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Description botanique de Euphorbia laro
Euphorbia laro (figure 1) est une Euphorbiacée endémique de Madagascar (DRAKE, 1899) appartenant au groupe Intisy (annexe I). C’est un arbre de 3 à 6 m de hauteur, à rameaux nombreux, charnus, cylindriques et striés. Les fruits sont constitués par une capsule arrondie, à trois loges sur laquelle les lignes de suture des carpelles sont marquées par une faible dépression. Le pédoncule des fruits est toujours recourbé à angle droit vers sa base. Les branches stériles, ramifiées à courts intervalles portent des branches secondaires courtes, pourvues des feuilles alternes, sessiles, ligulées, charnues atteignant 12 mm de longueur sur 4 mm de large. Ces feuilles sont parfois isolées le long des tiges ou à la base des rameaux mais le plus souvent groupées à leur extrémité par trois ou quatre.
Etude chimique 10
a) Rameaux b) Plante entière
Figure 1 : Euphorbia laro :
a) Rameaux ; b) Plante entière
Répartition géographique
De nombreux auteurs dont DENIS (1921) rapportent la présence de Euphorbia laro dans différentes régions de Madagascar :
Dans la région du centre Sur les rocailles à une altitude de 1000 m, aux environs de Tsaratanana.
Dans la région de l’Ouest Tout au long des dunes aux environs de Mahajanga.
Dans la région du Sud-Ouest
• Près du Menarandra, de la Sakamasina et de l’Androtina
• Sur les plateaux calcaires entre le Fiherenana et l’Onilahy
• Sur les collines du bas Fiherenana
• Sur les collines calcaires du Fiherenana
Selon COSTATIN et GALLAUD (1905) et DENIS (1921), Euphorbia laro pousse avec les autres euphorbes du groupe intisy dans la région Sud-Ouest de Madagascar, en formant un paysage d’euphorbes xérophytiques. Ainsi, HUMERT et COURDANE (1965) avaient décrit le domaine du Sud-Ouest comme étant un fourré à Euphorbiacées. En 1974, KOECHLIN avait délimité ce fourré en une bande étroite le long de la côte.
Laro, tel est le nom vernaculaire de Euphorbia laro DRAKE.
Récolte du latex
Le latex a été récolté à Manombo Sud, Toliara, en Septembre 2000.
La récolte est effectuée en pratiquant des entailles sur le tronc de l’arbre (figures 2). Le latex, visqueux et de couleur jaunâtre, coule le long du tronc et tombe dans un trou préalablement préparé au pied de l’arbre. Il est ensuite recueilli, puis versé dans des bouteilles. Au laboratoire, il est congelé.
PRODUITS CHIMIQUES
La plupart des produits chimiques utilisés, essentiellement de marque MERCK, PROLABO, RIEDEL DE HAEN, sont de qualité pure ou pour analyse.
Les supports chromatographiques employés sont :
– le gel Sephadex G 25
– le gel de silice de marque MERCK
– et les plaques de gel de silice KIESELGEL 60 F254 (MERCK) prêtes à l’emploi, de dimensions 20 cm x 20 cm et d’épaisseur 0,2 mm pour la CCM.
Figures 2 : Technique de collecte de latex de Euphorbia laro
1) Confection au pied de la plante d’un trou destiné à recueillir le latex
2) Entailles faites sur le tronc de l’arbre avec une bêche
3) Cicatrices au niveau des entailles
METHODES
METHODE D’EXTRACTION
Préparation du latex
Le latex durci est pesé, puis concassé à l’aide d’une spatule. La poudre grossière ainsi obtenue constitue notre matériel végétal de départ.
Extraction proprement dite
La poudre de latex est mise en suspension dans le solvant d’extraction dans un rapport 1/5 (p/v). La suspension est mélangée sous agitation magnétique pendant 3 h à la température ambiante. Le mélange ainsi obtenu est macéré à 4°C pendant une nuit. Le macérat est filtré grossièrement sur quatre épaisseurs de gaze pour éliminer les tourteaux. Le filtrat est ensuite centrifugé à 27200 x g pendant 30 min à 5°C à l’aide d’une centrifugeuse BECKMAN J2-21 (Rotor JA20). Le solvant d’extraction est évaporé, puis l’extrait est concentré et ramené à un volume voulu (cf. § 3.3., p.17).
