La bactérie Clostridium acetobutylicum

La bactérie Clostridium acetobutylicum

Les membres du genre Clostridium, appartenant au phylum des firmicutes, sont des bactéries à gram positif anaérobies strictes. Les cellules végétatives ont la forme de bâtonnets et possèdent des flagelles. Ces bactéries sont également capables de générer des spores supportant des conditions extrêmes de pH et de température. Il existe des espèces pathogènes (C. perfringens, C. difficile) et certaines espèces sont capables de sécréter des toxines responsables de maladies telles que le botulisme ou le tétanos (C. botulinium et C. tetani, respectivement). Certaines clostridies acétogènes (C. ljungdahlii) sont aussi capables d’utiliser la voie de WoodLjungdahl pour la fixation du dioxyde de carbone (CO2) [6]. D’autres espèces, ne présentant pas de caractère pathogène, sont capables de produire des solvants d’intérêt industriel tels que le butanol ou l’acétone à partir de substrats carbonés. C’est le cas par exemple des espèces Clostridium beijerinckii, C. pasteurianum et C. acetobutylicum.

Clostridium acetobutylicum

La souche type C. acetobutylicum ATCC 824, présente dans la nature au niveau de certains sols et dans de nombreux végétaux, a suscité l’intérêt grâce à ses propriétés solvantogènes. En effet, à la suite des travaux de Chaim Weizmann, cet organisme a largement été utilisé pour la production d’acétone, intervenant dans la fabrication de cordite, explosif utilisé lors de la première Guerre Mondiale. La taille de la bactérie varie entre 2,4 x 0,6 µm et 4,7 x 0,9 µm en fonction de la souche considérée. Les spores, plus petites, sont facilement identifiables au microscope de par leur réfringence. Thermorésistants et tolérants à l’oxygène, ces spores peuvent germer après de longues périodes de latence, lorsque l’environnement redevient favorable à la croissance. Le génome de la souche C. acetobutylicum ATCC 824 a été entièrement séquencé [7], il est composé d’un chromosome de 3,94 Mb et d’un méga-plasmide de 192 kb (appelé pSOL) qui contient une majorité de gènes responsables de la production de solvants [8]. Ce génome a la particularité de contenir une faible teneur en bases G-C (31%) [7].

La bactérie C. acetobutylicum est capable de métaboliser de nombreuses sources carbonées mais n’est pas capable de réduire le sulfate ni de métaboliser la cellulose cristalline. Deux composés sont nécessaires à sa croissance sur un milieu synthétique : l’acide para-aminobenzoïque et la biotine (Vitamine B8). Sa température optimale de croissance est d’environ 35°C.

Métabolisme

Dans des conditions de culture discontinue, à pH non régulé, la souche C. acetobutylicum présente un métabolisme biphasique : une première phase appelée « acidogénèse » où sont produits les acides (acétate et butyrate) est suivie d’une phase appelée « solvantogénèse » où sont produits majoritairement les solvants (acétone, butanol et éthanol). La phase acidogène est caractérisée par une croissance rapide, avec un rapport de gaz produits H2/CO2 > 1, où la production des acides organiques permet la production d’ATP mais entraine une diminution du pH du milieu de culture des cellules. Cette baisse de pH entraine ensuite une inhibition de la croissance, le milieu de culture est alors dé-toxifié grâce à une consommation des acides (acétate et butyrate) précédemment produits, associée à la production des solvants. : acétone, butanol et éthanol à un ratio 3:6:1 Durant cette phase de solvantogenèse, la croissance est quasi-nulle et le pH du milieu de culture augmente légèrement. A la fin de la phase stationnaire, une sporulation des cellules est observée, permettant d’obtenir un état de dormance du microorganisme.

