Invalidation du gène selenot dans la lignée mhypoA-POMC

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Le repliement des protéines

Le RE contient une grande quantité de protéines dont la concentration peut atteindre ≈100 g/L (soit environs 2 mM) ce qui lui confère une forte viscosité (Stevens and Argon 1999). Afin de prévenir l’agrégation des protéines mal repliées qui exposent à leur surface des domaines hydrophobes, cet organite contient une grande quantité de protéines chaperonnes, des protéines qui facilitent le repliement d’autres protéines pour leur permettre d’atteindre leur forme native (Cai, Wang, and Tsou 1994). Il existe plusieurs types de protéine chaperonnes comme les protéines sensibles à la température (heat shock protein, Hsp), les protéines disulfide isomérases (PDI) et les lectines chaperonnes.

Les heat shock proteins

Les Hsp sont classées en plusieurs familles (Hsp 40, Hsp 60, Hsp 70, Hsp 90 et Hsp 100), selon leur masse moléculaire. L’expression de ces protéines est généralement induite suite à un stress thermique, puisque la température modifie la conformation des protéines, mais certaines d’entre elles, comme Hsp70/GRP78/BiP, ERdj1-5, BAP/Sil1, GRP170, GRP94 et la Torsine A sont surexprimées lors d’une accumulation de protéines dans le RE, une privation en glucose et/ou une dérégulation de l’homéostasie calcique et redox dans le RE (Hebert and Molinari 2007).
GRP78/BiP est la chaperonne majeure du RE et la principale consommatrice d’ATP (Hendershot 2004). Elle joue un rôle de premier plan dans le repliement des protéines, la protection vis-à-vis de l’agrégation des protéines mal repliées (Haas and Wabl 1983, Puig and Gilbert 1994) et le maintien de l’homéostasie calcique dans le RE (Lievremont et al. 1997). BiP possède un site de liaison nucléotidique (NBD) et un site de liaison au substrat (SBD). Sous sa forme liée à l’ATP le NBD est arrimé au SBD. L’hydrolyse de l’ATP permet de libérer les deux domaines et créer une poche afin de lier avec une haute affinité le substrat à replier apporté par ERdj. Le relargage de l’ADP permet à la fois de relarguer le substrat replié et libérer le site de liaison pour l’ATP (Figure 5) (Pobre, Poet, and Hendershot 2019, Wieteska, Shahidi, and Zhuravleva 2017). BiP peut aussi être AMPylé (Preissler, Rato, et al. 2017), une modification post-traductionnelle qui lie de façon covalente l’AMP à une protéine. Cette modification inactive BiP en la figeant dans une conformation arrimée similaire à sa forme liée à l’ATP qui bloque l’interaction avec ERdj (Preissler, Rohland, et al. 2017). l’hydrolyse de l’ATP, le NBD et le SBD se dissocient et le couvercle du SBD se ferme, ce qui donne une forme à forte affinité pour le substrat. Ce cycle est régulé par des cofacteurs DnaJ localisés dans le RE (ERdjs) qui interagissent avec les protéines dépliées et les transfèrent à la forme liée à l’ATP de BiP, tout en déclenchant simultanément l’hydrolyse de l’ATP. Étapes 3, 4 des facteurs d’échange de nucléotides (NEF) stimulent la libération d’ADP. La liaison de l’ATP entraîne un changement de conformation du SBD, ce qui donne lieu à une conformation plus compacte, censée  » expulser  » le substrat. Étape 5, l’interaction avec ERdjs réorganise la poche de liaison polypeptidique du SBD BiP-ATP, le préparant à interagir avec un autre substrat. Étape 6, BiP peut être modifiée de manière post-traductionnelle par AMPylation, ce qui rend la protéine inactive. La forme BiP AMPylée adopte une structure « à domaine fixe » similaire à celle de l’état lié à l’ATP et est incapable d’interagir de manière productive avec ERdjs (Pobre, Poet, and Hendershot 2019).
BiP facilite aussi, avec des membres de la famille ERdj et Sil1, la translocation des chaînes polypeptidiques naissantes vers le RE (Matlack et al. 1999) et contrôle la perméabilité du RE en obstruant les canaux de translocation Sec61 (Alder et al. 2005). Par ailleurs, elle joue aussi un rôle fondamental dans l’activation de l’UPR (Hebert and Molinari 2007, Schroder and Kaufman 2005).

Le repliement oxydatif des protéines

Les protéines acquièrent une structure tridimensionnelle dans le RE qui est déterminée par leur séquence primaire et repliées par différents types d’interactions telles que les interactions de van der Waals, les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes et électrostatiques. Les ponts disulfure servent à stabiliser la structure tertiaire. Environ 7000 protéines (1/3 du protéome) présentent des ponts disulfure, une réaction catalysée par la familles des protein disulfide isomerase (PDI) (Hatahet and Ruddock 2009). L’environnement oxydant du RE par rapport à celui du cytosol (-170 à -185 mV à pH 7.0 dans le RE contre -290 mV dans le cytosol) (Dixon et al. 2008, Ostergaard, Tachibana, and Winther 2004), favorise leur formation (Hebert and Molinari 2007, Hatahet and Ruddock 2009, Molinari and Helenius 1999). Dans cet environnement, les groupements sulfhydryles, (SH), très réactifs des cystéines peuvent être oxydés de manière réversible. L’oxydation de deux groupements SH voisins permet la formation d’une liaison covalente stable (S-S). Si le groupement SH se trouve au voisinage d’un groupement SeH (sélénium, Se), l’oxydation de ces deux groupements aboutit à la formation d’un pont sélénosulfure (Se-S) (voir le chapitre sur les Sélénoprotéines).
Différents domaines des PDIA1, PDIA2, PDIA3, PDIA4 et PDIA7 : a, b, b’ et a’, motifs thioredoxin-like ; En bleu, les domaines catalytiques a et a′, en vert et violet, les domaines non catalytiques b et b′, respectivement. Le x-linker entre b′ et a′ est représenté en orange et le domaine transmembranaire en rouge foncé. Modifié d’après (Andreu et al. 2012).
Chez l’Homme, une vingtaine de protéines composent la famille des PDI, incluant des oxydoréductases et des protéines chaperonnes, (Kanemura et al. 2020). Elles possèdent un ou plusieurs motifs thioredoxin-like (un feuillet β central entouré d’hélices α) et jusqu’à 4 sites actifs CXXC au niveau de leurs domaines catalytique (Figure 6) . Grâce aux Cys présentes dans leurs sites actifs (motif CXXC), les PDI permettent le repliement des protéines par des échanges d’e- ou par isomérisation et permettent aussi l’élimination des ponts disulfure inadaptés. Ces protéines se comportent soit comme des accepteurs d’électrons (e-) provenant du substrat à oxyder, soit en tant que donneur d’e- au substrat à réduire lors du repliement oxydatif des protéines (Hebert and Molinari 2007, Tavender and Bulleid 2010, Zito et al. 2010, Nguyen et al. 2011, Margittai et al. 2012) (Figure 7).
Les PDI permettent la formation de ponts disulfure dans les protéines par le biais de leurs sites redox CXXC. Elles permettent aussi l’isomérisation des protéines et l’élimination des ponts disulfure inadaptés par l’intermédiaire de ponts disulfure mixtes (protéine-PDI), modifié d’après (Hebert et Molinari, 2007).
Afin de garder une dynamique d’échange de pont disulfure, les PDI doivent être ré-oxydées. Ceci est réalisé par l’enzyme ER oxidoreductin-1α et β (Ero1), une flavoprotéine qui transfère deux électrons de la PDIred au dioxygène via le FAD. Cette réaction génère de l’H2O2 (Tavender et al., 2010), la principale source d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le RE. Les PDI peuvent aussi être réduites par le glutathion sous sa forme réduite (GSH). Il est aussi capable de réduire les protéines mal repliées et Ero1 en générant par la même le glutathion sous forme oxydée (GSSG) (Kumar et al. 2011) (Figure 8). Le glutathion est souvent considéré comme l’un des principaux composants qui maintienne l’environnement redox du RE chez les procaryotes et eucaryotes, bien que son rôle dans le repliement oxydatif des protéines et la sécrétion reste débattu puisque, sous sa forme réduite, il entre en compétition avec les substrats des PDI (Cuozzo and Kaiser 1999, Delaunay-Moisan, Ponsero, and Toledano 2017). Sa concentration dans le RE atteint 15 mM (Montero et al. 2013) et les formes réduites et oxydées sont à l’équilibre (avec un ratio allant de 1:1 à 3:1) contrairement au cytosol ou la GSH est majoritaire (de 30:1 à 100:1) (Hwang, Sinskey, and Lodish 1992). De fait, le GSH n’est synthétisé que dans le cytosol (Delaunay-Moisan, Ponsero, and Toledano 2017) et il a été démontré in vitro que les récepteurs à la ryanodine (RyR) et le translocon Sec61 transportent passivement le GSH vers le RE (Banhegyi et al. 2003, Ponsero et al. 2017). La forme oxydée pourrait être renvoyée vers le cytosol par le biais d’un canal qui n’est pas identifié à l’heure actuelle (Delaunay-Moisan, Ponsero, and Toledano 2017).
Le glutathion est synthétisé et réduit dans le cytosol puis transporté et oxydé dans le RE durant le repliement oxydatif des protéines par les PDI. Ero1 oxyde ces dernières de façon à garder un pool de PDI oxydées (Delaunay-Moisans 2017).
Des travaux ont montré que les PDI pouvaient participer au repliement des protéines dépourvues de ponts disulfures, comme la GAPDH, indépendamment de leurs fonctions d’oxydoréductase (Cai, Wang, and Tsou 1994). Chez l’homme, cette activité de chaperonne est régulée par l’état redox des cystéines situées au niveau du site catalytique du domaine a’ (Wang et al. 2012, Quan, Fan, and Wang 1995). Récemment, une localisation extracellulaire des PDI, notamment PDIA1, a été observée. Celles-ci sont impliquées dans l’adhésion cellulaire médiée par les intégrines. Le mécanisme d’adressage serait indépendant de la translocation via l’appareil de Golgi (Soares Moretti and Martins Laurindo 2017, Rosenberg et al. 2019).
Enfin, il faut préciser que le repliement des protéines ne se limite pas à la formation des ponts disulfure. D’autres acteurs de ce processus, les isomerases peptidyl-prolyl cis/trans, participent au repliement de la chaîne peptidique en catalysant l’isomérisation cis-trans des liaisons peptidiques impliquant un résidu proline (Hebert and Molinari 2007).