METHODES DE PURIFICATION
La purification est guidée par des tests d’ichtyotoxicité sur des alevins de carpe et des tests d’homogénéité par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant le système butanol/ acide formique/ eau (B/F/E), dans un rapport 6-2-2 (v/v), comme système de solvants de migration. A chaque étape de purification, la solution toxique est évaporée à sec afin d’évaluer le rendement.
Extraction liquide-liquide
Principe
Le principe repose sur le partage des substances entre deux solvants non miscibles de polarités différentes (MAHUZIER et HAMON, 1990).
Mode opératoire
L’extrait à traiter est mélangé volume à volume dans une ampoule à décanter avec un solvant organique non miscible à l’eau. Le mélange est secoué vigoureusement, puis laissé au repos jusqu’à la séparation nette des deux phases : une phase supérieure organique et une phase inférieure aqueuse. La phase organique est recueillie, tandis que la phase aqueuse est traitée de nouveau avec un égal volume de solvants. La même opération est répétée trois fois.
Chaque phase, additionnée d’eau distillée est soumise à une évaporation sous vide afin d’éliminer le solvant organique et de réduire le volume à la valeur souhaitée.
Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
Principe
L’acétate neutre de plomb (ANP), tout comme d’autres métaux lourds, permet la défécation d’extraits biologiques en précipitant les grosses molécules comme les protéines, les acides nucléiques et d’autres molécules comme les acides organiques.
Mode opératoire
La solution d’ANP (20%, v/v) est versée goutte à goutte dans l’extrait, placé sous agitation magnétique, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité. Le précipité obtenu est éliminé par centrifugation à 27200 x g pendant 15 min. L’excès d’ANP dans le surnageant est ensuite précipité par addition d’une solution de phosphate dissodique (10%, p/v). Le précipité est écarté par centrifugation.
Filtration sur charbon actif
Principe
Le charbon actif a un pouvoir adsorbant élevé et une grande affinité pour les substances aromatiques. Il est utilisé en chromatographie pour la déprotéinisation ou la décoloration des extraits liquides ainsi que pour la séparation des acides aminés aromatiques.
Mode opératoire
La technique mise au point par JEANNODA en 1986 est utilisée. Une couche de charbon actif (MERCK) est déposée dans un entonnoir au dessus d’un bouchon de fibre de verre. L’entonnoir est adapté à une fiole à vide (figure 3). L’extrait à traiter est filtré sous pression réduite sur la couche de charbon actif préalablement humidifiée à l’eau distillée. La filtration est assurée par une légère aspiration à l’aide d’une pompe à vide. Le filtrat obtenu est ensuite passé sur papier filtre pour éliminer les éventuels particules de charbon.
Les substances à séparer migrent dans un milieu solide poreux doué de propriétés adsorbantes. Cette migration résulte de l’équilibre de deux systèmes de forces opposées : d’une part, l’action d’un courant de liquide à travers la colonne et d’autre part, les affinités d’adsorption pour les supports solides. Ces dernières forces agissent de façon sélective (MAHUZIER et HAMON, 1990 ; LEDERER, 1959).
* Préparation du gel de silice
Le gel est mis à gonfler pendant 3 h à la température ambiante dans le solvant de chromatographie puis dégazé sous pression réduite. La suspension est ensuite coulée dans une colonne de verre de dimensions connues. Lorsque le gel est complètement sédimenté, sa surface supérieure est stabilisée avec un disque de papier filtre.
* Dépôt de l’échantillon et élution
L’échantillon à analyser est déposé à la surface du gel. L’élution par gravité est effectuée par percolation du système de solvants. L’effluent de la colonne est recueilli par fractions de volume constant dans des tubes à essai à l’aide d’un collecteur de fractions.
