Isolement et purification des souches

Etat de l’art et objectifs de l’étude

Les algues sont des organismes photosynthétiques qui se développent en suspension principalement dans des solutions aqueuses (Wen and Johnson, 2009), et qui sont capables de convertir l’énergie lumineuse et une source de carbone le dioxyde de carbone ou « CO2 » en un ensemble de matières organiques ou « biomasse ». On distingue deux catégories principales d’algues : les « macroalgues » et les « microalgues ». Comme son nom l’indique, les microalgues sont des organismes microscopiques non visibles à l’oeil nu. Leur taille est de l’ordre de quelques micromètres. Leur existence est révélée lors d’une proliférations massives (blooms) dues à des conditions favorables formant parfois des « eaux colorées » en rouge, brun ou vert. Dans la nature, il existe une biodiversité très vaste de microalgues.

On estime le nombre d’espèces existantes entre 200000 et plusieurs millions, ce qui est très supérieur aux 250000 espèces de plantes supérieures recensées. Une telle diversité non exploitée constitue un réel potentiel pour la recherche et l’industrie. Ces microorganismes photosynthétiques sont considérés comme les premiers producteurs d’oxygène indispensable à la respiration de la majorité des êtres vivants. Leur existence remonte dans les océans à plus de trois milliards d’années, ils sont à l’origine de la transformation de la composition atmosphérique (fixation de CO2 et rejet de O2) et ont permis la vie végétale et animale sur notre planète. Souvent désignées sous la dénomination de « Phytoplancton » (Sumi, 2009), les microalgues représentent une source d’alimentation pour les premières étapes larvaires (Coutteau et al., 1997) comme pour les êtres humains de par leur composition biochimique adaptée (Brown et al., 1997). Ces micro-usines photosynthétiques présentent des caractéristiques similaires aux plantes terrestres, mais leur structure morphologique permettant une meilleure accessibilité de l’eau, du dioxyde de carbone et des autres nutriments, leur permet d’avoir une efficacité photosynthétique supérieure (Carlsson et al., 2007).

Les microalgues présentent des formes variables, souvent sphériques (porphyridium), en forme de croissant (Clostridium), de spirale (Arthrospira), de gouttelette (chlamydomonas) et même d’étoile (Staurastrum). En réalité, les microalgues sont des micro-organismes composés d’une seule cellule contenant deux « centrales énergétiques » essentielles à leur croissance : le chloroplaste qui est le siège de la photosynthèse et les mitochondries qui sont les sièges de la respiration. Chacun de ces deux processus sera détaillé dans l’ensemble des paragraphes suivants afin de bien élucider le métabolisme entier des microalgues. Les microalgues peuvent mesurer de quelques microns à plusieurs centaines de microns, selon les espèces. Elles ont la capacité d’effectuer la photosynthèse oxygénique (convertir de manière biologique l’énergie lumineuse en liens énergétiques chimiques, qui sont ensuite accumulés sous forme de composés organiques (Falkowski and Raven, 2007)).

Cette réaction photosynthétique forme également de l’oxygène gazeux. Les différents groupes de microalgues possèdent généralement plusieurs pigments photosynthétiques, toutes contiennent de la chlorophylle a (chla), qui peut être complémentée selon les classes et les espèces par des chlorophylles b, c, ou d et divers caroténoïdes. On peut distinguer deux types de pigments, les pigments photosynthétiques et les pigments non-photosynthétiques. C’est dans les chloroplastes, et plus précisément dans les membranes thylacoïdes, que se déroule la réaction d’oxydoréduction qui permet de réduire le dioxyde de carbone à partir de l’hydrogène de l’eau en sucres simples et en oxygène. La figure 1 présente les principales structures des cellules algales eucaryotes. La membrane plasmique est une structure composée de polysaccharides et de protéines plus ou moins complexes et en proportions variables selon les espèces (Van Den Hoek, 1995). Elle est chargée négativement, ce qui est attribuable à la composition des groupes fonctionnels qui y sont associés. Elle confère aux cellules une certaine résistance aux ions métalliques potentiellement toxiques, ce qui motive leur utilisation pour le traitement des eaux (Monteiro et al., 2012).