Le contrôle qualité des glycoprotéines : le cycle calnexine-calréticuline

Le repliement des glycoprotéines dans le cycle calnexine (CNX)/calréticuline (CRT) commence en même temps que la traduction lorsque les protéines nouvellement synthétisées émergent dans le RE et sont N-glycosylées. Le CQ débute par l’élimination des deux résidus Glc les plus externes du précurseur oligosaccharidique Glc3Man9GlcNAc2, sous l’action des glucosidases I (GI) et II (GII). La chaîne de glycane devenue monoglucosylée lie alors spécifiquement deux lectines chaperonnes dont la séquence de liaison aux glycanes est hautement conservée : la CNX, membranaire, et la CRT, soluble dans la lumière du RE (Zapun et al. 1997) (Figure 9). Elles possèdent toutes deux un domaine riche en proline, ou domaine P, qui lie spécifiquement d’autres protéines chaperonnes favorisant la maturation et le repliement des glycoprotéines. Trois chaperonnes spécifiques sont connues pour se lier à la CNX et à la CRT. La PDI ERp57, la première des trois chaperonnes découverte, qui catalyse l’oxydation et l’isomérisation des liaisons disulfure des glycoprotéines (Patel et al. 2020) et deux autres chaperonnes, la cyclophiline B (Kozlov et al. 2010, Sakono et al. 2014) et ERp29, qui réalisent respectivement l’isomérisation des liaisons peptidiques et la fonction générale de protéine chaperonne.
La GII élimine ensuite le dernier résidu glucose de l’oligosaccharide, ce qui empêche la liaison à la CNX et à la CRT. Si à ce stade la protéine n’a pas encore adopté sa conformation native, l’UDP-Glucose:glycoprotéine glucosyltransférase (UGGT), un senseur du repliement des protéines qui opère en association avec la sélénoprotéine F (SELENOF) (Yim et al. 2018), rajoute le dernier résidu de glucose qui vient d’être éliminé pour permettre à la glycoprotéine de se lier à nouveau à la CNX et à la CRT. De cette façon, l’UGGT constitue un checkpoint du CQ des protéines en reconnaissant spécifiquement les glycoprotéines Man9GlcNAc2 mal repliées et en les renvoyant à la CNX/CRT pour un nouveau cycle de repliement (Kozlov and Gehring 2020).
Le cycle se poursuit autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que la glycoprotéine atteigne la conformation native qui n’expose alors plus de domaines hydrophobes à sa surface et n’est donc plus reconnue par l’UGGT ou alors est envoyé vers la voie de dégradation. Elle est ensuite déglucosylée et partiellement démmanosylée par la GII et l’ER mannosidase I (ERManI), respectivement, puis quitte le RE en direction de l’appareil de Golgi. Au cours de ce transit, les protéines sont prises en charge par d’autres lectines se liant aux glycanes riches en mannose comme ERGIC53, ERGL ou VIP36, au niveau de l’ER to Golgi intermediate compartment (ERGIC). Les protéines ciblées vers le RE sont pour la plupart N-glycosylées par le complexe OST à la sortie du translocon. Les deux premiers glucoses sont éliminés par les glucosidases I et II, laissant un glycane monoglucosylé. Dans cet état, le glycane est reconnu par la calnexine et la calréticuline qui, avec d’autres chaperonnes, assurent le repliement oxydatif des glycoprotéines. Leur dissociation de la calnexine ou de la calréticuline est suivie de l’élimination du dernier glucose par la glucosidase II. Le repliement et l’adoption d’une conformation native permettent la sortie de la glycoprotéine du RE. Les glycoprotéines qui n’adoptent pas une conformation native sont reconnues par l’UGGT qui reglucosyle les substrats, et rétablit leur liaison à la calnexine et à la calréticuline ou de les éliminer par la glucosidase II. Les glycoprotéines qui n’atteignent pas la conformation native sont retirées du cycle calnexine/calréticuline par l’intermédiaire de mannosidases et rétrotransloquées vers le cytosol par le biais de la machinerie ERAD (Adams, Oster, and Hebert 2019).
Si après plusieurs cycles de repliement une glycoprotéine n’atteint pas sa conformation native, un processus de dégradation est initié dans le RE. Un tiers des protéines qui transitent par le RE sont dégradées avant qu’elles n’atteignent leur conformation native (Schubert et al. 2000). L’élimination de trois ou quatre résidus de mannose liés en 1,2 est un signal d’entrée dans la voie ER-associated degradation (ERAD) qui assure la rétrotranslocation de la protéine à travers la membrane du RE, son ubiquitination, puis sa dégradation par le protéasome. L’enzyme impliquée dans l’élimination des molécules de mannose est ERManI, une protéine résidente de vésicules spécialisées dans le CQ, les quality control vesicles (Benyair et al. 2015), où elle est assistée par l’ER-degradation-enhancing mannosidase-like 1 (EDEM1) dont l’activité mannosidase augmente sur les glycoprotéines dénaturées (Shenkman et al. 2018). La rétro-translocation de la chaîne peptidique nécessite un mécanisme de transport. La famille des Derlin (Der) qui sont des composantes essentielles du complexe ERAD, sont de bons candidats pour cette tâche même si leur absence ne bloque pas complètement la rétro-translocation des glycoprotéines (Mehnert, Sommer, and Jarosch 2014, Wahlman et al. 2007). D’autres protéines comme l’E3 ligase Hdr1 (Carvalho, Stanley, and Rapoport 2010, Horn et al. 2009) et la protéine Cdc48/P79 (Lipson et al. 2008) sont aussi évoquées pour ce rôle.