Chromatographie sur gel Sephadex G25
C’est un procédé basé sur la séparation des substances suivant leur taille et leur forme moléculaire.
Le Sephadex est un gel préparé par réticulation d’un polymère anhydroglucosé : le dextrane. Il joue un rôle de tamis moléculaire. Les grosses molécules ayant un poids moléculaire élevé n’entrent pas dans les pores du gel. Elles restent dans le liquide extra-granulaire et sortent les premières dans le volume mort de la colonne : elles sont dites exclues. Par contre, les petites molécules pénètrent facilement dans les pores du gel et leur élution se fait lentement le long de la colonne. Les molécules sont alors éluées par ordre des poids moléculaires décroissants.
Il existe plusieurs types de gel Sephadex selon leur degré de réticulation, c’est à dire selon leur pouvoir de gonflement et leur domaine de fractionnement. Le gel utilisé dans le cadre de ce travail est du type Sephadex G25 possédant un domaine de fractionnement compris entre 100 et 5000 Da (MAHUZIER et HAMON, 1990).
Mode opératoire
* Préparation du gel
Le gel est mis à gonfler pendant 3 h à la température ambiante dans de l’eau distillée, puis dégazé sous pression réduite au moyen d’une pompe à vide. La suspension est ensuite coulée dans une colonne de verre de dimensions connues. La surface supérieure du gel est stabilisée avec un disque de papier filtre. La colonne est ensuite équilibrée par percolation de trois fois de son volume de solvants.
* Dépôt de l’échantillon
L’échantillon à analyser est déposé à la surface du gel. Le dépôt est suivi d’une élution par gravité. L’effluent de la colonne est recueilli à volume constant dans des tubes à essai à l’aide d’un collecteur de fractions.
* Régénération du gel
Il n’y a pas de régénération spéciale du gel. En effet, lorsque toutes les substances sont éluées, la colonne est prête pour une nouvelle chromatographie.
Ultrafiltration sur membrane à perméabilité sélective
Principe
L’ultrafiltration est une technique de séparation de substances selon leur poids moléculaire par passage à travers des pores calibrés d’une membrane à perméabilité sélective. Une faible pression exercée par l’intermédiaire de l’air comprimé permet l’ultrafiltration.
Ce sont les membranes DIAFLO (AMICON) qui sont les plus utilisées. Trois membranes UM 10, UM 2 et UM 05 (25 mm de diamètre) dont les seuils de filtration sont respectivement 10000, 1000 et 500 Da sont utilisées. La cellule d’ultrafiltration correspondante est la cellule AMICON 8MC.
Mode opératoire
Avant la première utilisation, la couche de glycérine protectrice à la surface de la membrane doit être éliminée par bains successifs de celle-ci dans de l’eau distillée. La pression de l’air comprimé appliquée est inférieure ou égale à 6 atmosphères pour les trois types de membrane.
Après chaque ultrafiltration, deux extraits sont obtenus :
• L’ultrafiltrat ou la solution de substances qui passent à travers la membrane ultrafiltrante,
• Le retentat qui contient les composés qui ne peuvent pas traverser la membrane.
La membrane est réutilisable. Après chaque utilisation, des rinçages successifs au NaCl 1 M sont nécessaires pour débarrasser des dépôts éventuels à sa surface, puis la membrane est conservée humide dans l’éthanol 10% à 4ºC.
METHODE DE CONCENTRATION ET D’EVAPORATION
Les opérations de concentration et d’évaporation des solvants à partir des différents extraits sont réalisées au moyen d’un évaporateur rotatif HEIDOLPH, à 50°C. La pression est réduite à l’aide d’une pompe à vide.
METHODES ANALYTIQUES
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Principe
La CCM est un procédé de micro-analyse faisant intervenir le phénomène de partage et d’adsorption. Les substances à séparer sont soumises d’une part à des échanges entre deux phases dont l’une fixe aqueuse et l’autre mobile organique et d’autre part aux forces d’adsorption dues au support (MAHUZIER et HAMON, 1990).
