Insectes nuisibles pour la santé humaine : les moustiques vecteurs des maladies ..

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La lutte biologique contre les insectes ravageurs

La lutte biologique est l’une des tactiques fondamentales pour la suppression des insectes nuisibles. C’est l’une des méthodes de contrôle les plus efficaces depuis, puisqu’elle n’a pas d’effet toxique pour l’environnement, pour les hommes et pour les animaux utiles.

Définition

La lutte biologique est l’utilisation de microorganismes contre les insectes ennemis des cultures ou de la santé humaine. Elle repose sur une réalité digne d’intérêt puisque le caractère entomopathogène de certains microorganismes constitue une arme biologique particulièrement efficace ; au contraire des insecticides chimiques, celle-ci permet d’intervenir de manière quasi sélective contre les espèces visées, tout en étant infiniment moins susceptible de provoquer des phénomènes de résistance (Lereclus et Chaufaux, 1986).
L’aspect le plus important de la lutte biologique est la sélection d’agents de lutte biologique qui sont hautement spécifiques à l’espèce-cible afin qu’ils ne s’attaquent pas à d’autres espèces et ne deviennent pas à leur tour d es pestes végétales ou animales (Meyer, 2002).

Mécanisme d’action des agents de lutte biologique

Les mécanismes par lesquels les agents de lutte biologique peuvent prodiguer leur effet protecteur sont multiples et peuvent varier pour un microorganisme donné en fonction du pathosystème (couple hôte végétal/pathogène).
Pour le cas des bactéries, elles infectent l’hôte en général par ingestion et possèdent une forme de résistance leur permettant de passer et de demeurer dans le milieu (sol, feuillage, litière). L’agent pathogène se multiplie dans l’hôte et cause sa mort par destruction de tissus, par septicémie, parfois par l’émission d’une substance toxique. Les cadavres de l’hôte libèrent les agents pathogènes dans le milieu. (Jourdheuil et al., 2012).
Toutefois, l’efficacité en lutte biologique d’une souche donnée est basée sur son potentiel à coloniser efficacement le système racinaire et la couche environnante du sol (rhizosphère). Cela signifie qu’elle doit être dominante par rapport aux autres populations microbiennes et qu’elle persiste sous les faibles ressources nutritionnelles disponibles dans le microenvironnement. Plusieurs propriétés intrinsèques contribuent au pouvoir colonisateur des microorganismes telles que la mobilité, la faible exigence nutritionnelle, le changement de phase ou la vitesse de croissance (van Den Broek et al., 2003 ; Bloemberg et al., 2001).
Les insecticides microbiens devraient être ingéréspar l’insecte pour être efficaces ; si par contact ils ne sont pas toxiques (Weinzierl et al., 1997).
Dans le cas de champignons (insecticides fongiques), dans la plupart du temps, les champignons se développent sur la cuticule de l’insecte cible et pénètrent dans tous les organes en synthétisant toutes sortes d’enzymes lysogènes et/ou en secrétant des composés toxiques pour l’insecte (De Kouassi, 2001). Les organes de l’insecte deviennent alors le substrat de développement du champignon, c’est-à-dire sa source d’énergie entrainant la mort de l’insecte.

Avantages de l’utilisation des agents de lutte biologique

L’application des agents de lutte biologique sur les cultures présente plusieurs avantages :
– Ils ne présentent pas d’effets secondaires nocifs (absence de résidus chimiques, de pollution chimique) et sont sans danger pour l’environnement ou les cultures car ils sont spécifiques à l’espèce-cible (Meyer, 2002).
– L’agent se développe, se reproduit et se dissémine seul. Il peut s’étendre à tous les habitats et répondre aux fluctuations en nombre del’espèce-cible (Meyer, 2002).
– Les biopesticides sont souvent efficaces en faible quantité et leurs activités protectrices peuvent relever de mécanismes multiples déclenchant rarement des phénomènes de résistance chez le pathogène à cause d´une faible pression de sélection (Fravel, 2005 ; Thakore, 2006).
– Ils ont la capacité à être formulés sous forme liquide pour présenter les mêmes facilités d’utilisation qu’un insecticide chimique:transport, stockage, épandage (Lacey et al.,
1986) sans présenter des inconvénients pour les manipulateurs. Ainsi leur utilisation ne demande pas des précautions de manipulation et d’emploi particulières (Baldet, 1995).
– Ils ont une forte activité associée à une étroite pécificités envers les larves de certains moustiques et simulies (Lacey et Singer, 1982 ; de Barjac, 1978b ; de Barjac et Coz, 1979 ; Guillet et de Barjac, 1979 ; Larget et de Barjac, 1981 ; Ramoska et al., 1977).