En conditions de cultures continues (chemostats), il est possible de maintenir la souche dans différents états physiologiques stables, en modulant le pH du milieu de culture et la source de carbone : phase d’acidogenèse à pH 6,5 et phase de solvantogenèse à pH 4,4 lors de la croissance sur glucose. Par ailleurs, il est possible de maintenir les cellules en phase d’’alcoologenèse, où il y a une grande disponibilité en nucléotides réduits (NADH et NADPH). La production d’éthanol et de butanol est observée mais sans production d’acétone. L’état d’alcoologenèse peut être obtenue de différentes façon : croissance à pH 6.6 sur glucose et glycérol (source de carbonne d’avantage réduite que le glucose) [9] ou par limitation l’activité hydrogénase. La diminution de l’activité in vivo de l’hydrogénase peut être obtenue de différentes manières : augmentation de la pression partielle en hydrogène, ajout de monoxyde de carbone, croissance en conditions de limitation en fer, ajout de methyl viologène ou de rouge neutre [10].

Métabolisme primaire

Les héxoses (le plus souvent du glucose) sont dégradés par la voie d’EmbdenMeyerhorf-Parnas (voie de la glycolyse), une mole d’hexose conduit à la formation de deux moles de pyruvate avec formation de deux moles d’ATP et de deux moles de NADH. Trois enzymes particulièrement importantes sont impliquées. La glycéraldéhyde 3- phosphate déshydrogénase (Gapdh) convertit le glycéraldéhyde 3-phosphate en 1,3- biphosphoglycérate avec production de deux moles de NADH. La phosphoglycérate kinase (Pgk) transforme le 1,3-biphosphoglycérate en 3-phosphoglycérate avec production d’une mole d’ATP et la pyruvate kinase (Pyk) convertit enfin le phosphoénolpyruvate en pyruvate avec production d’une mole d’ATP .

Les pentoses sont dégradés par la voie des pentoses-phosphate ; après transformation des sucres en pentoses 5-phosphate, ceux-ci sont convertis via une transaldolase et une transacétolase, en fructose 6-phosphate et glycéraldéhyde 3- phosphate pour rejoindre la voie de la glycolyse. Par ailleurs, il existe une voie métabolique l’utilisation du glycérol comme source de carbone. Le glycérol est d’abord phosphorylé par une glycérol kinase qui permet la formation de glycérol-3-phosphate qui est ensuite converti en dihydroxyacétone phosphate (Dhap) avec formation de NADH. Le Dhap peut ensuite être isomérisé en glyceraldehyde 3-phosphate pour entrer dans la voie d’Embden-Meyerhorf Parnas. Toutefois, il est à noter que la souche sauvage de C. acetobutylicum est incapable de croitre avec le glycérol comme unique source de carbone, en effet, l’excès de NADH produit est trop important pour être pris en charge par le métabolisme [9].

Voies métaboliques de production

La réaction phosphoroclastique

Le pyruvate issu de la glycolyse subit une décarboxylation oxydative pour former de l’acétyl-CoA, de la ferrédoxine réduite et du dioxyde de carbone. Cette réaction, catalysée par la pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase (Pfor) doit nécessairement être couplée à une autre réaction permettant la régénération de la ferrédoxine oxydée. La Pfor principale de C. acetobutylicum (codée par le gène CA_C2229 [11]) a été purifiée et caractérisée. Chaque sous unité de l’homodimère possède une masse de 123 kDa, contient 0.39 mole de TPP (thiamine pyrophosphate) et un centre [4Fe-4S]. Les Km pour le pyruvate et le coenzyme A sont de l’ordre du micromolaire [12]. Cependant, la régénération de la ferrédoxine oxydée doit ensuite être réalisée. En phase d’acidogènese, ce couplage est réalisé en grande majorité avec l’hydrogènase HydA catalysant alors la production de dihydrogène ; en phase de solvantogènese, la ferrédoxine réduite est réoxydée majoritairement via des ferrédoxine NAD(P)+ -réductase pour la production de nucléotides réduits .

