalez et Sylvester, 1995; Grozdanov et al., 2003). Celles-ci sont disponibles sur GenBank aux numéros d’accession U13369.1 et BK000964.3 respectivement. Cela a été rendu possible grâce à la technologie de séquençage développée par Sanger dans les années 1970 (Sanger et al., 1977).

LA MÉTHYLATION AUX PROMOTEURS DES GÈNES DE L’ARNR

La méthylation de l’ADN, c’est-à-dire la méthylation d’une cytosine en 5-méthylcytosine (m5C), est une modification épigénétique considérée comme étant caractéristique de la répression de la transcription des gènes (Bernstein et al., 2007). Chez les vertébrés, cette marque survient principalement sur des séquences C-G connues sous le nom de CpG. Chez les plantes, la méthylation de l’ADN existe dans les contextes CHG et CHH où H est égal à A, C ou T. Chez les bactéries et les eucaryotes unicellulaires, des méthylations peuvent aussi survenir sur les adénines en N6-méthyladénine (m6A) (O’Brown et Greer, 2016). Environ 1 % des base totales sont méthylées, cela représente donc de 70 à 80 % de tous les CpG du génome (Bird, 2002). Il existe, par contre, des régions riches en CpG non méthylées aux promoteurs des gènes que l’on nomme des îlots CpG (CpG islands). On estime qu’il y a environ 30 000 îlots CpG dans le génome haploïde humain (Bird et al., 1987).

La méthylation des gènes est effectuée par trois DNA methyltransferases (DNMT) DNMT1, 3a et 3b. Il existe aussi DNMT2 dont le rôle n’est pas encore bien caractérisé et DNMT3l qui est inactif enzymatiquement parlant. DNMT3a et 3b sont responsables des méthylations aux sites CpG n’étant pas méthylés (méthylations de novo) tandis que DNMT1 est responsable de la maintenance, lors de la réplication, du patron de méthylation présent sur l’ADN (Klose et Bird, 2006). La méthylation de l’ADN par DNMT3a et 3b intervient dans plusieurs fonctions biologiques telles que l’empreinte parentale (imprinting), l’inactivation du chromosome X, l’extinction des transposons, le vieillissement ainsi que le cancer (Law et Jacobsen, 2010; Galamb et al., 2016). De plus, le profil épigénétique est hérité durant la division cellulaire grâce à DMNT1 (Meehan et Stancheva, 2001). La méthylation de l’ADN est un processus réversible (Zhang et al., 2017).

Le promoteur des gènes de l’ARNr de l’humain comprend 26 sites de méthylation potentiels (Pietrzak et al., 2016). Il a été montré par des études in vitro chez la souris que la méthylation d’un seul CpG, à la position -133 par rapport au site d’initiation de la transcription de l’ADNr, inhibe la transcription (Santoro et Grummt, 2001). Il a été suggéré que cela est dû au fait qu’UBF est incapable de se lier au promoteur. Il n’y a donc pas de recrutement de Selectivity Factor 1 (SL1) pour former le complexe de préinitiation ni d’initiation de la transcription. On estime qu’environ 50 % des gènes de l’ARNr sont méthylés, et donc éteints (silenced) dans les cellules différenciées (Santoro et Grummt, 2001).

LES FACTEURS DE RÉGULATION DE LA BIOGÉNÈSE DES RIBOSOMES

Les facteurs de régulation de la biogénèse des ribosomes sont nombreux. Premièrement, il y a UBF qui agit à titre de facteur architectural et qui permet la formation d’un complexe de préinitiation stable. Deuxièmement, on retrouve SL1 qui permet l’activation de la transcription en recrutant Transcription Initiation Factor IA (Rrn3). Troisièmement, RPI a pour rôle la transcription de l’ADNr à proprement parler. Quatrièmement, Rrn3 fait le lien entre SL1 et RPI. Finalement, Transcription Termination Factor I (TTF1) est responsable de la terminaison de la transcription ribosomique. La figure suivante représente les différents facteurs de régulation de la biogénèse des ribosomes (Figure 1.7).