Principe de la chaîne photosynthétique

Le rôle principal des réactions de la phase photochimique est de créer un réducteur biochimique : le NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) et un composé hautement énergétique : l’ATP (Adénosine TriPhosphate). Ces deux molécules sont nécessaires pour l’assimilation du carbone inorganique (Hu, 2004). La chaîne photosynthétique est composée de trois complexes macromoléculaires intégrés dans la membrane thylacoïdienne : le photosystème II (PS II), le complexe cytochrome b6/f et le photosystème I (PS I). La translocation des électrons entre les différents complexes s’effectue par de petites molécules, transporteurs d’électrons et de photons : les plastoquinones, plastocyanines et ferrédoxines (figure 6). Le transfert d’électron se fait en passant d’un couple rédox faible vers un potentiel redox plus élevé (figure 7). Figure 6 : La chaîne photosynthétique (Hu, 2004) La chaîne photosynthétique commence par un impact lumineux sur une antenne de réception accolée au photosystème II.

Les photons captés, d’une longueur d’onde comprise entre 400 et 700 nm, excitent les pigments jusqu’au centre réactionnel où la chlorophylle piège passe dans un état excité puis oxydé, libérant ainsi un électron. Le centre réactionnel du PS II fonctionne à un équivalent énergétique d’un photon à 680 nm et est nommé P680. L’énergie excédentaire contenue par les photons des longueurs d’ondes inférieures est réémise sous forme de chaleur ou de fluorescence. Le retour de la chlorophylle piège oxydée à un état fondamental s’effectue en réaction avec un complexe SZ qui va simultanément oxyder l’eau. L’oxydation de l’eau (ou photolyse) va produire de l’oxygène, des électrons et des protons. Les électrons issus de la photolyse de l’eau vont rejoindre les électrons issus de l’impact lumineux. Ces électrons sont transférés vers le complexe b6/f par des quinones (Q) puis des plastoquinones (PQ). Ce transfert spontané exergonique (qui libère de l’énergie) est couplé par un trajet endergonique de protons du stroma vers le lumen au niveau du complexe b6/f. Les électrons sont ensuite transférés par la plastocyanine (PC), qui opère dans le lumen, vers le photosystème I (PS I). Le PS I fonctionne à un équivalent énergique d’un photon à 700 nm et fonctionne comme le photosystème II. Les électrons sont transférés à la ferrédoxine puis à la ferrédoxine NADP réductase qui va réduire le NADP+ en NADPH.

L’accumulation des protons, venant de la photolyse de l’eau et du pompage par le complexe b6/f entraine un gradient de protons dans le lumen du thylacoïde. Ce gradient va générer une force proton-motrice qui peut être utilisée pour la formation d’ATP. Le gradient entraine donc le passage spontané des protons par l’ATP synthétase, formant ainsi de l’ATP. Cette formation d’ATP, dépendante de la lumière est appelée phosphorylation. L’ensemble de cette chaîne réactionnelle donne l’équation globale de la phase photochimique acyclique (équation (2)). 4ℎ? + H2O + NADP+ ADP + Pi → NADPH, H+ ATP +O2 (2) L’équation (2) montre que quatre photons sont nécessaires pour former un ATP et un NADPH. La chaîne photochimique non cyclique est donc totalement dépendante des deux impacts lumineux sur les PS II et PS I qui abaissent leur potentiel d’oxydoréduction permettant ainsi le trajet spontané d’électron exergonique (générateur d’énergie). L’énergie va se trouver sous forme de coenzyme réduite de type NADPH, H+ en fin de chaîne mais aussi sous forme d’ATP (figure 7). La formation d’ATP (ou phosphorylation) peut aussi fonctionner de manière cyclique. Au niveau du PS I, les électrons émis par la chlorophylle reviennent réalimenter le complexe b6/f (shunt d’électron). Lorsqu’il y a une quantité suffisante de NADPH, leur production est bloquée, les électrons se recyclent pour produire plus d’énergie sans produire de NADPH.

