Interactions entre biomolécules : les protéines d’adhésion

Interactions entre biomolécules : les protéines d’adhésion

Contexte biologique

Reconnaissance spécifique : cas particulier des protéines d’adhésion

Un organisme vivant fait appel à un nombre gigantesque de molécules. Une caractéristique de ces molécules est de se reconnaître spécifiquement pour interagir entre elles. Brins d’adn, arn messager ou de transfert, enzymes/substrats, anticorps/antigènes,.. toutes ces molécules peuvent reconnaître spécifiquement les vis-à-vis avec lesquels elles vont interagir. Le caractère spécifique de cette reconnaissance est primordial. Une molécule biologique ne trouvera dans le gigantesque ensemble des molécules du vivant qu’un petit nombre de molécules complémentaires avec lesquelles elle pourra interagir Une caractéristique remarquable de l’adhésion entre biomolécules est leur réversibilité. Un couple de biomolécules adhésives peut perdurer de quelques microsecondes à plusieurs jours. Ce spectre temporel permet les organismes vivants d’être dynamiques à des échelles de temps très variables. Par ailleurs, la fonction des différentes molécules biologiques va être intimement liée à la nature de leur interaction spécifique. Contrairement aux situations de chimie ‘classique’, l’adhésion entre molécules biologiques n’est souvent pas covalente mais liée à la création de quelques liaisons faibles ( Van der Waals, hydrogène, électrostatique, solvatation..) qui lorsqu’elles s’ajoutent permettent de former un lien stable. L’adhésion des biomolécules est liée à la possibilité de trouver des conformations spatiales dans lesquelles deux molécules vont pouvoir s’associer et résister un certain temps à l’agitation thermique .

NB : Par la suite, nous parlerons de réactions entre ligand et récepteur pour parler d’interactions entre protéines adhésives. Ligand et récepteur seront les réactifs des réactions biochimiques considérées. Ligand et récepteur sont des dénominations assez vagues et imprécises qui peuvent parfois être interchangées. Notons que dans certains cas, ligand et récepteur seront indiscernables. C’est le cas des interactions homophiliques ayant lieu entre protéines identiques (interactions entre cahérines par exemple). Dans les cas où l’adhésion fera intervenir des molécules de tailles différentes, la grosse molécule sera le récepteur tandis que la petite sera le ligand.

Un corps humain dispose de quatre grandes familles de protéines d’adhésion : les cadhérines, les sélectines, les immunoglobulines et les intégrines. Chacune de ses familles est composée de plusieurs dizaines de variantes. Selon les fonctions à accomplir, un corps humain utilisera préférentiellement un type de protéines. Pour illustrer ces différences, nous allons prendre un exemple particulier: l’adhésion de neutrophiles à la paroi interne des vaisseaux en réponse à une inflammation.

Adhésion de neutrophiles à la paroi interne des vaisseaux

Lorsqu’une partie du corps est infectée par des bactéries, une des premières étapes de la réponse immunitaire va être le recrutement de neutrophiles, des globules blancs non spécifiques dans la zone infectée. Les neutrophiles présents dans les vaisseaux sanguins vont être recrutés au niveau de la zone infectée. Pour cela, ils vont adhérer à la paroi des vaisseaux (sur les cellules endothéliales) puis traverser la paroi cellulaire de ces vaisseaux pour se rendre sur le lieu de l’infection. Pour rendre possible ce recrutement dans la zone intéressante, deux types de protéines d’adhésion vont entrer en jeu, pour accomplir deux fonctions différentes. Avant d’être recrutés, les neutrophiles circulent dans les vaisseaux sanguins. Lorsqu’une infection est déclarée, les cellules endothéliales sont activées et présentent temporairement à leur surface des sélectines de type P et E. Les sélectines sont des protéines membranaires capables de se lier à des polysaccharides (sucres). On recense différents types de selectines dont la différence principale est la longueur de la chaîne les liant à la membrane cellulaire. Outre les sélectines, les cellules endothéliales présentent d’autres types de protéines d’adhésion appelées ICAM présentant une partie adhésive de la famille des immunoglobulines. Les immunoglobulines sont capables de se fixer entre elles mais aussi à la famille des intégrines. Les neutrophiles circulant dans le sang présentent à leur surface les polysaccharides complémentaires des sélectines présentent sur la paroi des vaisseaux ainsi que des intégrines. De nombreux travaux [7-9] ont démontré l’ordre d’intervention particulier des deux types de protéines d’adhésion. Dans un premier temps, les neutrophiles s’écoulant dans les vaisseaux sanguins vont être freinés grâce à des interactions entre sucres recouvrant la surface des neutrophiles et sélectines sur les cellules endothéliales. Une fois freinés, les interactions entre intégrines sur les neutrophiles et immunoglobulines sur les cellules endothéliales peuvent avoir lieu. Grâce à ces nouvelles interactions, le neutrophile se bloque sur les cellules endothéliales et peut traverser la paroi endothéliale.

