Introductions de culture in vitro

Introductions de culture in vitro

Matériel et Méthodes

Création du parc de pieds mères

Nettoyage des pieds mères

Afin de commencer l’étude dans les meilleures conditions, le parc de pieds mères existant (Tableau I) a été nettoyé : démoussage (notamment pour éliminer le Marchantia qui étouffe les plants), taille superficielle dans le but de réduire la végétation pour empêcher les plantes de s’envahir les unes les autres, et élimination des plantes trop affaiblies pour être exploitées. A noter que ce parc de PM se trouve sous un tunnel et bénéficie donc de conditions plus favorables que s’ils étaient placés en extérieur.
En parallèle de ce parc de PM, nous avons mis en place un nouveau parc exclusivement constitué de jeunes pousses (Tableau II), la plupart ne présentant encore aucune partie lignifiée. Ces pousses, tout droit sorties de la serre d’acclimatation, présentent des bourgeons issus de l’année n, à la différence des pieds mères du premier parc, qui présentent eux des bourgeons de l’année n-1, voire n-2.
Le but étant de comparer la capacité d’un parc de PM que l’on pourrait qualifier de mature, à fournir du matériel exploitable in vitro, par rapport à un parc reconstitué chaque année à partir des jeunes plants qui sortent de la serre d’acclimatation. Il est tout de même nécessaire de relativiser et de garder à l’esprit que ce que nous considérons ici comme étant mature par rapport aux plants tout juste sortis de l’acclimatation, reste tout de même des plants jeunes qui n’ont en fait que quelques mois, ou au maximum une à deux années.

Variétés travaillées

Les deux parcs de pieds mères réunis contiennent une soixantaine de variétés différentes. Certaines sont représentées dans les deux parcs, mais à des stades de croissance différents. Cela va nous permettre de comparer au sein d’une même variété, l’influence de la juvénilité sur la croissance in vitro.
Certains genres sont fortement représentés comme les Rubus, les Syringa ou encore les Choisya. Les Rubus sont des plantes ligneuses et épineuses de la famille des Rosacées comprenant notamment les framboisiers (à ne pas confondre avec les Morus de la famille des Moracées). Les Rubus forment généralement des arbrisseaux à port sarmenteux à souche vivace ligneuse. Les Syringa, plus connus sous le nom de Lilas, sont des Oléacées qui forment des arbustes à feuilles caduques simples. Les Choisya ou Orangers du Mexique, quant à eux, appartiennent aux Rutacées et forment des buissons aromatiques au feuillage persistant vert ou jaune selon les variétés (J. Briant, 2001).
Mais on retrouve également les genres Albizia, Actinidia, Cotinus, Nandina ou encore Eriostemon. Les Albizia sont également connu de tous sous le nom d’arbres à soie et regroupent une centaine d’espèces caduques.
Les Actinidia sont des plantes caduques originaires d’Asie. La plupart des variétés étant dioïques, des pieds mâles et femelles sont nécessaires à la fructification. Les pieds femelles sont alors capables de fournir des fruits ovoïdes, brun verdâtre a peau duveteuse : les kiwis. Le genre Cotinus réuni des espèces caduques connues pour leurs inflorescences en panache. Les Nandina, originaires d’Asie, présentent un faux air de bambou nain à feuilles persistantes. Leurs feuilles sont vertes teintées de rouge au moment du débourrement, puis deviennent ocres et pourpres. Enfin, l’Eriostemon est un arbuste australien au port naturellement compact et arrondi. Son feuillage vert foncé est persistant et dense, il est apprécié pour sa longue floraison qui dégage un parfum rappelant la fleur d’Oranger (J. Briant, 2001). La liste des différentes variétés ainsi que leur nom vernaculaire est présentée en Tableau I. Le temps de reprise de la végétation variant d’une variété à l’autre, les introductions de culture seront étalées sur plusieurs semaines car il est nécessaire d’attendre que suffisamment de matériel ce soit développé depuis la taille. Les genres Rubus, Cotinus, Choisya et Syringa se développant rapidement, ce seront les variétés qui seront introduites les premières.

Tailles des pieds mères

Dans cette partie de l’étude, nous cherchons à comparer l’état physiologique et l’organisation structurale de nos pieds mères en fonction de différents types de tailles. L’analyse consistera en des observations de l’architecture de divers pieds mères. Au vu des aspects très différents des plants au sein d’une même variété, nous ne prendrons pas de mesures, mais nous mettrons en avant la façon dont répondent les plantes à la première et la seconde taille (ramification, rejets etc).

