Soutenance mémoire
La 7β-hydroxy-épiandrostérone
Les stéroïdes
Nomenclature
Les hormones stéroïdiennes dérivent toutes du cholestérol constitué de 27 carbones avec une chaîne latérale (carbones 20 à 27) liée au carbone 17 . Ils sont formés d’un squelette hydrophobe comportant trois cycles hexagonaux (A, B, C) et un cycle pentagonal (D), le stérane ou cyclopentano-perhydro phénanthrène. Le noyau pregnane comporte 21 carbones et constitue le noyau de la prégnénolone, de la progestérone, des glucocorticoïdes et des minéralocorticoïdes, obtenu par l’élimination d’une partie de la chaîne latérale. Le noyau androstane à 19 carbones des androgènes résulte, quant à lui, de la suppression de toute la chaîne latérale. Enfin, le noyau estrane de 18 carbones des estrogènes découle de la conversion du cycle A en une structure aromatique impliquant l’élimination du méthyle en 19.
Les enzymes impliquées
La transformation du cholestérol en stéroïdes nécessite de nombreuses réactions enzymatiques impliquant deux superfamilles de protéines :
– Les cytochromes P450 (CYP) (Nelson et al, 1996) catalysent des réactions d’hydroxylation suivies ou non de réactions de clivage. Ce sont des monooxygénases utilisant le NADPH comme donneur d’électrons pour la réduction de l’oxygène moléculaire. Ces enzymes sont mitochondriales (CYP11A1) ou microsomales (CYP7B1, CYP2A1) ;
– Les réductases et les oxydo-réductases d’alcool à chaîne courte. Ces dernières appartiennent à la famille de la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (HSD), principale HSD dans les surrénales et les gonades (Penning, 1997). Elles catalysent des réactions de réduction du stéroïde et des fonctions cétones et d’oxydation des groupements hydroxyles en présence de NADH/NAD+ ou de NADPH/NADP+.
Stéroïdogenèse et biosynthèse des androgènes et des estrogènes
La première étape de la stéroïdogenèse est la transformation du cholestérol en prégnénolone par le CYP11A1 localisé dans la membrane mitochondriale interne (Rone et al, 2009) qui catalyse trois réactions d’oxydation successives : deux hydroxylations en C20 et C22 suivies d’une réaction de clivage de la liaison C20-C22. La prégnénolone synthétisée est convertie en progestérone par la 3β-HSD. Après hydroxylation en 17α par la 17α-hydroxylase (ou CYPC17), ces deux composés vont conduire à la synthèse des minéralocorticoïdes et des glucorticoïdes après l’action de trois hydroxylases et d’une synthase . La déhydroépiandrostérone (DHEA) qui dérive de la transformation de la 17α hydroxyprégnénolone par la 17,20-lyase est sécrétée en grandes quantités au niveau des glandes surrénales après l’adrénarche et circule essentiellement sous sa forme sulfatée (DHEA-S). La DHEAest convertie en androgènes et estrogènes actifs dans les gonades et certains tissus périphériques.
La 3β-HSD et la 17β-HSD catalysent ensuite la transformation de la DHEA en testostérone qui est la forme circulante des androgènes. La 5α-réductase convertit, dans les tissus cibles, la testostérone en un androgène actif capable de lier les récepteurs cytosoliques, la dihydrotestostérone (DHT). L’épiandrostérone est obtenue à partir de la DHT après l’action successive de la 3β-HSD et de la 17β-HSD. Les estrogènes sont synthétisés à partir des androgènes par aromatisation. L’aromatase est une enzyme clé, présente dans les gonades et quelques tissus périphériques, qui convertit la testostérone et l’androstènedione respectivement en 17β-estradiol (E2) et en estrone (Figure 3). Dans le placenta et le foie, ces deux estrogènes peuvent être transformés en estriol. L’E2, estrogène majoritaire, est le ligand naturel des récepteurs aux estrogènes (REs). Les stéroïdes 3β-hydroxylés peuvent subir une 7-hydroxylation conduisant à de nouveaux métabolites essentiels. Par exemple, l’hydroxylation en position 7 du cholestérol dans le foie est la première étape requise pour la production des acides biliaires.
