Soutenance mémoire
Interaction plante – virus
Réaction de défense de la plante par « silencing »
Cette réaction de défense est basée sur des mécanismes de type Post Transcriptionnal Gene Silencing (PTGS) comparables à ceux qui sont décrits chez les plantes transgéniques (Ratcliff et al., 1999). Le principe de cette réaction consiste en la reconnaissance d’aberrations au niveau des ARNs dans la cellule, conduisant à leur dégradation spécifique immédiatement après leur transcription. Ces aberrations peuvent être d’ordre quantitatif (surproduction d’un messager au-delà des seuils physiologiques) ou qualitatif (présence de structures aberrantes de type ARN double brin).
Au cours de l’infection et par l’intermédiaire de leurs ARNs messagers, les virus à ARN comme à ADN sont à la fois initiateurs et cibles de ce mécanisme. C’est ce qui a été observé lors de l’infection de plants de tabac non transgéniques par le Tomato black ring virus (TbRV: Nepovirus), le Cauliflower mosaic virus (CaMV : Caulimovirus) et le Tobacco rattle virus (TRV: Tobravirus) (Ratcliff et al., 1997 ; Covey et al., 1997 ; Ratcliff et al., 1999). Les plantes infectées ont tout d’abord développé des symptômes sévères de la maladie sur les premières feuilles inoculées. Puis les feuilles nouvellement émises après l’infection systémique sont restées indemnes de symptôme et contenaient une très faible concentration de particules virales. Ce phénomène a été appelé «rétablissement induit par le virus ». La réaction de défense par silencing induite par les virus est aussi nommée VIGS (virus induced gene silencing) ou RMD (RNA-mediated defense) (Ruiz et al., 1998 ; Ratcliff et al., 1999 ; Covey et Al-kaff, 2000).
Stratégie contre-défensive virale : suppression du silencing
La capacité des virus à infecter les plantes possédant le mécanisme de silencing posttranscriptionnel indique que les phytovirus ont développé des mécanismes de suppression du silencing. Cette idée a pour la première fois été suggérée par l’analyse de l’effet synergique de potyvirus sur la multiplication d’autres virus dans le cas de coinfection (Vance, 1991). Il a été montré récemment que cet effet synergique était le résultat d’une suppression du PTGS par la Protease Hc (HcPro) codée par le génome du potyvirus (Pruss et al., 1997 ; Anandalakshmi et al., 1998 ; Kasschau et Carrington, 1998). Aujourd’hui, cette capacité à supprimer ou contourner la défense de type VIGS a été observée pour plusieurs virus appartenant à différents groupes (Brigneti et al., 1998 ; Voinnet et al., 1999). Un certain nombre de suppresseurs du silencing ont été caractérisés (Anandalakshmi et al., 1998 ; Kasschau et Carrington, 1998 ; Voinnet et al., 1999). Il s’agit de protéines dont l’analyse montre qu’elles sont des déterminants de la pathogénie mais qui ne révèle aucune structure commune (Voinnet et al., 1999). Ceci tend à montrer que la fonction de suppresseur a évolué au cas par cas pour contourner ou supprimer les effets du silencing. En effet, il a été montré que chaque étape du mécanisme du silencing (l’initiation, le transport à distance du signal de silencing et son maintien) peut être la cible des suppresseurs (Voinnet et al., 1999).
A cet égard, les virus infectant les plantes pourraient être divisés en deux groupes, ceux capables de contourner ou supprimer le silencing et qui auront un haut pouvoir pathogène et ceux qui en sont incapables dits « faibles », voire non pathogènes.