Le stress du RE

La traduction de l’ARN messager (ARNm) et la synthèse et la sécrétion des protéines sont des processus qui répondent immédiatement et de manière réversible aux changements de l’homéostasie intracellulaire et aux stimuli externes. Leurs taux sont très variables selon le type cellulaire. Les cellules sécrétrices spécialisées telles que les cellules β acineuses, les cellules β-pancréatiques, les plasmocytes ainsi que les cellules cancéreuses qui présentent des taux élevés de prolifération et de synthèse protéique, ont besoin d’un environnement qui facilite un repliement et un CQ efficaces dans le RE. L’altération de l’homéostasie du RE peut provenir de facteurs multiples comme l’augmentation des niveaux de synthèse des protéines et l’accumulation de protéines mal repliées, l’altération de la N-glycosylation ou de l’ubiquitination et de la dégradation des protéines, un défaut d’autophagie, un déficit énergétique, un excès ou une carence en nutriments, la dérégulation des niveaux de Ca2+ ou de l’homéostasie redox, un contexte inflammatoire et hypoxique (Zhang et al. 1997, Xu, Bailly-Maitre, and Reed 2005). Ceci engendre un état qui peut être physiologique ou physiopathologique connue sous le nom de stress du RE (Wang and Kaufman 2016, Hetz 2012, Benyair, Ron, and Lederkremer 2011,
Ghemrawi and Khair 2020, Hwang and Qi 2018). Cet état induit l’activation d’une réponse visant à rétablir l’homéostasie du RE désigné sous le nom unfolded protein response (UPR) (Walter and Ron 2011). Si cette réponse ne permet pas de rétablir l’équilibre, elle engendre un processus de mort cellulaire programmée, l’apoptose (Urra et al. 2013).

La réponse UPR

L’UPR est une réponse cellulaire visant à augmenter la capacité de repliement des protéines, stimuler la dégradation des protéines mal repliées via ERAD, diminuer la biosynthèse des protéines, augmenter la réponse antioxydante et la biosynthèse des lipides qui composent la membrane du RE afin de rétablir l’homéostasie (Schroder and Kaufman 2005, Read and Schroder 2021). Des travaux ont montré que la quantité de BiP augmente lors d’un stress prolongé du RE (Bakunts et al. 2017). Le rôle de BiP est actuellement débattu. En absence de stress BiP pourrait être présente sous la forme inactive d’oligomères dans la lumière du RE capable de lier trois protéines membranaires senseurs de l’UPR : l’inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease (IRE1), l’eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 (eIF2AK3/PERK) et l’activating transcription factor 6 (ATF6) (Ron and Walter 2007). En condition de stress, les protéines substrats de BiP exposant leurs domaines hydrophobes entreraient en compétition avec ces senseurs pour la liaison à BiP, sa dissociation aux senseurs entraînant leur activation (Read and Schroder 2021). Cependant, une seconde hypothèse développée par Ron et collaborateurs propose que les protéines mal repliées agiraient directement avec les senseurs. Dans ce scénario, BiP constituerait la première ligne de réponse aux fluctuations des niveaux de protéines mal repliées, précédant ainsi l’activation directe des senseurs par ces protéines (Preissler and Ron 2019).
Qu’elle soit directe ou indirecte, l’activation, suite à un stress du RE, de chacun des trois senseurs de l’UPR, IRE1α, eIF2AK3/PERK et ATF6, entraîne trois réponses indépendantes. La plus ancienne sur le plan évolutif est consécutive à l’activation d’IRE1α suite à sa dimérisation et son autophosphorylation. IRE1α porte les deux activités serine/thréonine kinase et endoribonucléase. Cette dernière entraîne l’épissage de l’ARNm de XBP1, un facteur de transcription régulant les gènes impliqués dans le repliement des protéines et ERAD. La fonction endoribonucléase est aussi impliquée dans l’IRE1 dependant decay (RIDD) qui réduit le pool d’ARNm en cours de traduction. IRE1α peut aussi, en cas de stress insurmontable, activer l’apoptose par le biais de la voie JNK. La dimérisation et l’auto phosphorylation de PERK entraîne quant à elle une réduction générale de la production de protéines suite à la phosphorylation d’EiF2α. La traduction de certains ARNm est au contraire stimulée, notamment l’ARNm d’ATF4, un facteur de transcription initialement caractérisé comme le cAMP-response element binding protein 2 (CREB2). ATF4 régule l’expression de gènes impliqués dans la réponse antioxydante, la synthèse et le transport d’aa et l’autophagie. Les protéines mal repliées forment des agrégats toxiques qui doivent être dégradés (Bucciantini et al. 2002, Kopito 2000, Stefani and Dobson 2003), lorsque la quantité d’agrégats dépasse la capacité du protéasome, l’activation de l’autophagie est nécessaire (Ogata et al. 2006, Pena-Blanco and Garcia-Saez 2018, Lamark, Svenning, and Johansen 2017). L’autophagie est un processus qui consiste en la formation d’une vésicule intracellulaire appelée phagophore qui emprisonne les composés à dégrader (molécules ou organites (Gump and Thorburn 2011)) suite à sa fusion à un lysosome (Houck et al. 2014).
Enfin l’activation d’ATF6 entraîne sa translocation dans l’appareil de Golgi où il est clivé par deux protéases (site-1 protease et site-2 protease) (Adachi et al. 2008). Le fragment cytosolique ainsi généré est un facteur de transcription qui entre dans le noyau pour enclencher la transcription de gènes cibles similaires à ceux d’XBP1. Ainsi, la voie UPR est une réponse principalement transcriptionnelle.