Les dérivés 7-hydroxylés de la DHEA et de la testostérone
Synthèse des dérivés 7-hydroxylés
Les dérivés 7-hydroxylés de la DHEA et de ses dérivés ont longtemps été considérés comme des métabolites d’élimination. Ces 20 dernières années, un certain nombre de travaux ont montré une activité biologique de ces stéroïdes 7-hydroxylés comme des effets anti-glucocorticoïdes (Muller et al, 2006a ; Hampl et al, 2000) ou immunomodulateurs (Sterzl et al, 2003 ; Morfin, 2002 ; Morfin et al, 2000). Le CYP7B1, exprimé dans de nombreux tissus (Chalbot et Morfin, 2006), catalyse la 7αhydroxylation des 3β-hydroxy-stéroïdes endogènes (Kim et al, 2004) (Figure 4). La 11βHSD1, uniquement exprimée dans le réticulum endoplasmique des tissus sensibles aux glucocorticoïdes et produite en faible quantité (Jacolot et al, 1981), est responsable de l’interconversion 7α/7β (Chalbot et Morfin, 2005 ; Hennebert et al, 2007, Muller et al, 2006b). Ces métabolites 7-hydroxylés, uniquement synthétisés au niveau de tissus cibles, sont détectables dans le sang de femmes et d’hommes sains et leur quantité est âge- et sexedépendant (Hill et al, 2005). Le CYP2A1 catalyse la 7-hydroxylation de la testostérone (Figure 4) au niveau des testicules et de la prostate (Sonderfan et al, 1989 ; Kurose et al, 1999). La 7α-hydroxytestostérone modulerait l’activité de la 11β-HSD1 dans les cellules de Leydig (Hu et al, 2010) et inhiberait également celle de la 5α-réductase et de la 3β HSD dans les testicules (Rosness et al, 1977). Depuis de nombreuses années, les recherches menées par le Professeur Morfin portent sur les dérivés 7-hydroxylés de la DHEA. Une action anti-oxydante de la 7α-hydroxy-DHEA dans l’intestin (Pélissier et al, 2004 et 2006) ainsi qu’un rôle dans le contrôle de la concentration de glucorticoïdes via son interaction avec la 11β HSD1 (Muller et al, 2006b ; Hennebert et al, 2007) ont été mis en évidence. De plus, ce stéroïde également produit au niveau de l’hippocampe par le CYP7B1 pourrait jouer un rôle dans la maladie d’Alzheimer. En effet, une diminution de l’activité du CYPB1 et, par conséquent du taux de 7α-hydroxy-DHEA, contribuerait au développement de la maladie (Yau et al, 2003 ; Jellinck et al, 2005). Partant de ces observations, les travaux du laboratoire ont été orientés vers d’autres métabolites de la DHEA, les dérivés 7-hydroxylés de l’épiandrostérone. Son dérivé 7αhydroxylé est un substrat de la 11β-HSD1 et module l’activité de cette enzyme (Hennebert et al, 2007). La 7β-hydroxy-épiandrostérone, quant à elle, exerce une action neuroprotectrice dans des modèles d’ischémie cérébrale (Pringle et al, 2003) et de la maladie d’Alzheimer (Dudas et al, 2004) chez la souris. Elle présente également des propriétés anti-inflammatoires in vitro (Le Mée et al, 2008 ; Davidson et al, 2008) et in vivo (Hennebert et al, 2008) .
Synthèse de la 7β-hydroxy-épiandrostérone
La 11β-HSD1 responsable de la 7β-épimérisation est exprimée uniquement dans le réticulum endoplasmique des tissus sensibles aux glucocorticoïdes (Jacolot et al, 1981). De ce fait, la 7β-hydroxy-épiandrostérone n’est produite qu’au niveau de tissus cibles. Les concentrations faibles et, par conséquent, un seuil de rendement d’extraction trop faible de ce stéroïde a nécessité le développement de techniques de synthèse. La première approche développée a été une synthèse biochimique à partir de la DHT. La DHT est en premier lieu transformée en épiandrostérone par des bactéries E.Coli transformées pour exprimer les enzymes essentielles à cette synthèse. La conversion de l’épiandrostérone extraite en 7β-hydroxy-épiandrostérone est ensuite réalisée grâce au rhizopus nigricans. Cette moisissure exprime les enzymes nécessaires à la mono-hydroxylation de l’épiandrostérone (Chambers et al, 1973). Cette technique permet l’obtention de la 7β-hydroxy-épiandrostérone avec un rendement maximal de 48%. D’autres métabolites (7α- et 6α/β-hydroxyépiandrostérone) sont également synthétisés, nécessitant une séparation des différents produits. Le faible rendement de 7β-hydroxy-épiandrostérone obtenu nécessite l’utilisation d’une grande quantité de solvant pour l’extraction. Le mauvais rendement de la synthèse biochimique a conduit au développement d’une méthode chimique pour une production pondérale. Pour cela, notre équipe a collaboré avec le laboratoire de transformations chimiques et pharmaceutiques dirigé par la Professeure C. Ferroud au Cnam pour élaborer une synthèse chimique stéréosélective et reproductible (Ricco et al, 2011). Cette synthèse se fait en cinq étapes et permet l’obtention à partir de la DHEA d’une quantité de 7β-hydroxy-épiandrostérone de l’ordre du gramme avec un rendement de 63%.