La voie du métabolisme intermédiaire

L’acétylCoA est le métabolite charnière sur lequel vont se brancher les voies métaboliques permettant la production des acides et des solvants . Le métabolisme intermédiaire, qui permet la formation de butyryl-CoA à partir de l’acétyl-CoA fait intervenir quatre enzymes : la thiolase, la β-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase, la crotonase et la butyryl-CoA déshydrogénase. La thiolase (Acétyl-CoA acétyltransférase, Thl) est l’enzyme clé du métabolisme intermédiaire, cette enzyme permet la condensation de deux molécules d’acétyl CoA en acétoacétyl-CoA. L’activité de cette enzyme va distribuer le flux de carbone vers les composés à deux carbones (acétate et éthanol), à trois carbones (acétone) ou à quatre carbones (butyrate et butanol). Chez C. acetobutylicum, on retrouve deux gènes codant pour des thiolases, toutefois seule l’activité liée à l’expression du gène thlA (CA_C2873) est physiologiquement impliquée dans le métabolisme [13]. Cette enzyme est essentielle pour les cellules et il a été démontré que l’inactivation de ce gène est impossible [14].

La thiolase (Thl) est une enzyme homo-tétramerique composée de quatre sousunités de 44 kDa chacune [15,16]. L’implication dans l’activité de cette enzyme, de certains domaines ou résidus particuliers, a pu être mise en évidence. Il existe un domaine en forme de boucle impliqué dans la liaison au CoASH, les résidus Cys88, Cys378 et His348 sont impliqués dans l’activité catalytique et les résidus Arg133, His156 et Gly222 sont impliqués dans la sensibilité au CoA-SH [13] ; l’enzyme étant normalement inhibée par des concentrations de CoA-SH de l’ordre du micromolaire. Il a été montré que, de façon surprenante, le Km apparent de la thiolase pour l’acétoacétyl-CoA (0,032 mM lors de la réaction de thyolise) était environ dix fois plus faible que le Km apparent pour l’acétyl-CoA (0,27 mM lors de la réaction de condensation). De plus, la réaction de condensation est défavorable d’un point de vue thermodynamique [17], ceci implique la necessité de réaction permettant de déplacer l’équilibre en faveur de la production d’acétoacétyl-CoA in vivo . En phase d’acidogènese, la thiolase entraine la production de butyrate ; l’acétyl-CoA est alors moins disponible pour la phosphotransacétylase impliquée dans la production d’acétate. L’activité de la thiolase entraine donc des variations dans le niveau d’énergie disponible pour la cellule (production d’une mole d’ATP par mole d’acétyl-CoA lors de la production d’acétate qui est diminué par deux lors de la production de butyrate) .

Le principal mécanisme de régulation de cette enzyme est considéré comme étant le rapport relatif entre l’acétyl-CoA et le CoA-SH, qui est pour ce dernier, inhibiteur de l’enzyme. Le pH ne semble pas être un élément de régulation de la thiolase, cependant le niveau d’activité de la thiolase est deux fois supérieur en phase de solvantogènese par rapport à la phase d’acidogènese [16] ; et cette enzyme est aussi impliquée dans la re-consommation des acides puisqu’elle influence le niveau d’acétoacétyl-CoA disponible pour la CoA-transférase.

Récemment, la résolution de la structure de la thiolase de C. acetobutylicum dans différents états rédox a montré que cette enzyme était régulée, par les conditions oxydantes ou réductrices des cellules, à travers un mécanisme de bascule entre deux états, par la formation réversible d’un pont disulfure entre les résidus cystéine Cys88 et Cys378 qui rend l’enzyme inactive [18].

L’acétoacétyl-CoA est ensuite pris en charge par la β-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase (Hbd) qui catalyse la formation de β-hydroxybutyryl-CoA. Cette enzyme, codée par le gène hbd (CA_C2708), fonctionne physiologiquement avec le NADH comme cofacteur [19]. Par ailleurs, cette enzyme n’est pas essentielle et l’inactivation du gène hbd entraine l’obtention de souches produisant majoritairement de l’éthanol [20]; en effet, l’inactivation de Hbd interrompt les voies de production de butyrate et de butanol situées en aval. L’enzyme CbHbd de Clostridium butyricum, dépendante du NADH, est plus efficace que celle de C. acetobutylicum et les mutations K50A, K54A et L232Y ont encore permis d’augmenter le rapport Kcat/Km de cette enzyme, d’un facteur cinq environ. [21] Par ailleurs, l’enzyme retrouvée chez Clostridium kluyveri est, elle, dépendante du NADPH [22].