Mode opératoire
Le support utilisé est le gel de silice 60F254 (20 cm x 20 cm ; 0,2 mm d’épaisseur) étalé sur feuilles plastiques. Les extraits à analyser sont déposés en traits fins de 7 mm, espacés de 6 mm, au moyen d’un capillaire de verre, à 15 mm du bord inférieur de la plaque et à 13 mm des bords latéraux. Chaque dépôt est séché à l’aide d’un séchoir à main. La plaque est ensuite développée dans une cuve chromatographique DESAGA préalablement saturée par les vapeurs du système de solvants de migration grâce à l’application de papier Joseph contre les parois internes de la cuve.
Il s’agit d’une chromatographie ascendante. Lorsque le front du solvant arrive à 5 mm du bord supérieur de la plaque, le développement est arrêté en retirant la plaque de la cuve.
Elle est ensuite séchée à l’aide d’un séchoir à main.
Systèmes de solvants
Pour le suivi de l’homogénéité des différentes fractions obtenues à chaque étape de purification, le solvant de chromatographie est le système butanol/ acide formique/ eau (B/F/E) dans un rapport 6-2-2 (v/v), phase supérieure.
Pour contrôler la pureté de la toxine, plusieurs systèmes de solvants ont été utilisés.
Révélation des chromatogrammes
La révélation est réalisée en deux étapes :
1) Visualisation des différentes substances sous lumières ultraviolettes à 254 nm et à 366 nm ;
2) Pulvérisation d’un réactif sur la plaque : le réactif vanilline/acide sulfurique (0,5/100 p/v) : après chauffage à l’étuve à 120°C pendant 5 min, ce réactif, considéré comme universel, donne des taches noires,
Réactions de détection des familles chimiques
Les alcaloïdes ( DALTON, 1979 ; CORDELL, 1981)
Les tests des alcaloïdes sont réalisés avec les réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGGENDORFF dont les formules sont données en annexe II.
Test préliminaire
L’extrait à analyser est acidifié par ajout de HCl 2 N. Le mélange est réparti dans quatre tubes à essai dont un sert de témoin. 0,5 ml de chacun des trois réactifs est ajouté respectivement dans les tubes tests. Après une légère agitation, l’apparition d’une floculation ou d’un précipité est une présomption de la présence d’alcaloïdes dans l’extrait.
Test de confirmation
L’extrait étudié est alcalinisé avec de l’ammoniaque, puis la solution est extraite trois fois avec du chloroforme. Les solutions chloroformiques sont rassemblées puis évaporées à sec.
Le résidu d’évaporation à sec est repris dans de l’eau distillée. Cette solution est acidifiée par ajout de HCl 2 N puis filtrée. La solution limpide est répartie dans quatre tubes à essai dont un sert de témoin. Le test est réalisé comme précédemment avec les trois tubes.
L’apparition d’un précipité, d’une floculation ou d’un trouble confirme la présence des alcaloïdes dans l’extrait.
Le test de confirmation est effectué seulement lorsque le test préliminaire est positif.
Les flavonoïdes et les leucoantocyanes (FONG et coll., 1977)
Deux tests, le test de WILSTATER pour les flavonoïdes et celui de BATE-SMITH pour les leucoantocyanes, sont réalisés.
Test de WILSTATER
L’extrait à tester est évaporé à sec, puis le résidu est repris dans l’éthanol 80% (v/v). La solution alcoolique obtenue est répartie dans quatre tubes à essai dont un sert de témoin.
Dans le deuxième tube sont ajoutés 0,5 ml de HCl concentré (12,07 N) puis deux tournures de magnésium.
Dans le troisième tube, en plus de ce qu’on a mis dans le deuxième tube, 1 ml d’alcool isoamylique a été ajouté.