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Table des matières

TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS
Résumé
NOMENCLATURE
TABLE DES MATIERES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
Introduction
Chapitre I – Etat de l’art et objectifs de l’étude
I.1. Généralités sur les microalgues
I.1.1. Caractéristiques
I.1.2. Distribution et Habitats
I.1.3. Composition et Modes de nutrition
I.1.3.1. Mode autotrophe
I.1.3.2. Mode hétérotrophe
I.1.3.3. Modemixotrophe
I.1.4. Eléments majeurs constitutifs des microalgues
I.1.5. Diversité et classification des microalgues
I.1.5.1. Les procaryotes
I.1.5.2. Les eucaryotes
I.1.6. La photosynthèse
I.1.6.1. Phase photochimique
I.1.6.1.1. La lumière, source d’énergie des microalgues
I.1.6.1.2. Fonctionnement d’un photosystème et de la captation de l’énergielumineuse
I.1.6.1.3. Principe de la chaîne photosynthétique
I.1.6.2. Phase d’assimilation de CO2 ou phase obscure (non dépendante de la lumière)
I.1.7. La respiration cellulaire
I.1.7.1. Photorespiration
I.1.8. Molécules d’intérêts produites par les microalgues
I.1.8.1. Les lipides
I.1.8.2. Les protéines
I.1.8.3. Les pigments et les antioxydants
I.1.8.4. Les glucides
I.2. Culture des microalgues
I.2.1. L’impact des paramètres de culture sur la croissance des microalgues
I.2.1.1. Le carbone
I.2.1.2. Le substrat azoté
I.2.1.3. Le phosphore
I.2.1.4. Les microéléments
I.2.1.5. La lumière
I.2.1.6. La température
I.2.1.7. Le pH
I.2.1.8. Salinité du milieu
I.2.2. Caractéristiques intrinsèques du photobioréacteur
I.2.2.1. Agitation
I.2.2.2. Eclairage
I.2.3. Système de cultures des microalgues
I.2.3.1. Systèmes ouverts
I.2.3.2. Systèmes fermés
I.2.4. Modes de culture
I.2.4.1. Culture en mode discontinu
I.2.4.2.Culture en mode continu
I.3. Applications des microalgues
I.3.1. Domaine alimentaire
I.3.2. Domaine pharmaceutique
I.3.3. Domaine cosmétique
I.3.4. Domaine énergétique
I.3.4.1. Production de bio méthane
I.3.4.2. Production de biocarburant
I.3.4.3. Production de bio-oil
I.3.4.4. Production de biodiesel
I.3.4.5. Production de bio-hydrogène
I.3.5. Domaine environnemental
I.3.5.1. Traitement des eaux usées
I.3.5.2. Agriculture
I.3.5.3. Séquestration du CO2
I.4. Présentation du modèle d’étude
I.4.1. Nannochloropsis gaditana
I.4.2. Tetranephris brasiliensis
I.4.3. Scenedesmus sp.
Chapitre II – Matériel et méthodes
II.1. Isolement et purification des souches
II.1.1. Cadre de l’échantillonnage
II.1.1.1. Spécificités de la région d’échantillonnage : l’estuaire de l’Oued Chéliff
II.1.1.2. Mesures physico-chimiques
II.1.2. Description morphologique des taxons observés au niveau de l’estuaire de l’Oued Chéliff
II.1.3. Purification des souches isolée à partir de l’estuaire de l’Oued Chéliff
II.1.4. Provenance de la microalgue marine
II.1.5. Transfert et maintenance des cultures
II.1.6. Identification des souches étudiées
II.1.6.1. Identification des souches étudiées par observation au microscope électronique à balayage (MEB
II.1.6.2. Identification des souches étudiées par des techniques de Biologie Moléculaire
II.2. Mise en culture
II.2.1. Dispositif expérimental : miniphotobioréacteur de 1000 ml
II.2.2. Maintenance des cultures mères
II.2.3. Choix du milieu de culture
II.2.4. Caractérisation qualitative et quantitative de la croissance en conditions optimales des souches cultivées en mini photobioréacteur
II.2.5. Comportement et adaptation des souches
II.3. Validation des performances en croissance des souches dans des conditions de culture optimales et défavorables
II.3.1. Paramètres physiques
II.3.1.1. Intensité lumineuse et photopériodes
II.3.1.2. Température
II.3.1.3. Potentiel hydrogène (pH)
II.3.1.4. Salinité
II.3.1.5. Surface spécifique éclairée
II.3.1.6. Elaboration d’un système de culture de type plat à l’échelle pilote
II.3.2. Paramètres biochimique (Optimisation du milieu F/2Guillard
II.3.2.1. Concentration en bicarbonate de sodium
II.3.2.2. Source et concentration initiale d’azote
II.3.2.3. Concentration en phosphate
II.4. Potentialités des effluents de piscicultures intensives à produire des microalgues en masse
II.4.1. Matériel biologique
II.4.2. Infrastructure d’élevage
II.4.3. Paramètres physico-chimiques
II.4.4. Ration alimentaire et fréquence de nourrissage
II.5. Protocoles d’analyse et détermination des grandeurs des souches