Séquences virales intégrées dans le génome des plantes
Les séquences caractérisées intégrées dans le génome des plantes proviennent des deux familles de virus à ADN, les Geminiviridae à ADN simple brin (Kenton et al., 1995 ; Bejarano et al., 1996 ; Ashby et al., 1997) et les Caulimoviridae à ADN double brin (RichertPôggeler et al., 1996 ; Harper et al., 1999 ; Ndowora et al., 1999 ; Jakowitsch et al., 1999 ; Lockhart et al., 2000 ; Budiman et al., 2000 ; Mao et al., 2000). Jusqu’à présent aucun virus végétal n’a été identifié intégré dans sa totalité au génome des plantes en référence à ce qui est connu pour les rétro virus animaux. L’intégration au génome de l’hôte reste pour ces derniers une étape obligatoire dans leur cycle de réplication. Seules des parties de séquences virales ont jusqu’alors été décrites comme intégrées dans le génome des plantes. Il semblerait que cette intégration soit le résultat d’une recombinaison illégitime puisque aucun de ces virus ne possède les éléments majeurs nécessaires à l’intégration ou à l’excision (séquence LTR, gène de l’excisase ou de l’intégrase) tels qu’ils existent pour les rétrotransposons et les rétrovirus animaux et humains (Hohn et Fütterer, 1991 ; Hindmarsh et Leis 1999). Une exception est à noter cependant, pour le Petunia vein clearing virus (PVCV) pour lequel les éléments de séquences d’une intégrase ont été décrits dans son génome (Richert-Pôggeler et Schepherd, 1997)
Séquences intégrées de Géminivirus : GRD (geminivirus-related DNA)
Les séquences GRDs ont été caractérisées dans le génome de Nicotiana tabacum. Trois autres espèces (N. tomentosiformis, N. tomentosa, N. kawakamiï), membres de la section Tomentosae, contiennent également des GRDs. Ces séquences sont intégrées en copies multiples directes sur un seul et même locus et spécifiques du génome T (Bejarano et al., 1996; Ashby et al., 1997). L’analyse de ces séquences montre qu’elles sont partielles et recombinées et qu’elles ne peuvent par conséquent pas reconstituer un génome viral dans sa totalité et donner lieu à la production de particule épisomale. Cependant, toutes possèdent l’origine de réplication et la protéine de réplication adjacente du virus, ce qui suggérerait que l’intégration par recombinaison illégitime serait survenue à partir d’une forme réplicative subgénomique défective (Bejarano et al., 1996). Par ailleurs, l’étude des séquences flanquantes révèle la présence, pour certaines GRDs, de répétitions directes et inverses semblables aux LTR des éléments transposables, suggérant ainsi l’intervention d’un élément transposable comme catalyseur de l’intégration (Bejarano et al., 1996).
Séquences intégrées de Pararétrovirus : EPRV (Endogenous Pararetrovirus)
Les séquences intégrées caractérisées jusqu’à ce jour sont issues principalement de la famille des Caulimoviridae. Parmi ces intrants, on peut distinguer deux catégories.
– La première catégorie est celle des EPRVs dont la structure ne permet pas la reconstitution de particules épisomales car elles sont soit partielles, soit fortement recombinées. Parmi ces dernières, le premier groupe de séquences caractérisées l’a été pour le génome de tabac. Elles y sont intégrées en copies multiples et dérivent d’un virus encore non identifié, le Tobacco pararetrovirus (TPV), proche du genre Cassava vein mosaic virus- like (CsVMV-like). L’analyse de ces intrants Tobacco pararetrovirus like (TPVL) réalisée par Jakowitsch et al. (1999), révèle une intégration au niveau de deux sites du génome du TPV se trouvant de part et d’autre du site d’initiation de la réplication. Cela suggère que l’événement d’intégration soit survenu à partir d’une forme circulaire défective au niveau de la première discontinuité. Par ailleurs, de façon tout aussi similaire que les GRDs, l’analyse des séquences d’ADN génomiques flanquantes au TPVL révèle la présence de séquences répétées en tandem de type NTS9 et de séquences similaires à la transcriptase inverse d’un rétrotransposon de type gypsy. La deuxième catégorie d’intrants est celle des EPRVs dont la structure permet la reconstitution de particules épisomales développant ultérieurement une infection : les EPRVs pathogènes. Jusqu’alors, trois cas ont été recensés pour trois pathosystèmes.
Le premier concerne le PVCV pour lequel l’origine de la présence de virions dans des pétunias hybrides a été reliée à l’existence de probables EPRVs dans le génome de la plante.