7β-hydroxy-épiandrostérone et résolution de l’inflammation
Inflammation et production des prostaglandines
La production tissulaire de prostaglandines (PGs) est déclenchée lors de l’inflammation. La synthèse des PGs implique la libération de l’acide arachidonique incorporé dans les phospholipides membranaires sous l’action de la phospholipase A2 cytosolique . La cyclooxygénase 1 (COX1) constitutive et la COX2 induite en réponse à un stress cellulaire oxydent l’acide arachidonique en PGG2 qui est par la suite convertie par peroxydation en PGH2, un intermédiaire oxygéné instable (Simmons et al, 2004).
La PGH2 est ensuite transformée en thomboxane A2 par la thromboxane synthase, essentielle à l’agrégation plaquettaire, ou en prostaglandines PGE2 et PGD2 et PGI2 ou prostacycline par l’action d’enzymes spécifiques, les PG synthases (PGES, PGDS, PGIS) (Simmons et al, 2004 ; Hata et Breyer, 2004). La PGE2, produite au début de l’inflammation, est responsable des effets pro-inflammatoires par sa liaison à ces récepteurs membranaires EP (1-4). Elle entraîne notamment une augmentation de la perméabilité vasculaire, une vasodilatation, une inhibition de l’agrégation plaquettaire et la formation d’un oedème en présence d’autres médiateurs de l’inflammation (histamine, bradykinine) (Davies et al, 1984). Elle va également participer à la mise en place et à la stimulation de la réponse immunitaire (Chizzolini et Brembilla, 2009 ; Yao et al, 2009 ; Qian et al, 2011 ; Oshima et al, 2011).
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Table des matières
I. INTRODUCTION
PARTIE 1.La 7β-hydroxy-épiandrostérone
A. Les stéroïdes
1. Nomenclature
2. Les enzymes impliquées
3. Stéroïdogenèse et biosynthèse des androgènes et des estrogènes
B. Les dérivés 7-hydroxylés de la DHEA et de la testostérone
1. Synthèse des dérivés 7-hydroxylés
2. Synthèse de la 7β-hydroxy-épiandrostérone
C. 7β-hydroxy-épiandrostérone et résolution de l’inflammation
1. Inflammation et production des prostaglandines
2. 7β-hydroxy-épiandrostérone et production des prostaglandines
3. Double compétence des androgènes et modulation de la production des PGs par les estrogènes
PARTIE 2.Les récepteurs aux estrogènes
A. Les récepteurs aux estrogènes nucléaires : REα et REβ
1. Structure des REs
a) Le domaine A/B
b) Le domaine C
c) Le domaine D
d) Le domaine E/F
2. Les ligands des REs
3. Rôles biologiques des REs
4. Mécanismes moléculaires d’action des REs
a) Activation génomique
b) Activation non génomique
5. Les partenaires de la transcription médiée par les REs
a) Les co-activateurs et les co-répresseurs
b) Influence des modifications post-traductionnelles sur l’activité du REα
B. Le GPR30, un nouveau récepteur membranaire aux estrogènes
1. Localisation cellulaire
a) Réticulum endoplasmique et/ou membrane plasmique ?
b) Un GPR30 nucléaire ?
2. Le GPR30, un récepteur des estrogènes ?
3. Voies de signalisation du GPR30
4. Rôle biologique du GPR30
C. Les récepteurs aux estrogènes, des médiateurs de l’inflammation
1. Les récepteurs nucléaires aux estrogènes : REα et REβ
2. Le GPR30
D. Pharmacologie des REs
1. Les anti-aromatases : inhibiteurs de la biosynthèse des estrogènes
a) L’aminoglutéthimide (1ère génération)
b) Le formestane ou 4-hydroxy-androstènedione (2ème génération)
c) Le létrozole, l’anastrozole et l’exémestane (3ème génération)
2. Les modulateurs sélectifs des récepteurs aux estrogènes (SERMs)
a) Le tamoxifène, traitement de référence
b) Les autres SERMs
II. CONTEXTE DE L’ETUDE / RESULTATS
A. Contexte bibliographique
B. Objectifs
C. Résultats
III. DISCUSSION / PERSPECTIVES
IV. BIBLIOGRAPHIE
V. ANNEXES