Inconvénients de l’utilisation des insecticides biologiques

Malgré les avantages que peut présenter l’utilisation des agents de lutte biologique, le marché des biopesticides reste toujours limité à cause de certaines contraintes (Zananirina, 2011). La compréhension de ces limites affectant ces microorganismes spécifiques aide les chercheurs dans le choix de produit efficace et à p rendre les mesures nécessaires afin d’obtenir des résultats probants.
– Il y a initialement une dépense en temps, effortshumains et financiers importants (coût et durée parfois élevés du programme de recherche), mais aussi dans le cas où des résultats rapides sont exigés, la lutte biologiqueagit trop lentement (Meyer, 2002).
– Puisqu’un seul insecticide microbiologique n’est toxique que pour une seule espèce ou groupe d’insectes spécifiques, chaque application ne peut contrôler qu’une portion d’insectes nuisibles présents sur le champ. Si d’autres insectes nuisibles sont présents sur l’espace traité, ils survivront et peuvent continuer à causer des dommages (Weinzierl et al., 1997).
– L’efficacité de la plupart des insecticides biologiques peut être influencée par plusieurs facteurs comme le chauffage, la dessiccation, ou l’exposition aux radiations ultraviolettes, ce qui les rend moins toxiques (Weinzierl et al., 1997).
La lutte biologique nécessite d’excellentes connaissances de l’écologie des pathogènes cibles et des agents de contrôle biologique et de la relation pathogène cible-agent de contrôle biologique (François, 2010).

Pratiques culturales contre les insectes ravageurs

La biodiversité ne permet pas de réprimer certainsravageurs en dessous du seuil économique. Par conséquent, la prévention joue unôler important en visant l’aménagement du système agricole pour qu’il soit favorable aux ennemis naturels et défavorable aux ravageurs. Ainsi, les pratiques culturales telles que la rotation et le choix de cultivars sont au premier plan dans une stratégie de lutte intégrée ne production biologique (Boisclair et Estevez, 2006).
Plusieurs méthodes culturales permettent aussi de éduire les populations de ravageurs de façon préventive comme la distance de culture sur la ferme, date des semis, travail du sol, fertilisation, et cultures pièges (Baldwin, 2006 ; Grubinger, 1999 ; Langer, 1997 ; Radcliffe et Chapman, 1966 ; Baguette et Hance,1997 ; Phelan, 1997 ; Hazzard et Cavanagh, 2004).

Lutte chimique

Cette pratique a conduit rapidement à une augmentat ion sensible de l’utilisation de pesticides de toute nature. A partir des années quarante, l’utilisation des produits chimiques à large spectre d’action a conduit à la mise en place d’une pression de sélection continue sur de nombreux insectes nuisibles. Le résultat fut édifiant : dès les années soixante plusieurs centaines d’espèces d’insectes nuisibles présentaient déjà des taux de résistance préoccupants accompagnés de constatations de plus en plus nombreuses de pollutions parfois irréversibles (Castella, 2008).