Cette hypothèse a été construite sur la base de l’existence d’un motif d’intégrase directement dans le génome viral, d’une hybridation positive avec une sonde virale sur l’ADN génomique de pétunia sain et d’une transmission de ce caractère exclusivement verticale lors de,croisements génétiques (Richert-Poggler et al., 1996). Cependant, l’intégration du génome entier du PVCV dans le génome du pétunia n’a toujours pas été démontrée et aucun élément additionnel ne permet de corréler la présence de séquences intégrées PVCV à celle de particules épisomales.
Les bananiers : description
La domestication du bananier par l’homme a conduit à la création de variétés produisant des fruits sans graine. Les ovaires des fleurs femelles se remplissent de pulpe pour former le fruit, sans pollinisation ni formation de graines. Ces bananiers sont dit stériles et parthénocarpiques (Simmonds, 1962). Les bananes sont issues principalement de deux espèces sauvages diploïdes : Musa acuminata, dont le génome est noté « A » et Musa balbisiana, dont le génome est noté « B ». Les variétés actuelles sont pour la plupart des clones triploïdes issus soit de la seule espèce Musa acuminata et constituent alors le groupe des autotriploïdes AAA, soit de croisements interspécifiques entre les espèces M.
acuminata et M. balbisiana qui constituent les groupes des allotriploides AAB et ABB (Simmond et Shepherd, 1955). Des variétés diploïdes AA et AB existent et sont encore cultivées en Asie du Sud Est.
Actuellement, la production de bananes pour l’exportation provient de la culture de bananiers du sous-groupe des Cavendish (AAA) comme la Grande Naine, la Petite Naine ou la variété Williams. En revanche, l’exploitation des cultivars issus des sous-groupes Plantains (AAB), Figue Pomme (AAB), Lujugira (AAA) ou encore Gros Michel (AAA) est davantage destinée à la consommation locale.
Mode de multiplication du bananier
Alors que les deux espèces originelles M. acuminata et M. balbisiana peuvent se reproduire par voie sexuée, les cultivars actuels en raison de leur stérilité ne peuvent se multiplier que par voie végétative à partir de rejets provenant de bourgeons axillaires portés par la tige vraie improprement appelée « bulbe ». Ce mode de multiplication a été et demeure encore aujourd’hui pour les exploitations familiales la source principale de matériel pour les plantations. Cependant, ces vingt dernières années ont vu l’avènement des techniques de micro propagation par bourgeonnement in vitro. Ces techniques permettent d’obtenir très rapidement des milliers de vitro plants alors que la première méthode ne permet l’obtention que d’une dizaine de rejets dans un laps de temps équivalent. Ces techniques contribuent au développement plus rapide et plus homogène du matériel végétal sain.
Amélioration génétique du bananier
Les bananiers, comme toutes les autres cultures vivrières, sont menacés par des maladies et des ravageurs. Pour la plupart, des traitements chimiques existent et sont actuellement employés, mais le coût de ce procédé associé au souci actuel de protection de l’environnement rend son utilisation problématique. L’approche génétique a alors été largement privilégiée dans le but de créer des variétés de bananiers résistants aux maladies et ravageurs. Cet objectif fut le principal moteur de recherche depuis les années 1920 jusqu’à aujourd’hui pour les principaux centres de recherche que sont la FHIA au Honduras, L’EMBRAPA-CNPMF au Brésil, le CARBAP au Cameroun, 1TITA au Nigéria et le CIRAD aux Antilles.