Premières tailles

Nous avons ensuite effectué des tailles cette fois ci stratégiques (semaine 15) dans le but de favoriser le débourrement des bourgeons dormants, et donc la croissance de pousses juvéniles. Pour la majorité des variétés, la taille correspond simplement à une suppression de l’apex de la plante, dans d’autres cas il est possible de supprimer également des parties lignifiées. Enfin, dans le cas par exemple des Rubus (Figure 4), une taille à ras des parties lignifiées est favorable au débourrement de nombreux bourgeons et à la croissance de rejets.
Au niveau du jeune parc de PM, l’Eriostemon myoporoïdes, de par son organisation structurale très régulière d’un plant à l’autre, nous permet de faire des essais de tailles variées. Sur les huit plants disponibles, deux plants sont taillés au premier niveau de feuilles, deux autres au second, deux au niveau des têtes, et les deux derniers ne sont pas taillés (Figure 5). L’évolution de ces plants d’Eriostemon est présentée en Annexe III.

Secondes tailles

A la suite de la première taille qui se voulait peu sévère, nous avons pratiqué des nouvelles tailles en semaine 19 sur le genre Syringa. Nous avions en effet effectué des tailles hautes (figure 6e) sur six des huit plants pour chaque variété, et des tailles basses (figures 6c et 6d) sur les deux autres plants. En taillant peu sévèrement, nous nous assurions de voir démarrer les points végétatifs qui semblaient évident. En suivant l’évolution des Syringa nous avons réalisé que certains bourgeons, qui pouvaient paraitre latents, ont débourrés eux aussi. C’est pour cela que nous sommes cette fois ci passé sur une taille basse pour l’ensemble rabaissés. des plants. Sur le même principe, les Sambucus ont également été rabaissés. Sur certaines variétés de Choisya, comme ‘GOLDFINGER’, ou encore chez les Cotinus avec la variété ‘GRACE’, il a été nécessaire de tailler au-dessus du premier ou second niveau de feuilles (figure 7), ou au niveau des têtes pour permettre le débourrement des bourgeons axillaires. Pour le genre Rubus, il a été décidé que suite à une introduction in vitro, nous ne conserverions qu’une seule tige sur laquelle des explants ont été prélevés, le reste est taillé à ras aux ciseaux (figure 8). Sur les six plants restants après que deux aient été utilisés pour les initiations, nous avons opéré de nouvelles coupes pour observer l’influence de la hauteur de la taille sur le développement de pousses juvéniles : deux plants ont été taillés au-dessus du premier niveau de feuilles, sur deux plants nous avons uniquement taillé les têtes, enfin les deux derniers ne sont pas taillés (figure 9).
Les Daphnés n’avaient jusque-là pas été taillés car leur état ne le permettait pas. Nous pouvons maintenant effectuer une taille des têtes et des fleurs dans le cas où il y en aurait.

Fertilisation

Dans le but d’aider nos plantes à redémarrer après les tailles qui peuvent être traumatiques, nous avons choisi d’appliquer l’engrais TopDress (fiche technique en Annexe IV). L’Osmocote TopDress est un engrais enrobé qui a été spécialement mis au point pour le surfaçage des plantes en pépinières hors-sol. Il contient du NPK et du magnésium ainsi que tous les oligoéléments essentiels. Il peut être utilisé pour obtenir un reverdissement rapide ou pour corriger des symptômes de carences. Sa version FT (Fusion Technology) contient un composant spécial permettant à l’engrais de « coller » au substrat après son application. Cela signifie qu’il n’y a aucune perte de granules si les pots sont renversés.
Cet engrais doit être utilisé à 2g/L. Nous déterminons donc la quantité nécessaire pour fertiliser le parc de PM de la façon suivante :
?????? ?? ??????? ? ?????? ?? ??????⁄?????? ? ?????? ?′?? ????? ? ??⁻³ = engrais g/L
Les godets classiques sont de dimension 9cm x 9cm x 8cm, ce qui équivaut à un volume de 648 cm3, soit 0,648 L. L’avantage de cet engrais est qu’il est sous forme de grains très fins (1,0-2,5mm), et donc sa dispersion est aisée, les billes se répartissent de façon homogène sur toute la surface à fertiliser. Il est nécessaire d’arroser la culture suite à la fertilisation pour faire tomber l’engrais des feuilles qui pourrait entrainer des brulures.