La présence des flavonoïdes est caractérisée par un virage de la coloration :
• au rouge pour les flavones (deuxième tube)
• au pourpre pour les flavonols (troisième tube)
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
GENERALITES SUR LES PLANTES ICHTYOTOXIQUES
1. Les plantes ichtyotoxiques
2. Les principes ichtyotoxiques
3. Les propriétés toxicologiques et pharmacologiques des diterpènes toxiques des euphorbes
PREMIERE PARTIE : ISOLEMENT ET CARACTERISATION CHIMIQUE DU PRINCIPE ICHTYOTOXIQUE DU LATEX DE EUPHORBIA LARO
1. Introduction
2. Matériels
2.1. Matériel végétal
2.1.1. Description botanique
2.1.2. Répartition géographique
2.1.3. Récolte du latex
2.2. Produits chimiques
3. Méthodes
3.1. Méthode d’extraction
3.1.1. Préparation du latex
3.1.2. Extraction proprement dite
3.2. Méthodes de purification
3.2.1. Fractionnement liquide-liquide
3.2.2. Précipitation par l’acétate neutre de plomb
3.2.3. Filtration sur charbon actif
3.2.4. Chromatographie sur gel de silice
3.2.5. Chromatographie sur gel Sephadex G 25
3.2.6. Ultrafiltration sur membrane à perméabilité sélective
3.3. Méthode de concentration et d’évaporation
3.4. Méthodes analytiques
3.4.1. Chromatographie sur couche mince
3.4.2. Réactions de détection des familles chimiques
3.4.2.1. Les alcaloïdes
3.4.2.1.1. Test préliminaire
3.4.2.1.2. Test de confirmation
3.4.2.2. Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
3.4.2.2.1. Test de WILSTATER
3.4.2.2.2. Test de BATH-SMITH
3.4.2.3. Les tanins et les polyphénols
3.4.2.3.1. Test à la gélatine
3.4.2.3.2. Test à la gélatine salée
3.4.2.3.3. Test au chlorure ferrique
3.4.2.4. Les anthraquinones
3.4.2.5. Les saponines
3.4.2.6. Les stérols et les triterpènes
3.4.2.6.1. Test de LIEBERMANN-BURCHARD
3.4.2.6.2. Test de SALKOWSKI
3.4.2.7. Les lactones insaturés : test de KEDDE
3.4.2.8. Les desoxyoses : test de KELLER-KILIANI
4. Résultats
4.1. Isolement du principe ichtyotoxique
4.1.1 Extraction
4.1.1.1.Extraction aqueuse
4.1.1.2. Extraction hydroalcoolique
4.1.2. Purification
4.1.2.1. Fractionnement par l’acétate d’éthyle
4.1.2.2. Chromatographie sur gel de silice
4.1.2.3. Chromatographie sur gel Sephadex G 25
4.2. Contrôle de pureté de l’extrait E3
4.3. Rendement de purification
4.4. Caractérisation chimique de la toxine
4.4.1. Propriétés physico-chimiques
4.4.2. Nature chimique
5. Discussion et conclusion
DEUXIEME PARTIE : ETUDE DES PROPRIETES TOXICOLOGIQUES
1. Introduction
2. Matériels
2.1. Les organismes d’expérimentation
2.1.1. Les animaux
2.1.2. Les végétaux
2.1.3. Le plancton
2.1.4. Les cellules et les microorganismes
2.2. Milieux de culture
2.2.1. Milieux utilisés pour la culture de cellules P388N
2.2.2. Milieux utilisés pour la culture de microorganismes
3. Méthodes
3.1. Méthode de stérilisation
3.2. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur les poissons
3.2.1. Test de toxicité
3.2.2. Détermination de la CL 50
3.3. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur divers organismes marins
3.3.1. Chez les animaux nageurs
3.3.2. Chez Artemia
3.3.2.1. Préparation des larves
3.3.2.2. Test de toxicité
3.3.3. Chez les végétaux
3.3.4. Chez le plancton
3.4. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur la souris
3.4.1. Estimation de la toxicité
3.4.2. Détermination de la DL 50 (24 h)
3.4.3. Examens anatomopathologiques
3.4.3.1. Prélèvement et fixation
3.4.3.2. Inclusion