Exemples de microorganismes entomopathogènes les plus utilisés en lutte biologique

Champignon entomopathogène

· Beauveria bassiana
Le champignon du genre Beauveria a été décrit par Jean Beauverie en 1911. L’espèce Beauveria bassiana a été établie par Vuillemin en 1912 et classée dans l’ordre des Hyphomycètes. Beauveria bassiana produit des colonies cotonneuses blanches. Ses conidies ou spores sont soutenues par de longs filaments en zigzag qui sont des hyphes transparents de diamètre variant entre 2 et 25 µm. Elles sont produites sur des épis courts donnant un aspect épineux aux cellules conidiogènes (À Mbang et al., 2012). Ce champignon croît et sporule sur une large variété de milieux de culture et peut être conservé à des températures de 5 à 8 °C sans toutefois perdre sa viabilité et sa capacité àsporuler (Tong-kwee et al., 1989). Il a aussi l’avantage de ne pas faire partie des agents pathogènes dangereux pour l’homme et pour les animaux à sang chaud (Tong-kwee et al., 1989 ; Laird et al., 1990). Ce champignon cause une maladie appelée la « muscardine blanche ». Lorsque les spores entrent en contact avec le corps de l’hôte, elles germent sur celui-ci et pénètrent à l’intérieur du corps, tuant finalement l’insecte en l’utilisant comme source de nourriture. Une moisissure blanche se développe sur le cadavre, produisant de nouvelles spores. L’insecte contaminé véhicule le champignon lors de son déplacement jusqu’à sa mort (Bassi, 1836). Des études récentes ont montré que slespores du champignon Beauveria bassiana souche 147, sous forme microgranulée, permettent de contrôler plusieurs ravageurs de culture (Millet-Be sse et al., 2007 ; Ministère de l’Agriculture et de la Pêche, 2009), par exemple, dans la lutte ontrec le charançon rouge du palmier (Besse et al., 2013).

Bactéries entomopathogènes

· Bacillus thuringiensis
C’est au Japon en 1902 que les travaux d’Ishiwata, sur des larves infectées du ver à soie Bombyx mori, ont mis pour la première fois en évidence les propriétés insecticides d’une bactérie en « forme de bâtonnet » du genre Bacillus. Quelques années plus tard un biologiste allemand, Berliner, caractérisa de façon plus précise cette bactérie qu’il nomma Bacillus thuringiensis (Bt) en référence à la région d’Allemagne où elle vait été découverte : la Thuringe (Federici, 2005 ; Yamamoto, 2001). Bacillus thuringiensis est une bactérie à Gram positif, aérobie facultative, sporulante, ayant despropriétés de résistance à la chaleur et à la déshydratation. Celles-ci lui confèrent un caractère ubiquiste et une répartition cosmopolite. Elle fait partie du même groupe queBacillus cereus et Bacillus anthracis, cependant ce n’est pas une bactérie du sol au sens strict puisque son développement est en grande partie dépendant des insectes, sa présence étant souventiéel à celle de ces derniers (Helgason et al., 2000).
En fait, la particularité de cette bactérie par raport aux autres membres du groupe est qu’elle est capable de synthétiser, lors de la phase sporulante, une inclusion cristalline présentant des propriétés entomopathogènes. Cette inclusion est composée d’une ou plusieurs toxines de nature protéique appelées crystals ou cytotoxines elons leurs effets. Ces toxines sont également appelées « endotoxines » par opposition à d’autres toxines sécrétées durant la phase végétative. Ce caractère présente un intérêtmajeur dans la lutte contre les insectes et explique bien le fait que Bt soit de nos jours le biopesticide le plus couramment utilisé dans le monde (Lecadet, 1996; Schnepf et al., 1998). L’insecticide produit à partir de Bacillus peut être actif contre un ordre entier d’insectes, ou eficace contre seulement un ou juste quelques espèces. Par exemple, le produit contenant Bacillus thuringiensis var. kurstaki tue la forme chenille d’un large étalage de papillons (Weinzierl et al., 1997).
· Bacillus sphaericus
Bacillus sphaericus est une bactérie saprophyte Gram positif, aérobie tricte,s très commune dans les environnements aquatiques et les sols (W.H.O, 1984). Elle est caractérisée morphologiquement par la formation d’une spore ronde, terminale et déformante et biochimiquement par son incapacité à utiliser la plupart des sucres comme sources de carbone (Russel et al., 1989).
Elle présente un spectre d’action plus limité quealsouche de bactérie Bt-H14 en raison d’une plus forte spécificité vis-à-vis des différentes pèces de moustiques (Baldet, 1995), et une innocuité pour la faune aquatique non-cible coexistant avec les larves de moustiques (Mulligan et al., 1978 ; Karch, 1984 ; Mathavan et Velpandi, 1984 ; Mulla et al., 1984b ; Lacey et Mulla, 1990). Pourtant, Bacillus sphaericus se révèle être plus rémanent, avec notamment une sédimentation de la matière active beaucoup plus progressive que dans le cas de Bt-H 14, la spore faisant office en quelque sorte de flotteur (Hougard, 1986). De ce fait, elle constitue une candidate très prometteuse dans la lutte contre le moustique urbain Culex quinquefasciatus (Baldet, 1995).
La toxicité des souches entomopathogènes deBacillus sphaericus apparaît au cours de la sporulation (Myers et al., 1979 ; Yousten et Davidson, 1982 ; Kalfon et al., 1984 ; Baumann et al., 1985). Cette toxicité est associée à la présence d’inclusions parasporales de nature protéique, communément appelées cristaux, dont laaillet varie selon la souche (Baldet, 1995).