La crotonase (Crt), codée par le gène crt (CA_C2712), permet ensuite la déshydratation du β-hydroxybutyryl-CoA en crotonyl-CoA. La butyryl-CoA déshydrogénase (Bcd), codée par le gène bcd (CA_C2711) catalyse enfin la réduction du crotonyl-CoA en butyryl-CoA. Il a été montré chez C. kluyveri que cette activité se faisait de manière simultanée avec la réduction de la ferrédoxine par le NADH, ceci grâce à un complexe formé entre Bcd les protéines EtfA/EtfB pour « electron transfer flavoprotein » (codées par les gènes etfA (CA_C2709) et etfB (CA_C2710)) [23]. Cette réaction correspond à un des premiers exemples de conservation d’énergie par bifurcation d’électrons. En effet, au sein du complexe Bcd-EtfA/B, la réduction exergonique du crotonyl-CoA en butyryl-CoA est couplée à la réduction endergonique de la ferrédoxine par deux moles de NADH (Figure 3). Le complexe Bcd-EtfA/B chez C. kluyveri est hétérotétramérique, formé de quatre sous unités Bcd (41 kDa), deux sous unités EtfA (36 kDa) et deux sous unités EtfB (28 kDa). On retrouve au sein de ce complexe au moins quatre groupes prosthetiques FAD (Flavine adénine dinucléotide) [24]. Les activités butyryl-CoA deshydrogènase du complexe Bcd-EtfA/B de C. acetobutylicum ont été mesurées et il apparait que l’activité du complexe est strictement dépendante du NADH [11].