Stress du RE et stress oxydant, un cercle vicieux

Lors d’une demande accrue de synthèse protéique, la production de H2O2 augmente, ce qui stimule la réponse UPR, augmente l’activité des PDI et celle d’ERO1 (Santos et al. 2009) et engendre une augmentation encore plus forte du taux de ROS, majoritairement d’H2O2 (Appenzeller-Herzog 2011). L’H2O2 fait partie des reactive oxygen species (ROS) au même titre que l’anion superoxide O2•-, les radicaux alkoxy RO•, les radicaux peroxy ROO•, et les radicaux hydroxyl •OH. Ses niveaux doivent être maintenus à un seuil acceptable car son accumulation peut inhiber la formation correcte des liaisons disulfure, conduisant à un mauvais repliement des protéines et donc à un stress du RE. Il existe dans le RE des enzymes capables de dégrader l’H2O2, la péroxyredoxine 4 (Prx4) et les glutathion péroxidase 7 et 8 (GPx7/8) qui réduisent l’H2O2 en eau et oxygène. Elles oxydent aussi les PDI, favorisant ainsi le repliement oxydatif.
Si le stress n’est pas compensé, la réponse UPR devient maladptative et enclenche la mort cellulaire par apoptose suite à l’activation par le facteur de transcription Chop de Gadd34, une protéine recrutant des phosphatases pour déphosphoryler le facteur d’initiation de la traduction EiF2a (Cao and Kaufman 2014, Wang and Kaufman 2016). L’apoptose se caractérise par une rupture de la membrane mitochondriale. La perméabilité de celle-ci dépend principalement des membres pro- et anti-apoptotiques de la famille B-cell lymphoma 2, Bak/Bax et Bcl-2 respectivement (Conus et al. 2000). Lors d’un signal apoptotique, les effecteurs Bak/Bax s’oligomérisent dans la membrane externe pour former des pores (Pena-Blanco and Garcia-Saez 2018), libérant dans le cytosol le cytochrome c et l’apoptosis inducing factor (AIF) (Hetz and Papa 2018, Kim et al. 2006). Le cytochrome c recrute la protéine adaptatrice, Apaf-1 (Apoptotic peptidase activating factor 1) qui active la caspase 9. Cette dernière est la caspase initiatrice puisqu’elle active à son tour d’autres caspases effectrices telles que les caspases 3, caspase 6, et caspase 7, ce qui mène à la fragmentation de l’ADN et à la destruction du cytosquelette (Cullen and Martin 2009, Kitazumi and Tsukahara 2011, Adams 2003, Viswanath et al. 2001). L’AIF provoque lui aussi la condensation de la chromatine et la dégradation de l’ADN mais de façon caspase-indépendante (Artus et al. 2010).
L’excès de ROS entraîne aussi une libération de Ca2+ dans le cytosol à partir du complexe Bak/Bax au niveau du RE, conduisant au clivage de la procaspase 12 située dans la membrane du RE par la calpaïne cytosolique et à l’activation de la voie ASK1/JNK via IRE1α (Pena-Blanco and Garcia-Saez 2018). De mème, l’excès de Ca2+ et de radicaux libres peut activer ERO1 qui conduit à l’activation de CaMKII/JNK (Li et al. 2009). Le Ca2+ libéré en excès pénètre dans la mitochondrie, où il induit une dépolarisation de la membrane externe et l’ouverture de canaux anioniques entraînent la perméabilisation et la lyse des mitochondries. Ce processus inhibe également le complexe III de la chaîne respiratoire et augmente la production des ROS. L’augmentation de la concentration du Ca2+ intracellulaire altère également l’élimination des protéines oxydées par le protéasome, ce qui entraîne une accumulation des protéines anormales et alimente le stress oxydatif (Cecarini, Ding, and Keller 2007, Ding, Dimayuga, and Keller 2006, Halliwell 2006). Ainsi, l’accumulation des protéines mal repliées et la production des ROS génère un cercle vicieux menant à la mort cellulaire (Cao and Kaufman 2014).
Les ROS sont souvent considérées comme des produits toxiques issus du métabolisme cellulaire. Cependant, ils peuvent aussi être des régulateurs de processus physiologiques (Santolini et al. 2019) et servir de signal de prolifération (Bindoli, Fukuto, and Forman 2008, Goffart et al. 2021). De même, l’H2O2 est connu pour potentialiser les effets de l’insuline (Lennicke and Cocheme 2021). On parle donc de stress oxydant lorsque les défenses antioxydantes (enzymes, vitamines, protéines, oligoéléments) sont dépassées par l’excès de ROS (Brigelius-Flohe 2009). Le défi de la recherche actuelle est de déterminer le seuil entre des concentrations physiologiques et pathologiques de ROS (Santolini et al. 2019).

Homéostasie calcique

Le RE : principal réservoir de Ca2+ dans la cellule

Une fonction majeure du RE est de coordonner le transport et le stockage des ions Ca2+. Le RE représente la plus grande réserve cellulaire de Ca2+, sa concentration pouvant atteindre jusqu’à 1 mM, comparativement au cytosol dont la moyenne est de 100 nM (Raffaello et al. 2016). Le Ca2+ joue une fonction clé en tant que second messager cytosolique qui contrôle la contraction musculaire, la sécrétion de protéines, le métabolisme mitochondrial et la mort cellulaire. Plusieurs mécanismes génèrent et maintiennent le gradient de concentration des ions Ca2+ entre le cytosol et le RE. À savoir, la fraction de Ca2+ libre dans le RE varie entre 100-800 μM car la majorité des ions Ca2+ sont liés à la surface de protéines résidentes du RE (Carreras-Sureda, Pihan, and Hetz 2018). Certaines sont des chaperonnes dont la fonction est de permettre aux protéines en cours de synthèse de suivre un repliement tridimensionnel adéquat. Les chaperonnes du RE telles que GRP78/BiP, GRP94 (endoplasmine), la CNX, CRT, GRP170/ORP150 ou ERp57 contiennent de multiples sites de liaison pour le Ca2+. La liaison à faible affinité du Ca2+ de ces chaperonnes est nécessaire pour leur activité mais permet aussi de garder un fort niveau d’ions dans la lumière du RE. Le Ca2+ régule aussi l’activité de certaines mannosidases (Brostrom and Brostrom 2003).
En plus du pouvoir tampon des chaperonnes, quatre types de système de transport différents résident dans la membrane du RE qui contrôlent l’homéostasie calcique, chez les eucaryotes supérieurs : les pompes SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases), les récepteurs IP3 (IP3Rs), les récepteurs de la ryanodine (RYRs) et les protéines STIM, qui peuvent engager les canaux ORAI dans la membrane plasmique. Aucune de ces protéines n’a d’homologue conservé chez la levure, le RE jouant un rôle moins critique dans la régulation de l’homéostasie calcique (Fenech, Ben-Dor, and Schuldiner 2020).

Les pompes SERCA

Les pompes SERCA importent le Ca2+ dans le RE contre son gradient électrochimique par un mécanisme couplé à l’hydrolyse de l’ATP. Elles contribuent ainsi à maintenir une plus forte concentration de Ca2+ dans le RE par rapport au cytosol. Chez les vertébrés il existe 3 sous types de SERCA (SERCA1-3) codés par trois gènes paralogues ATPA1-3, chacun d’entre eux générant d’autres isoformes par épissage alternatif (Guerrero-Hernandez, Dagnino-Acosta, and Verkhratsky 2010, Carreras-Sureda, Pihan, and Hetz 2018). Au total, il existe 10 isoformes de SERCA qui présentent des différences fonctionnelles et des profils d’expression distincts dans les différents tissus et au cours du développement (Samtleben et al. 2013, Altshuler et al. 2012).
À titre d’exemple, la forme SERCA1a est majoritaire dans les muscles à contraction rapide alors que la forme SERCA2a est principalement exprimée dans le muscle cardiaque et les muscles à contraction lente. La forme 3 présente une distribution plus large, exprimée dans les lymphocytes, les cellules épithéliales et endothéliales, les mastocytes et les cellules de Purkinje.
La protéine SERCA comporte dix domaines transmembranaires. L’hydrolyse d’une molécule d’ATP entraîne le passage de deux ions Ca2+ du cytosol vers le RE grâce à ses sites de liaison situés au niveau de ses hélices transmembranaires. Elle est régulée (négativement) par des protéines résidentes du RE, notamment des protéines chaperonnes, des thiorédoxine réductases et des gluthation peroxydases (John, Lechleiter, and Camacho 1998, Ushioda et al.
2016). En effet, la quatrième boucle luminale (L4) possède une paire de cystéines conservées au cours de l’évolution qui permettent le recrutement de protéines comme la SELENON, ERp57 ou CNX (Figure 10). Il est notamment suggéré que la SELENON forme une interaction thiol/sélénol-disulfure avec SERCA2 pour augmenter son activité de pompe calcique (Marino et al. 2015), de la même façon que SERCA1a requiert un pont disulfure dans le boucle L3V pour être totalement actif (Daiho et al. 2001). La lactone thapsigargine, une protéine extraite de la Thapsia garganica (une plante du bassin méditerranéen) inhibe les différentes pompes SERCA avec la même efficacité (Lytton, Westlin, and Hanley 1991).
Les dix domaines transmembranaires sont représentés en vert, à l’exception de l’extension C-terminale spécifique de SERCA2b en orange. Bien que cette extension C-terminale comprenne également un site consensus de N-glycosylation, cette modification n’a jamais été démontrée pour SERCA2b (indiqué par un point d’interrogation). La boucle L4 avec son pont disulfure conservé est représenté en marron clair. Les modulateurs redox agissant à ce niveau sont énumérés. GPx8 pourrait ne pas influencer directement le pont disulfure, car cette enzyme n’est pas une oxydoréductase mais une peroxydase (Appenzeller-Herzog and Simmen 2016).