Bio-agresseurs du bananier
La recherche d’hybrides résistants aux maladies foliaires dûes à des champignons a mobilisé de façon prioritaire l’énergie de la plupart des centres de recherches. Ces maladies répandues dans la majorité des zones de production sont à l’origine d’importantes chutes de rendement. Deux principaux groupes se distinguent : les cercosporioses formant un premier groupe avec la maladie de sigatoga provoquée par Mycosphaerella musicola et la maladie des raies noires due à M. fijiensis (Vuylsteke et al., 1993 ; Carlier, 1994). Le deuxième groupe est représenté par la fusariose causée par différentes races de Fusarium oxysporum f. sp Cúbense responsable de la maladie de Panama. Dans une moindre mesure, la recherche de cultivars tolérants et résistants aux deux principaux ravageurs que sont les nématodes dont Radopholus similis (Sarah, 1989) et les charançons, dont Cosmopolites sordidus font aussi l’objet d’investigations. Il en est de même pour les bactérioses dûes à Ralstonia solanacearum (maladie de Moko) (Oliveira e Silva et al., 2000 ; Gnanamanickam et Anuratha, 1992).
La maladie de la mosaïque en tirets du bananier
La maladie de la mosaïque en tirets du bananier a été décrite pour la première fois en 1966 en Côte d’ivoire (Yot-Dauthy et Bové, 1966) et observée par la suite au Sénégal et au Mali. Des publications plus anciennes (Magee, 1930, 1940) décrivent la plupart du temps une mosaïque du bananier, sans distinction aucune avec la maladie causée par le CMV laissant penser que ces deux virus ont largement été associés et confondus dans le temps. Cependant, la BSD ne s’était en aucun cas révélée comme une contrainte forte de la culture des bananiers jusqu’à ces dernières années où une quantité importante de plants se sont trouvés contaminés au même moment. La maladie jusqu’alors limitée à certaines régions d’Afrique, est devenue le virus des Musaceaes le plus répandu (Daniells et al., 2001; Geering et al., 2000; PasbergGauhl et al., 1996; Vuylsteke et al., 1996; Reichel et al., 1996; Tushmereirwe et al., 1996; Jones et Lockhart, 1993).
Biologie des Badnavirus : référence au BSV
L’agent pathogène responsable de la maladie de la mosaïque en tirets du bananier est le Banana streak virus (BSV). Ce virus appartient au genre Badnavirus, de la famille des Caulimoviridae et du groupe des Pararétrovirus (Hull, 1999). A ce jour, douze virus ont été caractérisés comme appartenant au genre Badnavirus dont le membre type est le Commelina yellow mottle virus (CoYMV) . Le BSV se caractérise par des particules
bacilliformes non enveloppées mesurant 30 x 120-150 nm contenant un ADN circulaire double brin de 7,4 kbp comportant une discontinuité sur chacun des deux brins (Lockhart, 1986; Harper et Hull, 1998). On observe chez les Badnavirus ainsi que pour les différentes souches de BSV entre elles une importante variabilité sérologique et moléculaire à la limite d’une classification en espèces différentes (Lockhart et Olszewski, 1993, Geering et al., 2000).
L’organisation génomique du BSV-Ol comprend 3 ORFs situées sur le brin (+). Les deux premières ORFs codent pour deux petites protéines putatives (ORF1 « 22 kDa., ORF2 « 14 kDa.) dont les fonctions restent encore inconnues (Harper et Hull, 1998). L’étude réalisée sur les deux premières ORFs du CoYMV (Cheng et al., 1996) ont montré que la protéine de l’ORF I participerait à la maturation du virion et que la protéine de l’ORF II s’associait aussi bien avec le virion mature que le virion immature. Enfin, la troisième ORF code pour une polyprotéine (210 kDa.) qui clivée, libère au moins quatre produits différents : la protéine de capside (CP), une aspartique protéase, une reverse transcriptase, une Rnase H et aussi une probable protéine de mouvement. Cette organisation se retrouve chez la plupart des Badnavirus séquencés, comme le Sugarcane bacilliform virus (ScBV) (Bouhida et al., 1993) ou le CoYMV (Medberry et al., 1990). Toutefois le CSSV (Hagen et al., 1993) et le Citrus yellow mottle virus (CYMV) (Huang et Hartung, 2001) se distinguent en comptant respectivement deux et trois ORFs supplémentaires dont les fonctions demeurent inconnues.
De par leur similarité génomique, le cycle de multiplication des Badnavirus et par conséquent du BSV fait souvent référence à celui du CaMV car à ce jour aucune étude n’a été réalisée directement sur le cycle de multiplication des Badnavirus (Jacquot et al., 1997).