UBF

UBF est une protéine de 97 kilo Dalton (kDa) composée de 764 acides aminés qui fait partie de la famille des protéines High Mobility Group box (HMG-box) (Bell et al., 1988; Jantzen et al., 1990). Les HMG-box sont composées de 3 hélices alpha. UBF comprend 6 de ces HMG-box permettant de lier l’ADNr sous forme de dimère (Figure 1.8) (Bachvarov et Moss, 1991; Bazett-Jones et al., 1994; Stefanovsky et al., 2001- 1). Les HMG-box sont connues pour lier l’ADN de façon non spécifique. Elles permettent d’ailleurs de moduler la structure de la chromatine en y effectuant une courbure. Pour cette raison, UBF est considéré comme étant un facteur architectural (Stefanovsky et Moss, 2008). UBF comprend un domaine de dimérisation en N-terminal et une queue acidique en C-terminal (Figure 1.8). Son domaine de dimérisation, tel que son nom l’indique, permet la dimérisation de la protéine (O’Mahony et al., 1992; Stefanovsky et al., 2001-1). Sa queue acidique, quant à elle, permet, lorsque phosphorylée, des interactions protéines-protéines avec certains complexes tels que le facteur SL1 (Tuan 1999).

Figure 1.8 – Structure d’UBF. Il possède un domaine de dimérisation en N-terminal et une queue acidique en C-terminal ainsi que 6 HMG-box. Les sites de phosphorylation de ERK sont indiqués par des astérisques jaunes. Extrait de Moss et al. 2007 et reproduit avec permission. UBF, aussi nommé UBF1, a un isoforme issu d’un épissage alternatif d’un gène, différant de 4.47 kDa, que l’on dénomme UBF2. Ces deux isoformes ont été caractérisés chez le rat, la souris, l’humain et le hamster (Figure 1.9) (O’Mahony et Rothblum, 1991). Malgré le fait que les deux isoformes sont présents en quantité équimolaire, seulement UBF1 est capable d’activer correctement la transcription ribosomique tant in vitro qu’in vivo; UBF2 est virtuellement inactif (Kuhn et al., 1994). En effet, UBF2 est tronqué de 37 acides aminés dans sa deuxième HMG-box et celle-ci joue un rôle important dans la liaison spécifique d’UBF à l’ADNr. UBF2 a donc plus de difficulté à lier l’ADN, ce qui pourrait expliquer pourquoi il n’a pas d’effet activateur sur la transcription ribosomique.