Les canaux récepteurs de la ryanodine et à l’IP3

Dans le sens inverse, il existe deux types de canaux ioniques permettant la libération de Ca2+ à partir du RE vers le cytosol, les récepteurs de la ryanodine (RYR), principalement exprimés dans les tissus excitables comme les muscles et les neurones, et les récepteurs de l’inositol-1,4,5-trisphosphate IP3 (IP3R), exprimés dans tous les tissus de mammifères. Ces deux types de canaux sont de larges assemblages homo- ou hétéro-tétramériques présentant de fortes homologies de structure (Figure 11).
Outre la ryanodine, un alcaloïde issu de la plante Ryania speciosa, les effecteurs de RYR1 comprennent des ions et de petites molécules (Ca2+, Mg2+, adénine-nucléotides) et des polypeptides (calmoduline, FKBP12) (Lacampagne, Fauconnier, and Richard 2008). Toutefois une exposition prolongée à une forte concentration en Ca2+ inhibe l’ouverture du canal RyR2 (Dulhunty et al. 2000).
L’IP3R existe sous trois formes (IP3R1-3) codées par des gènes différents et exprimées différemment selon les tissus. L’IP3R1 est le plus rependu et il est fortement exprimé dans les neurones (Fujino et al. 1995) alors que l’expression d’I3PR2 est faible dans l’ensemble des tissus, l’expression la plus importante se situant dans des cellules sécrétrices au niveau du canal urinaire, des glandes sous mandibulaires ainsi que dans les veines et artères des reins. L’expression des messagers IP3R3 est aussi plus importante dans les cellules sécrétrices comme l’épithélium du petit intestin et dans les cellules acineuses salivaires et pancréatiques (Fujino et al. 1995). Les RyR existent aussi sous trois formes issues de gènes différents (RyR1-3). La première est exprimée dans le muscle squelettique, la seconde dans le muscle cardiaque et les cellules β-pancréatiques. La troisième a été découverte dans le cerveau et elle est exprimée dans de nombreux tissus, mais elle reste peu connue (Santulli et al. 2018).
La numérotation utilisée est celle du RyR1 de lapin et du IP3R1 de rat. NTD, domaine N-terminal ; SD, domaine suppresseur ; IBC, site de liaison IP3 ; TMD, domaine transmembranaire ; CTT, site C-terminal de liaison à la calmoduline (Amador et al. 2013).
Les IP3R quant à eux s’ouvrent suite à l’activation à la membrane plasmique des récepteurs couplés aux protéines G et des récepteurs tyrosine kinases, et à l’hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate en l’IP3 et diacylglycérol (DAG) par la phospholipase C. La liaison conjointe de l’IP3 et du Ca2+ active l’IP3R et la sortie de Ca2+ du RE vers le cytosol. Comme pour le RYR, le Ca2+ à lui seul peut activer l’IP3R, un processus connu sous le nom de libération de Ca2+ induite par le Ca2+ (Figure 12) (Berridge 2002). Ces vagues calciques ont notamment été observées dans les neurones pyramidaux de l’hippocampe (régions CA1 et CA3), du cortex (couches 2/3 (L2/3) et L5) et des neurones principaux de l’amygdale des rongeurs (Ross 2012) afin de maintenir une signalisation sur de longues distances. Elles ont également été observés dans les neurones pyramidaux du cortex de la tortue (Larkum et al. 2008), Étant donné que les tortues ont divergé des mammifères il y a plus de 300 millions d’années et occupent une niche écologique différente, cette découverte suggère que les vagues calciques ont évolué tôt et sont une propriété robuste et conservée des neurones pyramidaux.
L’état redox du RE tient une place centrale dans la régulation de l’ouverture de ces canaux (Joseph et al. 2018, Nikolaienko, Bovo, and Zima 2018). Chaque sous-unité RYR compte entre 38 et 48 thiols à l’état libre, modifiables par oxydation, S-nitrosylation ou alkylation. Son état d’activation répond de manière biphasique à l’administration de doses croissantes d’oxydants, le maximum d’activation se situant pour un état impliquant 23 cystéines réduites (Sun et al. 2001). L’IP3R possède aussi un pont disulfure régulateur, au niveau de la boucle L3 qui émerge dans la lumière de RE entre les domaines membranaires V et VI, dont l’état redox conditionne la liaison avec un certain nombre d’oxydoréductases et de protéines chaperonnes comme ERp44 (Figure 13) (Appenzeller-Herzog and Simmen 2016). L’IP3R possède plusieurs sites de phosphorylation (Appenzeller-Herzog and Simmen 2016) ainsi que des sites d’arrimage pour les phosphatases et protéines kinases. La phosphorylation permet d’augmenter la sensibilité pour l’IP3 sans changer celle pour le Ca2+ (Vanderheyden et al. 2009). Il est aussi glycosylé au niveau de la boucle intracellulaire L3V sur un séquon présentant une cystéine.
L’activation des IP3R commence au niveau de la membrane plasmique (PM), où l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) entraîne la dissociation de la protéine hétérotrimérique Gq. Gq active la PLC, qui clive le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en inositol trisphosphate (IP3) et en diacylglycérol (DAG). L’IP3 sert de second messager et active l’IP3R, provoquant la libération de Ca2+ dans le RE. Alternativement, RyR est activé par la cADPR, qui est synthétisé dans l’espace extracellulaire à partir du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) par l’ectoenzyme CD38. IP3R et RyR sont eux-mêmes activés par le Ca2+ et peuvent se stimuler l’un l’autre (CICR). L’augmentation du Ca2+ cytosolique qui en résulte est normalisée par l’ATPase de la membrane plasmique (PMCA), ou par SERCA, qui rejettent le Ca2+ dans le milieu extracellulaire ou le RE, respectivement (Karagas and Venkatachalam 2019).
A. Les six domaines TM sont représentés en bleu, parmi lesquels les deux derniers domaines sont étiquetés V et VI. La boucle luminale L3 est constituée de deux parties hydrophiles nommées L3V et L3C, séparées par une petite séquence hydrophobe qui plonge dans la membrane. L3V, avec sa paire de cystéines conservées, et L3C sont représentées en brun clair. Les statuts redox des paires de cystéines présentes dans IP3R1–3 n’ont pas encore été résolus (comme indiqué par un point d’interrogation). Les positions des oligosaccharides N-liés dans L3V sont indiquées en noir. Le pore du canal calcique fermé (rouge clair) est composé par les domaines TM V et VI et par les boucles L3 des sous-unités constituant le tétramère. Les interacteurs redox démontrés avec IP3R1 sont répertoriés. On peut noter que la partie cytosolique N-terminale est beaucoup plus grande que celle représentée sur la figure. B. Alignement des séquences d’acides aminés de la boucle L3V dans les IP3R humains. Les N-glycanes sont indiqués en noir. Les paires de cystéines conservées sont encadrées en brun clair. La position des acides aminés terminaux par rapport aux protéines entières est indiquée en exposant (Appenzeller-Herzog and Simmen 2016).
Dans les neurones, la morphologie entraîne des contraintes sur l’architecture du RE mais la libération de Ca2+ par le RE influence aussi la structure de ces cellules (Ozturk, O’Kane, and Perez-Moreno 2020). En effet, l’homéostasie calcique du RE joue un rôle central dans la physiologie des neurones en régulant la morphologie et la croissance axonale, l’exocytose, la plasticité, l’expression de gènes et la régulation de l’activité mitochondriale (Karagas and Venkatachalam 2019). Ainsi, chez la drosophile l’inhibition des canaux IP3R ou RyR dans les motoneurones, se traduit par une diminution du nombre de boutons synaptiques et une augmentation de leur taille (Wong et al. 2014), révélant un lien fonctionnel entre le flux calcique et le développement des synapses. A l’inverse, une surexpression des canaux RyR entraîne un relargage des vésicules synaptiques (Galante and Marty 2003).