Table des matières

INTRODUCTION
1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. La bactérie Clostridium acetobutylicum
1.1.1. Introduction
1.1.2. Clostridium acetobutylicum
1.1.3. Métabolisme
1.1.3.1. Métabolisme primaire
1.1.3.2. Voies métaboliques de production
1.1.3.2.1. La réaction phosphoroclastique
1.1.3.2.2. La voie du métabolisme intermédiaire
1.1.3.3. La voie de production des acides
1.1.3.3.1. La voie de l’acétate
1.1.3.3.2. La voie du butyrate
1.1.3.4. La voie de production des solvants
1.1.3.4.1. La production des alcools
1.1.3.4.2. La production de l’acétone
1.1.2.5. La production de lactate, d’acétoïne et de glycérol
1.1.3.5. Métabolisme énergétique
1.1.3.5.1. Protéines et enzymes du flux électronique
1.1.3.5.2. Induction de la solvantogènese
1.1.4. Métabolisme de l’azote
1.2. Biosynthèse des centres fer-soufre
1.2.1. Introduction
1.2.2. Voies de biosynthèse des centres fer-soufre
1.2.2.1. Le système ISC
1.2.2.2. Le système SUF
1.2.2.3. La régulation des systèmes
1.2.3. Particularités des systèmes de biosynthèses chez les clostridies et chez C. acetobutylicum
1.3. Les ferrédoxines
1.3.1. Introduction
1.3.2. Classification des ferrédoxines
1.3.2.1. Ferrédoxines contenant des centres [2Fe-2S]
1.3.2.2. Ferrédoxines contenant des centres [4Fe-4S]
1.3.2.2.1. Phylogénie des ferrédoxines bactériennes
1.3.2.2.2. Ferrédoxine bactérienne type
1.3.2.3. Autres protéines de transfert d’électrons
1.3.2.3.1. Protéines de Rieske
1.3.2.3.2. HIPIPs
1.3.2.3.3. Rubredoxine
1.4. Les hydrogénases
1.4.1. Introduction
1.4.2. Classification
1.4.3. Hydrogénases sans centre fer-soufre
1.4.4. Hydrogénases à nickel-fer
1.4.4.1. Site et cycle catalytique
1.4.4.2. Voies de transfert d’électrons
1.4.4.3. Diversité des [NiFe] hydrogénases
1.4.4.4. Maturation des [NiFe] hydrogénases
1.4.5. Les hydrogénases à fer
1.4.5.1. Introduction
1.4.5.2. Classification, diversité et phylogénie des [Fe-Fe] hydrogénases
1.4.5.3. Evolution structurale des [Fe-Fe] hydrogénases
1.4.5.4. L’hydrogénase à fer CaHydA de Clostridium acetobutylicum
1.4.5.4.1. Structure Globale
1.4.5.4.2. Domaine H et site catalytique
1.4.5.4.3. Cycle catalytique
1.4.5.4.4. Environnement du Cluster H
1.4.5.4.5. Cystéine 298
1.4.5.4.6. Voie de transfert des protons
1.4.5.4.7. Voie de transfert du dihydrogène
1.4.5.4.8. Sensibilité à l’oxygène
1.4.5.4.9. Domaine F et centres fer-soufre accessoires
1.4.5.5. Maturation des hydrogènases
1.4.5.5.1. Introduction
1.4.5.5.2. Les différentes protéines de maturation
1.4.5.5.2.1. HydF
1.4.5.5.1.2. HydG
1.4.5.5.1.3. HydE
1.4.5.5.3. Mécanisme global de maturation des [FeFe] hydrogénases
1.4.5.5.4. Maturation in vitro
1.4.6. Caractérisation des hydrogénases
1.4.6.1. Caractérisation biochimique
1.4.6.2. Electrochimie directe des protéines
1.4.6.3. Caractérisation spectroscopique
2. MATERIEL ET METHODES
2.1. Souches et plasmides utilisés
2.2. Milieux de cultures et conditions de croissance
2.2.1. Conservation des souches
2.2.2. Conditions de croissance
2.2.3. Milieux de culture
2.2.3.1. Milieux de culture pour E. coli
2.2.3.1.1. Conditions de culture pour l’expression de la ferrédoxine recombinante
2.2.3.2. Milieux de culture pour C. acetobutylicum
2.2.3.2.1. Cultures sur milieu solide et milieu liquide
2.2.3.2.2. Cultures discontinues en bioréacteur
2.3. Techniques de génie génétique
2.3.1. Préparation d’ADN plasmidique
2.3.2. Techniques de clonage
2.3.3. Amplification de fragments d’ADN par réactions de PCR
2.3.4. Table des oligonucléotides utilisés
2.3.5. Transformation de souches E. coli par choc thermique
2.3.6. Transformation de souches C. acetobutylicum ΔCA_C1502
2.3.7. Constructions plasmidiques
2.3.7.1. pPH-CaHydA-LL-C-Tag_catP-UPP
2.3.7.2. pTSH-CrHydA1_Opt_C-Tag_catP-UPP
2.3.7.3. Construction des plasmides des enzymes variants de CaHydA
2.3.7.4. Enzymes chimériques
2.4. Méthodes de biochimie
2.4.1. Préparation des extraits acellulaires
2.4.2. Récolte anaérobie des cellules