3.4.3.3. Microtomie et étalement de coupe
3.4.3.4. Coloration des coupes et montages des lames
3.5. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur les cellules cancéreuses
3.5.1. Culture cellulaire
3.5.1.1. A partir des cellules cryocongelées
3.5.1.2. A partir des cellules en culture
3.5.2. Test de cytotoxicité
3.5.3. Recherche du pourcentage d’inhibition et évaluation de la CI
3.6. Méthodes d’étude des propriétés hémolytiques de la toxine
3.6.1. Préparation de la suspension des hématies de mouton
3.6.2. Test hémolytique
3.6.3. Dosage de l’activité hémolytique
3.7. Méthodes d’étude des effets de la toxine sur les microorganismes
3.7.1. Méthode par diffusion : méthode des disques
3.7.2. Méthode d’étude en milieu liquide
3.7.2.1. Détermination de la CMI
3.7.2.2. Détermination de la CMB
4. Résultats
4.1. Effets de l’eupholarine sur les poissons
4.1.1. Symptômes d’intoxication
4.1.2. Détermination de la CL 50
4.1.2.1. Chez les poissons d’eau douce : Cyprinus carpio
4.1.2.2. Chez les poissons d’eau de mer : Terapon jarbua
4.2. Effets de l’eupholarine sur divers organismes marins
4.2.1. Effets sur les animaux
4.2.1.1. Chez les holothuries
4.2.1.1.1. Symptômes d’intoxication
4.2.1.1.2. Détermination de la CL 50
4.2.1.2. Chez les coquillages
4.2.1.3. Chez les oursins et les ophiures
4.2.1.4. Chez les crabes et les crevettes
4.2.1.5. Effets sur les larves d’Artemia
4.2.2. Effets sur les végétaux
4.2.3. Effets sur le plancton
4.3. Effets de l’eupholarine sur la souris
4.3.1. Symptômes d’intoxication
4.3.2. Détermination de la DL 50 (24 h)
4.3.3. Lésions anatomopathologiques
4.4. Effets de l’eupholarine sur les cellules cancéreuses
4.5. Effets de l’eupholarine sur les hématies de mouton
4.5.1. Test hémolytique
4.5.2. Dosage de l’activité hémolytique
4.6. Effets de l’eupholarine sur les microorganismes
4.6.1. Spectre d’activité de l’eupholarine
4.6.2. Détermination de la CMI et de la CMB
5. Discussion et conclusion
TROISIEME PARTIE : ETUDE DES IMPACTS DE LA PECHE AU LARO
1. Introduction
2. Méthodologie
2.1. Zones d’étude
2.2. Types d’information recherchées
2.3. Techniques de collecte et sources d’information
3. Résultats
3.1. Importance d la pêche au laro
3.1.1. Lieu de pêche
3.1.2. Technique de la pêche au laro
3.1.3. Commercialisation
3.2. Impacts de la pêche au laro sur la santé
3.2.1. Sur la santé des pêcheurs
3.2.2. Sur la santé des consommateurs de poissons pêchés au laro
3.2.2.1. Fréquence de la consommation
3.2.2.2. Symptômes d’intoxication
3.2.3. Maladies courantes dans la zones d’étude
3.3. Impacts de la pêche au laro sur l’activité de pêche
3.3.1. Sur les ressources halieutiques exploitables
3.3.2. Sur les opérateurs oeuvrant dans la pêche
3.4. Impacts de la pêche au laro sur l’environnement marin
3.4.1. Effets du poison sur les organismes marins
3.4.2. Effets sur les récifs coralliens
3.5. Mesures prises dans les zones d’étude face à la pêche au laro
3.5.1. Au niveau de l’Etat
3.5.1.1. Politique générale en matière de pêche
3.5.1.2. Mode de gestion des activités de pêche sur le récif
3.5.2. Au niveau des autorités locales
3.5.2.1. Mairie
3.5.2.2. Brigade de la Gendarmerie Nationale
3.5.3. Au niveau des ONGs
3.5.4. Situation actuelle de la pêche au laro
4. Discussion et conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE
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