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
Bibliographie
1- Interaction plante – virus
1.1- Réaction de défense de la plante par « silencing »
1.2- Stratégie contre-défensive virale : suppression du « silencing »
2- Séquences virales intégrées dans le génome des plantes
2.1- Séquences intégrées de Geminivirus : GRD
2.2- Séquences intégrées de pararétrovirus : EPRV
3- Le bananier
3.1- Les bananiers : description
3.2- Mode de multiplication du bananier
3.3- Amélioration génétique du bananier
3.4- Bio-agresseurs du bananier
3.5- Stratégies d’amélioration
4- La maladie de la mosaïque en tirets du bananier
4.1- Symptomatologie
4.2- Biologie des Badnavirus : référence au BSV
4.3- Transmission de la maladie
CHAPITRE 1
1.1- Introduction et objectifs
1.2- Etude génétique de la ségrégation de la maladie sur la population d’hybrides P. batu x P. pipit 4x
1.2.1- Matériels et méthodes
1.2.1.1- L’immunocapture PCR ou IC-PCR
Principe
Procédure
1.2.1.2- AFLP (Amplified fragment lenght polymophism)
– Principe
– Procédure
1.2.1.3- Extraction, clonage et séquençage des marqueurs AFLP
1.2.2- Résultats et discussion
1.2.2.1- Ségrégation de la maladie dans la descendance
1.2.2.2- La séquence EPRV BSV-Ol comme gène candidat de l’expression de la maladie
1.2.2.3- Recherche de marqueurs moléculaires liés à l’expression de la maladie dans la descendance
1.2.3- Analyse moléculaire des marqueurs AFLP
1.2.4- Conclusions
1.3- Analyse génétique de la ségrégation de la maladie sur la population d’hybrides PKW xIDN 110 T
1.4- Analyse génétique de deux populations d’haploïdes doublés (HD) et Autofécondés (AF) M. balbisiana
1.4.1- Matériels et méthodes
1.4.1.1- Description du matériel végétal
1.4.1.2- Extraction d’ADN et analyse génétique
1.4.1.3- Analyse IC-PCR et ISEM
1.4.2- Résultats
1.4.2.1- Détermination du génotype des clones HD et AF par rapport au locus BEL
1.4.2.2- Détection du BSV
1.4.3- Discussion
1.5- Conclusions
CHAPITRE II
II.l- Introduction et objectifs
II.2- Recherche de la forme “minichromosome”
II.2.1- Matériels et méthodes
II.2.1.1- Détection de l’ADN viral libre par hybridation
II.2.1.2- Détection par PCR des formes virales circulaires libres
II.2.2-Résultats et discussion
II.3- Recherche d’EPRV BSV-OI pathogènes
II.3.1- Recherche de produits de transcription
II.3.1.1- Matériels et méthodes
– Extraction d’ARN
– Transfert et hybridation
II.3.1.2- Résultats et discussion
II.3.2- Recherche du degrée d’identité moléculaire entre EPRVs et PRVs BSV-Ol
II.4- Recherche d’EPRVs BSV correspondant à des souches virales autres que la souche BSV-Ol
II.5- Conclusions
CHAPITRE III
III.1- Introduction et objectifs
III.2- Matériels et méthodes
III.2.1- Transmission des souches BSV-Ol, BSV-Gf et BSV-Mys (Mysore) par cochenilles
III.2.2- Détection des souches BSV-Ol, BSV-GF et BSV-Mys
III.2.3- Mise en évidence de la présence de séquences EPRVs BSV-Mys
III.3- Résultats et discussion
Conclusions générales et perspectives
1-Origine des séquences EPRVs BSV
Origine de l’intégration
Mécanisme d’intégration
2-Mécanisme d’expression
Le facteur génétique d’expression : le locus BEL
Mécanismes moléculaires des interactions BEL / EPRVs BSV pathogènes
Exploration de la carte génétique
Exploration du statut sain
Listes des figures et des tableaux
Références bibliographiques
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