2.4.2.1. Récolte anaérobie des cellules de culture E. coli
2.4.2.2. Récolte anaérobie des cellules à partir du fermenteur
2.4.3. Purification des hydrogénases
2.4.3.1. Protocole initial
2.4.3.2. Adaptation du protocole de purification
2.4.3.3. Protocole final
2.4.4. Purification de la ferrédoxine
2.4.5. Analyse des protéines
2.4.5.1. Concentration en protéines
2.4.5.2. Analyse sur gel de polyacrylamide
2.4.5.2.1. Préparation des échantillons
2.4.5.2.2. Analyse en conditions SDS-PAGE
2.4.5.2.3. Western-Blot
2.4.5.3. Analyse par Spectrophotométrie en ultra-violet
2.4.5.4. Dosage des atomes de fer
2.4.5.5. Analyse des protéines par dichroïsme circulaire
2.4.6. Tests d’activités
2.4.6.1. Test d’activité de consommation du dihydrogène
2.4.6.2. Tests d’activité de production du dihydrogène
2.4.6.3. Réaction d’échange proton-deutérium
2.4.6.4. Dosage des activités enzymatiques par electrochimie directe
2.4.6.5. Tests de l’activité enzymatique de la thiolase
2.5. Dosage des produits de fermentation
2.6. Bio-informatique
2.7. Modélisation moléculaire
3. RESULTATS
3.1. Conception et synthèse des variants de l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum et d’hydrogénases chimèriques
3.1.1. Introduction
3.1.2. Hydrogénases variants des centres fer-soufre
3.1.3. Enzymes chimériques
3.1.3.1. Chimère HydX_1
3.1.3.2. Chimère HydX_3
3.2. Purification de l’enzyme CaHydA de C. acetobutylicum
3.2.1. Introduction
3.2.2. Système d’expression et de purification initial
3.2.3. Identifications des sources de variation des activités spécifiques
3.2.4. Amélioration du système de production, extraction et purification
3.2.5. Conclusion
3.3. Production et purification de la ferrédoxine de C. acetobutylicum
3.3.1. Introduction
3.3.2. Construction d’une souche E. coli pour la production de ferrédoxine en anaérobiose stricte
3.3.2.1. Souche E. coli BL21 DE3 ΔiscR::Kana Codon+ + pET21c_CAC0303_ST
3.3.2.2. Souche E. coli MG1655 ΔiscR::Kana pthl_Fd-LL-C-Tag
3.3.3. Résultats
3.3.3.1. Purification de la ferrédoxine Fd-LL-C-Tag
3.3.3.2. Validation de la fonctionnalité de la ferrédoxine Fd-LL-C-Tag
3.4. Caractérisation des variants de l’enzyme
3.4.1. Introduction
3.4.2. Purifications et tests d’activité
3.4.2.1. L’hydrogénase HydA_ΔDA
3.4.2.2. L’hydrogénase HydA_C100A
3.4.2.3. L’hydrogénase HydA_C48A
3.4.2.4. L’hydrogénase HydA_H93C
3.4.2.5. L’hydrogénase HydA_ΔFS2
3.4.2.6. L’hydrogénase HydX_1
3.4.3. Rôle du Domaine F chez les hydrogénases à fer
3.4.3.1. Repliement des protéines et dosage du fer
3.4.3.2. Spectres UV-visible
3.4.3.3. Caractérisation électrochimique
3.4.3.4. Activité des enzymes en solution
3.4.3.4.1. Activité de consommation et de production du dihydrogène
3.4.3.4.2. Activités d’échange proton/deutérium en solution
3.4.3.4.3. Voies de transfert des protons
3.4.4. Paramètres cinétiques des différents variants de l’enzyme et interactions avec les partenaires d’oxydoréduction physiologiques et artificiels
3.4.4.1. Enzyme HydA_ΔDA et impact du Domaine F
3.4.4.2. Interaction avec le partenaire rédox physiologique : la ferrédoxine
3.4.4.3. Biais catalytique
3.4.5. Modélisation moléculaire et interaction avec les partenaires d’oxydoréduction
3.4.5.1. Méthyl viologène
3.4.5.2. Ferrédoxine
3.4.6. Conclusion
3.5. Dessin, conception et développement d’une souche de C. acetobutylicum dont la croissance est dépendante de la surexpression de l’hydrogénase
3.5.1. Introduction
3.5.2. Stratégie et conception de la souche
3.5.3. Résultats
3.5.3.1. Construction de la souche-outil de criblage
3.5.3.2. Utilisation et validation de l’outil de criblage
3.5.3.3. Tests d’activités des enzymes
3.5.3.4. Contrôle de la souche-outil
3.5.3.4.1. Profils de fermentation des différentes souches
3.5.3.4.2. Tests 5-FU
3.5.3.4.3. Tests d’activité thiolase
3.5.3.5. Profils produits de la nouvelle souche
3.5.4. Conclusion
CONCLUSION GENERALE

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