MATERIELS ET METHODES

MATERIELS BIOLOGIQUES

Pour l’isolement et le test de pathogénicité des microorganismes entomopathogènes, des larves d’arthropode sont nécessaires. En effet, les larves de coléoptères sont utilisées pour le piégeage des microorganismes entomopathogènes et les larves de moustique (diptères) sont destinées au test de pathogénicité des bactéries tomopathogènesen isolées .

Larves de coléoptère (vers blancs)

Les larves de coléoptère ont été capturées dans solle expérimental de culture de haricot d’Analavory et celui du laboratoire LME. Ces larves appartiennent à l’embranchement des Arthropodes, ordre des Coléoptères, famille des Scarabéidés.

Larves de moustique

Les larves de moustique ont été prélevées dans leségouts de la ville d’Antananarivo, plus précisément, des égouts non couverts d’Ampefiloha,juste au bord du canal Andriantany. Ces larves appartiennent toujours à l’embranchement des Arthropodes mais sont de l’ordre des Diptères et de la famille des Culicidés. Le genre est Culex et l’espèce est quinquefasciatus.

Isolement de champignon entomopathogène du genre Beauveria

Les méthodes adoptées lors de l’isolement et de l’identification des champignons sont celles décrites par Ingliset al. (2012).

Isolement à partir des larves d’insecte

Piégeage des champignons capables de parasiter leslarves

Les larves des coléoptères (vers blancs) ont été mises dans des boites fermées contenant du sol de piégeage (150 ml de volume) puis elles ont té incubées dans l’étuve à 30 °C jusqu’à constatation de leur mortalité, pour cela des observations quotidiennes ont été réalisées. La mortalité des larves est considérée être due à l’activité pathogénique des microorganismes dont les champignons et les bactéries. Sur la cuticule des larves mortes (observées sous la loupe binoculaire), des hyphes des champignons responsables pourraient être observés. Dans ce cas, le cadavre est transféré dans une boite dePetri préalablement stérilisée puis incubée à 30 °C pour favoriser le développement du champignon sur la cuticule. Si la larve morte ne présente pas d’hyphes sur sa cuticule, le cadavre est stérilisé superficiellement avec de l’alcool 70°, puis transféré dans des boites de Petri contenant un papier filtre mouillé avec de l’eau distillée stérilisée (Photo 2) et incubé à 30°C dans l’étuve pour favoriser la croissance des champignons.