Flux calciques au niveau des mitochondria-associated ER membrane

En condition normale, le Ca2+ est majoritairement présent dans la lumière du RE. Lors d’une stimulation, de petites quantités de Ca2+ sont périodiquement libérées dans le cytoplasme puis reséquestrées, avec une partie recapturée par la mitochondrie (Berridge 2002, Raffaello et al. 2016). Dans le contexte d’un stress, un dialogue croisé s’instaure entre le RE et la mitochondrie afin d’augmenter la production d’ATP (Bravo et al. 2011). On pense que celle-ci est médiée par la libération du Ca2+ à partir du RE et son entrée dans la mitochondrie par le biais de structures spécialisées, les MAM.
Les MAM sont des zones de contact entre le RE et la mitochondrie riche en lipid raft résistant aux détergents dont la distance entre les membranes des deux organites varie de 10 à 30 nm (Giacomello and Pellegrini 2016). Environ 12 % de la membrane externe mitochondriale est associée au RE (Csordas et al. 2006). Elles ont suscité un grand intérêt car elles fonctionnent comme un nœud de signalisation, contrôlant différents aspects de la biologie cellulaire tels que la biosynthèse des lipides, le transfert de Ca2+ entre le RE et les mitochondries, l’apoptose et la macroautophagie (Phillips and Voeltz 2016). Leur dysfonctionnement est associé à différentes pathologies, en particulier dans le système nerveux central, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou encore la maladie d’Alzheimer (Pham et al. 2012, Parakh and Atkin 2021, Area-Gomez et al. 2018).
Des protéines caractéristiques de ces structures sont les mitofusines 1 et 2, présentes au niveau des mitochondries et du RE et impliquées dans leur rapprochement (Figure 14) (Bartok et al. 2019). L’IP3R est aussi enrichi dans ces structures, en particulier IP3R2 et IP3R3, où il est en contact avec les Voltage Dependent Anion Channel (VDAC) par l’intermédiaire de la chaperonne GRP75 qui recrute aussi d’autres protéines telles que Park-7 et FUNDC (Szabadkai et al. 2006). Cette interaction facilite le passage des ions Ca2+ du RE vers la mitochondrie. Outre leur rôle dans le rapprochement des membranes du RE et de la mitochondrie, les mitofusines facilitent le rapprochement de l’IP3R avec les VDAC de même que la protéine TOM70 (Filadi et al. 2018). L’interaction de VDAC avec le mitochondrial calcium uniporter (MCU) assure le passage du Ca2+ au travers de la membrane interne.
Association de l’IP3R avec VDAC1 par l’intermédiaire de Grp-75. Les mitofusines permettent le rapprochement du RE et de la mitochondrie (Degechisa, Dabi, and Gizaw 2022).

Biosynthèse atypique des sélénoprotéine

Le Sélénium

En 1817, le chimiste Jöns Jacob Berzelius découvrit un nouvel élément qu’il décida de nommer « sélénium » (Se), dérivé du nom donné à la déesse grecque de la Lune « Séléné » (Duntas et Benvenga, 2015), par analogie avec le « tellurium » dont le nom vient de la déesse de la terre romaine « Tellus ». L’importance de cet élément a été montré 140 ans après sa découverte (Schwarz et Foltz, 1957), à la suite d’études montrant qu’il s’agit d’un oligo-élément à action antioxydante indispensable pour les êtres vivants (pour revue, Papp et al., 2007).
Le sélénium est apporté principalement par l’alimentation, notamment par les poissons, les viandes, les produits laitiers et certains fruits et légumes (Kieliszek 2019). Il joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie cellulaire, immunitaire, endocrine et métabolique (Rayman, 2009). Il est important dans la maturation de l’hormone thyroïdienne et le développement de la fonction musculaire (Hatfield et al., 2014; Lescure et al., 2009). Une baisse de Se dans l’organisme peut être provoquée par divers facteurs, comme le vieillissement, la consommation d’alcool, le tabagisme et l’utilisation de contraceptifs oraux (Lloyd et al., 1983). La déficience en Se (moins de 12 µg/jour) est associée à de nombreux problèmes de santé comme la maladie de Keshan (hypertrophie et dysfonctionnement du muscle cardiaque), la maladie de Kashin-Beck (maladie des « gros os », une maladie invalidante de l’os et du cartilage), des maladies cardiovasculaires et des accidents vasculaires cérébraux (Duntas et Benvenga, 2015). En revanche, l’excès de sélénium (plus de 400 µg/jour) est toxique et conduit à l’apparition d’une variété de symptômes comme la chute des phanères (cheveux, ongles…), un érythème cutané, une grande fatigabilité, des états dépressifs, une irritabilité et des dommages neurologiques dans les cas d’intoxication les plus graves (Duntas et Benvenga, 2015; Hatfield et al., 2014). La plage optimale de consommation serait comprise entre 80 et 120 µg/L de sérum (Duntas et Benvenga, 2015).
Le Se est principalement incorporé dans des protéines, nommées sélénoprotéines, sous la forme du résidu sélénocystéine (Sec/U). Ce 21ème aa protéinogène est un homologue structural de la cystéine (Cys) dans lequel l’atome de soufre est substitué par un atome de Se. La Sec est plus réactive que la Cys envers les ROS, grâce à son atome de Se lui conférant à la fois un pouvoir nucléophile plus élevé et un pKa (pH de demi-dissociation) plus faible (Reich and Hondal 2016, Arner 2010). Le Se serait plus résistant à la suroxydation en sélénone que le S en sulfone et il aurait une capacité à être réduit en sélénide plus rapidement que le S (Figure 15) (Reich and Hondal 2016). Ces propriétés physico-chimiques procurent un rôle antioxydant plus ou moins établi à toutes les sélénoprotéines. Certaines d’entre elles, les thiorédoxine réductases notamment, sont essentielles pour la régulation de l’homéostasie redox (Barrett, Short, and Williams 2017). Il est à noter que le Se peut aussi être introduit dans les protéines sous la forme de sélénométhionine, notamment chez certaines plantes et bactéries (Schrauzer 2000).
Les flèches montrent les voies de conversion entre les états d’oxydation. Le cercle ouvert représente le carbone, et le nombre à l’intérieur du cercle représente le nombre d’oxydation du soufre ou du sélénium auquel il est attaché. Le X magenta indique une réaction lente. Le symbole [O] représente un oxydant à deux électrons (Reich and Hondal 2016).