Introductions de culture in vitro

La culture in vitro vise à produire rapidement une très grande quantité de jeunes plants, ceux-ci devant être de bonne qualité physiologique mais également sanitaire. Au sein du laboratoire, les jeunes plantes sont stockées dans des chambres de culture à photopériode et température contrôlée : la période de jour est mimée grâce à des néons de 17H à 9H (pour un soucis d’économie, l’électricité étant moins chère la nuit), et les néons sont éteints de 9h à 17H pour mimer la nuit. Les plantes sont donc soumises à 16H de nuit et 8H de jour. Enfin, la température des chambres doit être maintenue à 22°C (+/- 2°C).

Prélèvement du matériel végétal

Pour initier la culture in vitro d’une nouvelle variété, la technique générale consiste à prélever un certain nombre de bourgeons sur les plantes mères. Le prélèvement des bourgeons est à adapter à chaque espèce en fonction de l’anatomie de la plante, même si le principe reste fondamentalement le même : on prélève un tronçon d’environ 1cm que l’on a sectionné juste sous un noeud et juste au-dessus de ce même noeud (figure 10b). De cette façon, on a prélevé le bourgeon (parfois invisible) qui se trouve inéluctablement à l’aisselle d’une feuille (figures 10c et d). Il faut prendre soin de couper le pétiole de la feuille le plus près possible du bourgeon sans léser celui-ci. Le but est de ne garder que le matériel végétal strictement nécessaire à la croissance d’une nouvelle plante, car plus la surface végétale mise en culture est importante, plus le risque de contamination par des bactéries, champignons et autres insectes tels que les thrips est important.
C’est pourquoi, sur les plantes qui le permettent, nous incisons la tige de sorte à ne garder que le bourgeon (cas du Bambou du genre Fargesia).
Lors du prélèvement, l’idéal est de pouvoir prendre du matériel suffisamment juvénile pour redémarrer rapidement sur le milieu de culture, mais suffisamment résistant pour survivre aux désinfections et au prélèvement (figure 10c).
Pour cette étude, nous introduirons dix explants par essais. Nous ne pouvons malheureusement pas en introduire plus, car nous sommes limités par la quantité de matériel végétal disponible. Au moment du premier repiquage, c’est-à-dire environ trois semaines après l’introduction, nous déterminerons le nombre d’explants ayant redémarrés, parmi lesquels nous distinguerons ceux étant sains et ceux étant contaminés (champignons ou bactéries). Nous comptabiliserons également le nombre d’explants non redémarrés de la même façon, et nous conterons également parmi eux, ceux qui ont été brulés par l’hypochlorite de sodium (Annexe IV). Enfin, à partir du nombre d’explants sains et ayant redémarrés, en sachant que nous démarrons à partir de dix explants, nous pourrons déterminer un taux de multiplication :

Optimisation de l’état sanitaire des souches au sein du laboratoire in vitro

Traitements existants

Les plantes mères – du fait de leur état mature – possèdent un microbiote très développé que l’on ne souhaite pas introduire dans les cultures in vitro. Diverses méthodes sont donc mises en oeuvre pour réduire au maximum les populations bactériennes, fongiques et autres ravageurs avant de déposer les explants sur les milieux de culture.
Tout d’abord, avant chaque prélèvement d’explant sur une nouvelle variété, les outils sont désinfectés au désinfectant de surface pour éviter de propager des pathogènes d’une plante à une autre. Ils sont ensuite placés dans des boites stériles, puis transportés dans le laboratoire in vitro (car le prélèvement sur les plantes mères se fait à l’extérieur du laboratoire).
L’objectif étant de limiter les diverses contaminations (Annexe V), chaque initiation de culture in vitro se fait sous une hotte à flux laminaire, préalablement désinfectée au désinfectant de surface contenant de l’éthanol, du chlorure de didécyldiméthylammonium ainsi que du chlorhydrate de polyhexaméthylène biguanide. Ce produit est utilisé pour ses propriétés bactéricide, levuricide, fongicide et virucide. Les contenants des désinfectants ainsi que le stérilisateur à billes de quartz sont également nettoyés. Les accessoires (pinces, scalpel et portoir) ont été passés à l’autoclave, mais sont tout de même à nouveau stérilisés dans le stérilisateur à billes (1 minute à 250°C). Les explants peuvent être déposés sur un plateau lui aussi passé à l’autoclave, sur lequel on dépose tout d’abord une feuille de papier sulfurisé (pour imperméabiliser le plateau), puis une feuille de papier blanc également passée à l’autoclave. Enfin, avant toute manipulation, il est nécessaire de se munir d’un masque, d’une charlotte, et de se laver au savon jusqu’au coude en prenant soin de se nettoyer les ongles à l’aide d’une brosse. Après s’être vêtu d’une blouse, les mains sont désinfectées avec du gel hydro alcoolique aux propriétés similaires au désinfectant de surface, à l’exception près qu’il comporte des agents épaississants. Avant de déposer les explants sur un milieu de culture, nous les passons dans trois bains successifs :
– Domestos à 10% pendant 10 minutes avec agitateur (liquide visqueux soluble dans l’eau)
o Hypochlorite de sodium 1-5%
o c12-18 alkyl dimethylamine oxide 1-5%
o hydroxyde de sodium <1%
– Javel à 0,2% pendant 10 minutes (dilution à 5% de la solution mère concentrée à 4%)
– Oxee back à 0,5% pendant 10 minutes
Les explants sont ensuite transférés dans un bain d’eau stérile, déposés sur le papier blanc pour éliminer l’eau en surface des tissus, puis déposés dans des tubes de culture individuels.