Table des matières

Résumé
Abstract
Table des Matières
Liste des Tableaux
Abréviations
Remerciements
Avant-propos ii
1 – Introduction
1.1 – Le nucléole
1.1.1 – Structure du nucléole
1.1.2 – NORs
1.1.3 – Fonctions du nucléole
1.2 – Le ribosome
1.2.1 – Structure du ribosome
1.2.2 – Ribosomopathies
1.3 – La biogénèse des ribosomes
1.3.1 – Les gènes de l’ARNr
1.3.2 – Transcription des gènes de l’ARNr
1.3.3 – Maturation des ARNr et assemblage du ribosome
1.3.4 – La méthylation aux promoteurs des gènes de l’ARNr
1.4 – Les facteurs de régulation de la biogénèse des ribosomes
1.4.1 – Introduction des différents facteurs de régulation
1.4.1 – UBF
1.4.2 – SL1
1.4.3 – RPI
1.4.4 – Rrn3
1.4.5 – TTF1
1.5 – La formation du complexe de préinitiation
1.5.1 – Mécanisme
1.5.2 – Initiation
1.5.3 – Élongation
1.5.4 – Terminaison
1.5.5 – Réinitiation
1.6 – La bio-informatique
1.6.1 – Historique de la bio-informatique
1.7 – Techniques de séquençage haut-débit
1.7.1 – Historique du séquençage
1.7.2 – Illumina HiSeq 2000
1.7.3 – ChIP-seq
1.7.4 – DNase-seq
1.8 – Hypothèses et objectifs
1.8.1 – Hypothèses du mémoire
1.8.2 – Objectifs du mémoire
2 – A deconvolution protocol for ChIP-seq reveals analogous enhancer structures on the mouse and human ribosomal RNA genes
2.1 – Avant-propos
2.2 – Résumé
2.3 – Abstract
2.4 – Introduction
2.5 – Materiels and Methods
2.5.1 – Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
2.5.2 – Analysis of ChIP sample by massively parallel sequencing
2.5.3 – ChIP-Seq data alignment
2.5.4 – Deconvolution protocol2.5.5 – Alignment of ChIP-nexus data
2.5.6 – Data availability
2.6 – Results
2.6.1 – ChIP-Seq profiles result from a convolution of the protein crosslinking and sequencing coverage profiles
2.6.2 – Deconvolution of ChIP-Seq data provides greatly improved resolution in protein-DNA interaction maps
2.6.3 – Reproducibility of deconvolution factor-binding profiles
2.6.4 – UBF positionning over the 47S transcribed region is not random
2.6.5 – Applying deconvolution ChIP-Seq to map the mouse rDNA Spacer Promoter
2.6.6 – Deconvolution ChIP-Seq also identifies a Spacer Promoter within the Human rDNA
2.6.7 – The chromatin contexts of the human and mouse Spacer Promoters are closely similar
2.6.8 – A common mode of TBP-complex binding at the human Spacer and 47S Promoters
2.6.9 – Identification of potential Enhancer Repeat in the human rDNA
2.7 – Discussion
2.8 – Acknowledgments
2.9 – Conflict of interest
2.10 – References
3.1 – Avant-propos
3.2 – Résumé
3.3 – Abstract
3 – Étude du rôle du facteur architectural UBF : une étude à la grandeur du génome
3.4 – Introduction
3.5 – Matériels et méthodes
3.5.1 – Description et utilisation de Bowtie2
3.5.2 – Description et utilisation de MACS2
3.5.3 – Description et utilisation de BEDOPS
3.5.4 – Description et utilisation de GREAT
3.5.5 – Description et utilisation de R
3.5.6 – Description et utilisation de HOMER
3.6 – Résultats
3.6.1 – Distance des pics d’UBF par rapport aux sites d’initiation de la transcription
3.6.2 – Chevauchement avec les marques d’histones actives et répressives 78
3.6.3 – Chevauchement avec les régions sensibles à la DNase I
3.6.4 – Perte d’accessibilité à la DNase I lors du KO d’UBF
3.6.5 – Colocalisation des gènes dérégulés dans les expériences de microarray avec les pics d’UBF plus enrichis avant le KO d’UBF
3.7 – Discussion
3.7.1 – UBF se retrouve près des sites d’initiation de la transcription
3.7.2 – UBF colocalise avec les marques d’histones actives
3.7.3 – UBF se retrouve aux endroits accessibles à la DNase I
3.7.4 – Il y a peu de perte d’accessibilité à la DNase I après le KO d’UBF
3.7.5 – La perte d’accessibilité à la DNase I après le KO d’UBF n’est pas en lien avec la dérégulation des gènes
4 – Discussion et Conclusion
4.1 – La procédure de déconvolution
4.2 – Utilisation de la déconvolution dans le but de cartographier le spacer promoter
4.3 – Utilisation de la déconvolution dans le but de cartographier les différents facteurs de transcription
4.4 – Rôle d’UBF à l’échelle du génome
Conclusion
Bibliographie
Annexe I – Script DeconvoNorm
Annexe II – Article publié 4e auteur
Annexe II – Résumé

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