Biosynthèse et insertion de la sélénocystéine

Chez les archéobactéries et les eucaryotes, la Sec n’existe pas à l’état libre dans les cellules. Elle est synthétisée directement sur son ARNt spécifique (ARNt[Ser]Sec) à partir de la sérine. Cet ARNt est codé par le gène Trsp. L’invalidation de ce gène chez la souris est liée à une absence de production des sélénoprotéines, à un développement anormal du squelette et du cartilage et à une mort précoce des embryons (Downey et al. 2009). Chez les eucaryotes, la biosynthèse de la Sec commence tout d’abord par l’association d’une sérine à l’ARNt[Ser]Sec, catalysée par la séryl-ARNt synthétase (SerS), puis par sa modification en phosphosérine grâce à la phosphoséryl-ARNt kinase (PSTK). En parallèle, le Se, transformé en sélénophosphate à l’aide de la sélénophosphate synthase 2 (SPS2), est transféré au PSer-ARNt[Ser]Sec grâce à la Sec synthétase (SecS, codée par le gène SelA), aboutissant à la formation du Sec-ARNt[Ser]Sec (Figure 16) (Xu et al. 2007, Yuan et al. 2006).
Contrairement aux autres aa qui disposent d’un ou plusieurs codons, la Sec ne possède aucun codon dédié. Le mécanisme d’incorporation de la Sec demeura énigmatique jusqu’au jour où fut découverte la présence d’un codon stop UGA à la position correspondant au résidu Sec (Chambers et al. 1986, Zinoni, Heider, and Bock 1990). Ce phénomène de recodage du codon stop n’est pas unique : le 22ème aa appelé pyrrolysine est incorporé chez certaines archéobactéries méthanogènes au niveau d’un codon UAG normalement reconnu comme codon stop (Osawa et al. 1992).
La séryl-ARNt synthétase (SerS), en présence d’ATP, catalyse la liaison de la sérine avec l’ARNt[Ser]Sec pour donner la Ser-ARNt[Ser]Sec. Le résidu sérine est ensuite phosphorylé par une o-phosphoséryl-ARNt kinase (PSTK) pour donner la PSer-ARNt[Ser]Sec. La Sec synthase (SecS) prend en charge le résidu sérine phophorylé (PSer-ARNt[Ser]Sec) et le convertit, en présence de sélénophosphate produit par la sélénophosphate synthétase (SPS2), en Sec-ARNt[Ser]Sec (modifié d’après Hatfield et al., 2014).
La translecture du codon stop UAG et l’insertion concomitante du résidu Sec nécessite une machinerie spécialisée. Ainsi, Les ARNm des sélénoprotéines comprennent dans leur région 3′ non traduite une séquence de 60 nucléotides qui adopte une structure tige-boucle désignée sous le nom de selenocysteine insertion sequence (SECIS), située entre 300 et plusieurs milliers de nucléotides du codon stop UGA qu’elle va permettre de recoder en codon Sec (Berry et al. 1993). Pour cela, la structure SECIS lie un complexe protéique de 500 kDa comprenant SBP2 (SECIS binding protein 2). Ce complexe agit comme une plateforme de recrutement pour d’autres facteurs comme eEFSec (facteur d’élongation eucaryote sélénocystéine-ARNt spécifique) et la protéine ribosomique L30, qui va permettre d’amener l’ARNt [Ser]Sec en face d’un codon UGA spécifique au cours de l’étape d’élongation de la traduction (Figure 17) (Serrao et al. 2018, Copeland et al. 2000, Lescure et al. 2002). D’autres composants du complexe ont été identifiés qui régulent négativement (eIF4A3) ou positivement (Nucléoline) l’expression des sélénoprotéines (Miniard et al. 2010, Budiman et al. 2009). Leur expression dépend principalement de l’abondance des ARNm et de l’efficacité de leur traduction (Krol 2002, Hatfield et al. 2006).
Sur cette figure apparaissent les deux facteurs eEFSec et SPB2, nécessaires pour décoder le codon UGA en Sec. Ces protéines appartiennent à un complexe plus important qui se lie sur une séquence particulière de l’ARNm des sélénoprotéines, la Selenocystein Insertion Sequence (SECIS), repliée en épingle à cheveux. D’autres facteurs moins bien connus, appartenant au même complexe, semblent aussi impliqués, tels que la protéine ribosomique L30, la nucléoline et un facteur eucaryote d’initiation de la traduction elF4a3 (Taylor et al. 2016).
Lorsque les ARNm de sélénoprotéines sont surexprimés dans les cellules, l’incorporation de la Sec est limitée par la disponibilité de certains facteurs intervenant dans la biosynthèse des sélénoprotéines, comme SBP2 (Peng et al. 2021). La disponibilité en SBP2 elle-même est contrôlée par l’état redox de la cellule (Allmang, Wurth, and Krol 2009). L’oxydation de SBP2 lors des conditions de stress oxydatif conduit à son accumulation dans le noyau, ce qui bloque l’incorporation de la Sec et entraîne un arrêt prématuré de la traduction des sélénoprotéines (Papp et al. 2006). Plusieurs facteurs de transcription comme Nrf2, Keap1 et NF-ĸB, impliqués dans la régulation transcriptionnelle de l’expression des sélénoprotéines sont aussi sensibles à l’homéostasie redox (Banning et al. 2005, Sakurai et al. 2005, Zhang et al. 2011). Des mutations du gène sbp2 chez l’homme provoquent de nombreuses manifestations cliniques associées à une déficience en sélénoprotéines telles que l’azoospermie, la dystrophie musculaire, une déficience immunitaire et l’augmentation de la sensibilité à l’insuline (Schoenmakers et al. 2010).
La traduction des sélénoprotéines dépend aussi de la disponibilité en Se (Sunde and Raines 2011, Hill, Lyons, and Burk 1992, Lei et al. 1995, Schomburg and Schweizer 2009). Certaines sélénoprotéines, essentielles, comme les thiorédoxine réductases 1 et 2 (TrxR1 et TrxR2) et la GPx4 sont moins affectées par une déficience en Se que d’autres sélénoprotéines (Sunde and Raines 2011, Hadley and Sunde 2001, Lei et al. 1995). Cette régulation « hiérarchique » de l’expression des sélénoprotéines se produit à la fois au niveau des ARNm et au niveau de la traduction (Labunskyy, Hatfield, and Gladyshev 2014). Il existe deux isoformes de l’ARNt[SerSec] mm5U et l’ARNt[SerSec] mm5Um qui diffèrent par la méthylation d’un ribose en position 34, une étape influencée par les niveaux de Se et qui conditionne la structure tertiaire de l’ARNt[SerSec] (Carlson et al. 2005, Kim et al. 2000). La méthylation est une modification spécifique des sélénoprotéines sensibles au stress. L’expression de ces protéines est aussi influencée par les niveaux du facteur d’élongation eIF4a3, lui-même surexprimé en carence de Se. Ce facteur se lie dans la partie 3’ non traduite des ARNm de ces protéines au même niveau que SBP2, bloquant ainsi leur traduction. Les ARNm de ces dernières sont généralement dégradés par la voie RIDD qui permet d’éliminer les transcrits présentant un codon stop prématuré (Labunskyy, Hatfield, and Gladyshev 2014, Low et al. 2000).
La recherche systématique par bio-informatique de l’élément SECIS dans la région 3’ non traduite des ARNm à permit l’identification de vingt-cinq sélénoprotéines humaines (24 chez la souris du fait de la substitution de la Sec par une Cys dans GPx6) (Kryukov, Kryukov, and Gladyshev 1999, Santesmasses, Mariotti, and Gladyshev 2020a). Toutes ont dans leur séquence un seul résidu Sec, à l’exception de la sélénoprotéine P (SelP, SELENOP) qui en contient jusqu’à dix chez l’homme. Elle est produite dans le foie et sécrétée dans le plasma pour alimenter en Se les différents tissus de l’organisme. De façon surprenante, une approche basée sur la détection de résidus Sec par spectrométrie de masse a permis d’identifier récemment cinq sélénoprotéines candidates dépourvues de séquence SECIS. Le mode d’incorporation de la Sec dans ces protéines pourrait résulter d’un mécanisme de biosynthèse totalement différent impliquant, ou non, une séquence de type SECIS inconnue jusqu’à présent. Il se pourrait donc que d’autres sélénoprotéines de ce type soient découvertes à l’avenir (Guo et al. 2018).