Traitements expérimentaux

Certaines espèces comme Pachystegia ‘DAIZEA’ sont naturellement recouvertes d’un velours sur leurs tiges et feuilles. Celui-ci abrite des pathogènes, et les rend peu accessibles aux produits lors des bains de désinfection, d’où le constat d’un fort taux de contamination des cultures in vitro de Pachystegia. Pour parer à ce problème, nous avons comparé deux modalités : d’une part la méthode de désinfection classique sur un premier lot. D’autre part, nous avons tenté une digestion enzymatique des explants du second lot avant de les passer dans les bains à l’aide d’un produit utilisé en agroalimentaire : BIOREM BF 10% pendant 15 minutes. Ce produit est un détergent enzymatique permettant de dégrader les biofilms et agents pathogènes tels que listeria, salmonelle et campylobacter. Les explants sont ensuite passés 10 minutes dans le Domestos, puis 15 minutes dans la javel et l’Oxee back.
Une autre méthode sera testée pour faire face à ce problème lié au velours : le prélèvement d’explants très juvéniles, et donc encore dépourvus de velours. Il s’agit de venir prélever au scalpel un écusson comportant donc une infime partie lignifiée (qui sera posée sur le milieu de culture) et quelques très jeunes feuilles (figure 11).
Pour faire face au problème récurrent de contamination bactérienne, divers traitements sont régulièrement testés. Jusqu’ici aucun ne s’est avéré efficace, soit les bactéries sont éliminées mais les plantes ne supportent pas le traitement, soit le traitement n’a pas d’impact sur la prolifération bactérienne .

Table des matières
1. INTRODUCTION
1.1. Présentation de l’entreprise
1.1.1. André Briant Jeunes Plants
1.1.2. Création du Laboratoire Angevin des Plantes
1.2. Objectifs du stage
1.3. Etat de la littérature
1.3.1. Principe de réitération et obtention de pousses juvéniles
1.3.2. Culture in vitro
1.3.3. Les auxines
1.3.4. Les cytokinines
1.4. Stratégie permettant d’obtenir de meilleurs résultats en introduction in vitro
1.4.1. Moyens disponibles
1.4.2. Contraintes
2. MATERIEL ET METHODES
2.1. Création du parc de pieds mères
2.1.1. Nettoyage des pieds mères
2.1.2. Variétés travaillées
2.1.3. Tailles des pieds mères
a) Premières tailles
b) Secondes tailles
2.1.4. Fertilisation
2.2. Introductions de culture in vitro
2.2.1. Prélèvement du matériel végétal
2.2.2. Optimisation de l’état sanitaire des souches au sein du laboratoire in vitro
a) Traitements existants
b) Traitements expérimentaux
2.2.4. Approche statistique
3. RESULTATS
3.1. Effets des tailles sur l’organisation structurale des plantes
3.1.1. Premières tailles des pieds mères
a) Genre Rubus
b) Genre Syringa
c) Genre Choisya
d) Genre Cotinus
3.1.2. Secondes tailles des pieds mères
3.2. Introduction de culture in vitro
3.2.1. Genre Rubus
3.2.2. Genre Syringa
3.2.3. Genre Choisya
3.2.4. Genre Cotinus
3.2.5. Approche statistique de la globalité des variétés introduites in vitro
3.3. Optimisation de l’état sanitaire des souches au sein du laboratoire in vitro
3.3.1. Traitements existants
3.3.2. Traitements expérimentaux
4. DISCUSSION 
5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 
6. BIBLIOGRAPHIE
6.1. Ouvrages
6.2. Ressources en ligne

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