Cet exemple illustre la variété des fonctions des protéines d’adhésion utilisées dans l’organisme. Deux types de protéines adhésives sont ici requis. Les sélectines permettent tout d’abord de freiner les cellules lorsqu’elles sont portées par le flux sanguins. Les interactions engendrées par les sélectines doivent donc être rapides pour pouvoir attraper les neutrophiles dans leur élan En revanche elles ne sont visiblement pas assez fortes pour stopper complètement les neutrophiles. C’est alors qu’entrent en jeu les intégrines, qui permettent quant à elles une adhésion plus forte et le blocage des neutrophiles sur les parois des vaisseaux. Le rôle des protéines adhésives varie donc d’une famille à l’autre et leur réactivité influe visiblement sur leur fonction. Dans le paragraphe suivant nous allons nous intéresser à la description et à la mesure expérimentale des constantes cinétiques des interactions ligand/récepteur. Avant de considérer des ligands et récepteurs sur des surfaces, nous allons commencer par étudier le cas mieux connu et plus développé des interactions en volume.

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela chatpfe.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

Introduction
Première partie : Bibliographie.
I- Interactions entre biomolécules : les protéines d’adhésion
I-1- Contexte biologique
I-1-1 : Reconnaissance spécifique : cas particulier des protéines d’adhésion
I-1-2 : Adhésion de neutrophiles à la paroi interne des vaisseaux
I-2 : Description et mesures des constantes cinétiques des réactions
ligand/récepteur
I-2-1 : Description des interactions ligand/récepteur en termes de réaction
chimique
I-2-2 : Mesure expérimentale des constantes de réaction
I-2-3 : Résultats sur les mesures des constantes de dissociation Kd et des taux
cinétiques de réaction (k_on et k_off)
I-2-4 : Description du kon : importance de la diffusion
I-2-5 : koff des réactions Ligand/récepteur
Conclusion
Bibliographie
I-3 : Expériences en molécule unique sur les couples ligands
récepteur
II : Adhésion spécifique entre surfaces fluides
II-1 : Un matériau incontournable pour la biophysique : les vésicules ou liposomes
unilamellaires
II-1-1 : Description des vésicules
II-1-2 : Energie de surface des vésicules
II-2 : Expériences et description des phénomènes d’adhésion spécifique : aspect
statique
II-2-1 : Les premières expériences d’adhésion spécifique
II-2-2 : Le modèle de Bell
II-3 : Expériences d’adhésion spécifique sur des systèmes biomimétiques
II-3-1 : Expériences en micropipette et mesure d’énergie d’adhésion
II-3-2 : Adhésion spécifique de liposomes fluctuants sur substrats plans
II-3-3 : Mesure de constantes cinétiques dans les zones d’adhésion spécifique
en fluorescence et en FRAP
Conclusion
Bibliographie
III- Adhésion spécifique de gouttelettes d’émulsion
III-1 : Généralités sur les émulsions
III-2 : Interactions entre gouttes d’émulsion
III-3 : Détermination thermodynamique de l’équation d’Young-Dupré
III-4 : Adhésion spécifique de gouttelettes d’émulsion sur substrats solides : le travail de Jacques Fattaccioli
Bibliographie
Conclusion
Annexe : Détails de la dérivation du Lagrangien de l’énergie libre par rapport aux variables d’espace
Deuxième partie : Matériaux et caractérisation
I- Les gouttelettes d’émulsion
I-1 : Fabrication d’émulsions monodisperses fonctionnalisées
I-1-1 : Formulation de l’émulsion
I-1-2 : Fonctionnalisation de l’émulsion
I-1-3 : Caractérisation en microscopie de fluorescence
I-2 : Etude qualitative de la densité de straptavidine sur les gouttelettes
I-3 : Dosage en retour de la quantité de streptavidine greffée
I-3-1 : Première tentative : dosage en retour de la streptavidine
I–3-2 : Deuxième tentative : dosage en retour d’une solution de biotine
FITC
I-4 : Description thermodynamique de la réaction d’adsorption
Bibliographie
II- Bicouches lipidiques supportées : Fabrication et caractérisation
II-1 : Dépôt de bicouches supportées par fusion de vésicules
II-1-1 : Matériel et protocole expérimental
II-1-2 : Observation des SLB en épi-fluorescence
II-2 : Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) et quantification
II-2-1 : Bases théoriques de la FCS
II-2-2 : Montage de FCS
II-3 : Caractérisation des bicouches en FCS
II-3-1 : Courbes expérimentales de FCS en volume et en surface
II-3-2 : Z-scan et caractérisation de w0
II-3-3 : Caractérisation des bicouches supportées et quantification de la
fluorescence
II-3-4 : Mesures de temps de vie et validité de l’extrapolation aux hautes
densités en
fluorophores
II-3-5 : Diffusion de la streptavidine sur les bicouches
II-3-6 : Mesures de FCS sur les gouttes fonctionalisées
Conclusion
Bibliographie
Annexe : Détail du calcul de la fonction de corrélation our des particules diffusant librement en volume
Troisième partie : Adhésion spécifique de gouttelettes d’émulsion fonctionnalisées sur des bicouches supportées planes
I- Mise en place de l’expérience
I-1 :Protocole expérimental
I-2 : Tension de surface des gouttelettes d’émulsion
II- Observation de l’adhésion spécifique des gouttelettes d’émulsion sur les bicouches supportées en microscopie de fluorescence
III- Mesures expérimentales de l’adhésion en statique
III-1 :Mesures de déformation : comparaison entre déformation et recrutement de
streptavidines
III-2 :Mesures de déformation : comparaison entre déformation et recrutement de
streptavidines
III-3 : Mesure des effets non spécifiques
III-4 : Variations des conditions expérimentales
III-5 : Effet de la quantité initiale de streptavidine
III-6 : Discussion autour des résultats expérimentaux
III-7 : Cinétique d’étalement des gouttelettes
Bibliographie
Conclusion générale