Les membres majeurs

La première sélénoprotéine identifiée est la gluthation péroxydase (GPx1) (Chambers et al. 1986, Flohe, Gunzler, and Schock 1973, Forstrom, Zakowski, and Tappel 1978). Chez l’Homme, la famille des GPx comprend huit isoformes codées par des gènes différents dont cinq seulement (GPx1, GPx2, GPx3, GPx4, GPx6) sont des sélénoprotéines. La Sec est localisée dans leur partie N-terminale au sein d’un motif thioredoxin fold (Kryukov et al. 2003, Margis et al. 2008). Les GPx1-4 sont des acteurs principaux de la défense antioxydante capable de réduire les hydroperoxydes organiques et le peroxyde d’hydrogène en oxydant le glutathion (Arthur 2000, Fu et al. 1999). Chez l’Homme la mutation de GPx1 est associée à la maladie de Keshan. La GPx4 est la seule parmi les quatre à pouvoir réduire les hydroperoxydes lipidiques. Si l’invalidation de GPx4 est létale in utero chez la souris, elle est délétère à un stade plus avancé chez l’Homme (Santesmasses, Mariotti, and Gladyshev 2020b).
La thiorédoxine réductase (TrxR), ainsi que le thiorédoxine (TRX) et le NADPH font partie du système thiorédoxine (Arner 2010). La TrxR est un dimère capable de réduire la TRX en utilisant le NADPH (Tamura and Stadtman 1996). La grande réactivité du site actif permet une interaction avec une large gamme de substrats comme les sélénites, les hydroperoxydes, les TRX, la GPx et les PDI (Ren et al. 2018, Papp et al. 2007). La Sec se situe à l’extrémité C-terminale. Elle a un site de liaison pour le FAD et le NADPH. Il existe trois isoformes de TrxR chez l’Homme, toutes des sélénoprotéines : TrxR1, cytosolique, TrxR2, mitochondriale et TrxR3 de distribution plus large (Ren et al. 2018). TrxR3 possède en plus un domaine glutarédoxine (Grx) dans son extrémité N-terminale (Lu and Holmgren 2014), similaire à la gluthation réductase (Sandalova et al. 2001). TrxR1 régule le statut redox de la cellule (Anestal and Arner 2003, Sun and Gladyshev 2002) et tient un rôle anti-apoptotique en réduisant la TRX qui peut se lier à la kinase ASK1. TrxR2 joue un rôle similaire mais durant l’embryogénèse (Conrad et al. 2004). TrxR3 est surtout exprimée dans les testicules où elle est impliquée dans la maturation des spermatozoïdes en participant à l’isomérisation des ponts disulfures de protéines régulant la spermatogénèse (Su et al. 2005). L’invalidation de TrxR1 ou TrxR2 chez la souris est létale in utero. La perte de fonction de TrxR1 est également létale chez l’Homme contrairement à celle de TrxR2 qui est tolérée (Jakupoglu et al. 2005, Li, Bandyopadhyay, et al. 2012).
Les iodothyronines déiodinases comportent trois enzymes transmembranaires chez les mammifères (DIO1, DIO2 et DIO3) qui éliminent un résidu d’iode des hormones thyroïdiennes (Behne et al. 1990, Berry, Banu, and Larsen 1991). DIO1 et DIO2 convertissent la prohormone sécrétée thyroxine (T4) en tri-iodothyronine (T3), la forme hormonale circulante et active dans les tissus (Bianco et al. 2002). DIO3, elle, est l’enzyme permettant de désactiver la T3 et la T4 en 3,3’-diiodothyronine T2 et rT3 (T3 reverse), des formes non reconnues par les récepteurs nucléaires. De façon surprenante, si la perte de fonction des déiodinases est létale chez l’Homme, elle est tolérée chez la souris (Santesmasses, Mariotti, and Gladyshev 2019).
La méthionine-R-Sulfoxyde Réductase 1 (MSRB1) est une sélénoprotéine contenant, en plus de l’atome de Se, un atome de zinc. Elle a initialement été identifiée à l’aide d’outils bioinformatiques (Kryukov, Kryukov, and Gladyshev 1999, Lescure et al. 1999). MSRB1 peut protéger les protéines contre les dommages oxydatifs en catalysant la réduction de méthionines sulfoxyde en méthionines (Tsuji et al. 2021).
La Sélénophosphate Synthétase 2 (SEPHS2) synthétise le monosélénophosphate requis pour la synthèse de la Sec à partir de sélénide (Se2-) et d’ATP (Veres et al. 1994). SEPHS2 est une sélénoprotéine cytosolique que l’on retrouve chez tous les procaryotes et eucaryotes.
La sélénoprotéine P (SELENOP) est la seule sélénoprotéine à contenir plusieurs Sec. Elle est présente chez tous les métazoaires, mais sa teneur en Sec est très variable. Chez les vertébrés, le nombre de résidus varie de cinq chez le rat-taupe jusqu’à 37 chez le poisson sériole. La SELENOP humaine et murine contient 10 résidus Sec. C’est une protéine plasmatique synthétisée dans le foie (Carlson et al. 2004) qui assure le transport et la livraison du Se dans les tissus (Saito and Takahashi 2002). L’invalidation de la SELENOP entraîne une baisse du niveau de Se dans le cerveau, les testicules et le rein ainsi que des pathologies sévères (Kasaikina, Hatfield, and Gladyshev 2012).

Les sélénoprotéines dans le cerveau

Le Se est principalement distribué dans le cerveau sous la forme de SELENOP. La SELENOP circulante présente dans le sang et le liquide céphalo rachidien est absorbée par les cellules LRP8-positives (Burk and Hill 2015, Solovyev et al. 2021) au niveau de la barrière hémato encéphalique et du plexus choroïde, puis resynthétisée dans les astrocytes voisins et libérée pour alimenter les neurones LRP8-positifs en Se (Figure 18) (Sasuclark, Khadka, and Pitts 2019). Il est aussi possible que le Se pénètre dans le cerveau sous forme de sucre sélénié (Burk and Hill 2015) ou sous forme de sel de sélénite (en utilisant des transporteurs d’anions présents dans la barrière hémato-encéphalique (Campos-Bedolla et al. 2014), auquel cas il peut être neurotoxique (Vinceti et al. 2017). Les souris invalidées pour la SELENOP présentent de graves dysfonctionnements neurologiques lors du sevrage qui sont en grande partie évités avec un régime enrichi en Se (Hill et al. 2004). Le Se peut aussi être séquestré par la selenium Binding Protein 1 dans les astrocytes, ce qui régule négativement la production de la SELENOP.

Table des matières

Introduction
L’environnement unique du réticulum endoplasmique
I. La N-glycosylation
A. Le cycle du dolichol
B. Le complexe OST
II. Le repliement des protéines
A. Les heat shock proteins
B. Le repliement oxydatif des protéines
C. Le contrôle qualité des glycoprotéines : le cycle calnexine-calréticuline
III. Le stress du RE
A. La réponse UPR
B. Stress du RE et stress oxydant, un cercle vicieux
IV. Homéostasie calcique
A. Le RE : principal réservoir de Ca2+ dans la cellule
B. Les pompes SERCA
C. Les canaux récepteurs de la ryanodine et à l’IP3
D. Flux calciques au niveau des mitochondria-associated ER membrane
La famille des sélénoprotéines
I. Biosynthèse atypique des sélénoprotéine
A. Le Sélénium
B. Biosynthèse et insertion de la sélénocystéine
II. Les membres majeurs
III. Les sélénoprotéines dans le cerveau
IV. La SELENOT
A. Structure de la SELENOT
B. Histoire évolutive de la SELENOT
C. Profil d’expression spatiotemporelle
D. Localisation subcellulaire
E. Fonctions de la SELENOT
L’obésité
I. Généralités
II. Le contrôle central de la prise alimentaire
A. Le noyau arqué
B. Les neurones à POMC
C. Les neurones à NPY
III. Les causes d’un déséquilibre de la balance énergétique au niveau central
A. L’inflammation
B. Le stress du RE
Objectifs de la thèse
Résultats
I. L’expression de la SELENOT est stimulée par le stress oxydant et la leptine dans la lignée mhypoA-POMC
II. Invalidation du gène selenot dans la lignée mhypoA-POMC
III. Étude du phénotype des cellules mhypoA-POMC KO SELENOT
A. Taille du RE, production de POMC et d’α-MSH
B. Stress du RE, apoptose et sénescence
IV. Anomalies de la N-glycosylation des neurones SELENOT KO
V. Orientation du centre redox de la SELENOT
VI. Identification des partenaires redox de la SELENOT dans les cellules mhypoA-POMC
VII. Validation de l’interaction avec IP3R1
Discussion
I. Les cellules mhypoA-POMC déplétées en SELENOT sont sénescentes
II. Défauts de N-glycosylation à la membrane des cellules mhypoA-POMC SELENOT KO
III. Identification des partenaires redox potentiels de la SELENOT
IV. Comparaison de la SELENOT avec les autres sélénoprotéines résidentes du RE
Conclusions et perspectives
Références
Annexe I
Matériels et méthodes
Culture cellulaire et transfections
Plasmides et constructions
Invalidation de la SELENOT par l’approche CRISPR-Cas9
Western blot
Immunopurification des complexes piégés avec la SELENOT-HA
Prélèvement et préparation protéomique
Analyse NanoLC-ESI-MS/MS
Analyse des données protéomiques
Immunohistochimie
Analyse des N-glycomes
Dosage de l’α-MSH
Annexe II
Annexe III
Annexe IV
Résumé de la thèse

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