II.5.1. Récolte de la biomasse et lyophilisation
II.5.2. Dénombrement cellulaire
II.5.3. Estimation du taux de croissance et du temps de génération
II.5.4. Dosage des protéines (Méthode de Bradford)
II.5.5. Dosage des carbohydrates
II.5.6. Détermination de la concentration et de la composition des pigments
II.5.7. Extraction des lipides totaux
II.7. Analyse statistique
Chapitre III – Résultats
III.1.Description morphologique des taxons observés au niveau de l’estuaire de l’Oued Chéliff
III.1.1. Caractères principaux des genres de microalgues observées
III.1.2. Identification morphologique des souches étudiées par observation au microscope électronique à balayage (MEB)
III.1.3. Identification des souches étudiées par techniques de biologie moléculaire
III.1.4. Évaluation de la facilité de culture des souches (Caractérisation qualitative et quantitative de la croissance en conditions optimales des souches cultivées en miniphotobioreacteur)
III.2. Validation des performances en croissance des souches dans des conditions de culture optimales et défavorables
III.2.1. Paramètres physiques
III.2.1.1. Nannochloropsis gaditana
III.2.1.1.1. Influence des flux incidents et des différentes photopériodes sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.1.2. Influence de la température sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.1.3. Influence du pH sur la croissance cellulaire et la composition
biochimique.
III.2.1.1.4. Influence de la salinité sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.1.5. Étude de différentes géométries de photobioréacteur
III.2.1.2. Tetranephris brasiliensis
III.2.1.2.1. Influence des flux incidents et différentes photopériodes sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.2.2. Influence de la température sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.2.3. Influence du pH sur la croissance cellulaire et la composition biochimique.
III.2.1.2.4. Étude de différentes géométries de photobioréacteur
III.2.1.3. Scenedesmus sp.
III.2.1.3.1. Influence des flux incident et de différentes photopériodes sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.3.2. Influence de la température sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.1.3.3. Influence du pH sur la croissance cellulaire et la composition biochimique.
III.2.1.3.4. Étude de différentes géométries de photobioréacteur
III.2.2. Paramètres biochimiques
III.2.2.1. Nannochloropsis gaditana
III.2.2.1.1. Influence de différentes concentration en bicarbonate de sodium sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.1.2. Influence de différentes sources et concentration d’azote sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.1.3. Influence de la concentration en phosphate sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.2. Tétranephris brasiliensis
III.2.2.2.1. Influence de différentes concentration en bicarbonate de sodium sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.2.2. Influence de différentes sources et concentration d’azote sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.2.3. Influence de la concentration en phosphate sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.3. Scenedesmus sp.
III.2.2.3.1. Influence de différentes concentration en bicarbonate de sodium sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.3.2. Influence de différentes sources et concentration d’azote sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.2.2.3.3. Influence de la concentration en phosphate sur la croissance cellulaire et la composition biochimique
III.3. Etude de la potentialité des effluents de piscicultures intensives à produire des microalgue en masse
III.3.1. Nannochloropsis gaditana
III.3.2. Tetranephris brasiliensis
III.3.3. Scenedesmus sp.
Chapitre IV – Discussion et conclusions
IV.1. Discussion
IV.2. Conclusions et perspectives
Chapitre V – Bibliographie
ANNEXE 1 : Extraction de l’ADN génomique
ANNEXE 2 : Composition du milieu f/2 Guillard (Guillard and Ryther 1963)
ANNEXE 3 : Dénombrement cellulaire
ANNEXE 4 : Courbe d’étalonnage pour le dosage des carbohydrate par la méthode de Dubois
ANNEXE 5 : Courbe d’étalonnage pour le dosage des protéines par la méthode de Bradford
ANNEXE 6 : Les paramètres indicateurs de la qualité de l’eau piscicole