Isolement des champignons

Les hyphes fongiques qui se développent sur la cuticule des cadavres de larve de coléoptère ont été repiqués sur un milieu de culture favorable pour le développement du champignon du genre Beauveria, le milieu DOC 2 (Annexe 1) (Shimazu et Sato, 1996). La culture est incubée à 30 °C pendant deux à trois jo urs et les hyphes qui se développent sur le milieu de culture sont purifiés par des repiquages successifs sur le milieu PDA (Annexe 1) jusqu’à l’obtention d’un isolat pur de champignon.

Isolement à partir du sol

Deux types de sol ont été utilisés pour l’isolement: le sol rhizosphérique de culture de haricot  d’Analavory et celui de la culture expérimentale du LME.
– Le sol a été broyé puis tamisé pour avoir une dimension de 2 mm.
– 5 g de sol ont été mélangés avec 45 ml d’eau dtillées stérilisée puis agités pendant 30 minutes avec un agitateur magnétique.
C’est la solution mère.
A partir de cette solution mère, des dilutions en cascade ont été réalisées. Pour cela, 0,1 ml de la solution mère a été ajouté à 0,9 ml d’eau distillée stérilisée dans des tubes Eppendorf. Cela constitue la dilution 10-1. A partir de cette dilution 10-1, des dilutions 10 –2 , 10 –3 ,10 –4 ont été préparées. Cent microlitres (100 µl) des dilutions10 –2 , 10 –3 , 10 -4 ont été étalés sur le milieu PDA. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque dilution.
Le temps d’incubation a été de deux à trois jours à 30 °C, une observation a été réalisée tous les jours pour détecter les hyphes susceptibles dese développer sur le milieu de culture.
Les colonies des hyphes qui se développent sur le milieu de culture ont été repiquées sur milieu de culture solide PDA.

Identification partielle des champignons isolés

L’identification microscopique du champignon a été basée sur ces caractères morphologiques, à partir de la forme des conidies e t des hyphes.
Un centimètre carré (1 cm) de culture de champignon sur le milieu PDA ou DOC 2 est mis en sandwich entre 2 lamelles puis le tout est déposé dans uneboite de Petri contenant de la gélose 2 %. La boite de Petri est ensuite incubée à 30 °C pendant au moins 72 heures (Humber, 2012). Apres incubation, les mycéliums et les conidies qui se développent sur les lamelles sont observées sous microscope optique. Pour cela, le montage est préparé avec le PVA (Annexe 2). En effet, le PVA permet de garder la stabilité de la structure et de la morphologie du champignon lorsqu’il est chauffé ou incubé à 40 °C pendant 24 à 36 heures. Les lamelles contenant le champignon à observer son t trempées dans la solution d’agent PVA (Annexe 2) préalablement préparée et l’excès de lasolution est éliminé avec du papier buvard. Les lamelles sont ensuite déposées sur une goutte ed PVA ( Poly Vinyl Alcool) contenant de fuchsine acide (Annexe 2) sur une lame puis incubées à 40 °C pendant 30 heures. Après l’incubation, la structure et la morphologie du champignon sont observées sous microscope au grossissement x40. (Inglis et al., 2012).

Isolement de bactérie entomopathogène

Les méthodes utilisées pour l’isolement, l’identification et le dénombrement des bactéries correspondent à celles qu’ont utilisées Fisher et Garczynski en 2012.

Isolement à partir du sol

Préparation du substrat

Un mélange de 2 à 4 g de sol et 10 ml d’eau distillée stérilisée a été préparé dans un tube vissé puis agité à l’aide d’un vortex. Après, le mélangea été traité à la chaleur dans un bain-marie à 80 °C pendant 10 minutes puis placé rapidement dans de la glace. Ces deux étapes sont importantes et à ne pas négliger dans le but d’obtenir des spores de bactéries (Fisher et Garczynski, 2012).

Ensemencement

Des dilutions en cascade ont été effectuées et 100µl des dilutions 10 –2 et 10 –3 ont été étalés sur le milieu de culture de MOSSEL (Annexe 1) pour la culture de Bacillus. Pour chaque dilution, 3 boites de Pétri contenant le milieu de culture de Mossel ont été ensemencées puis incubées pendant 24 heures à 30 °C.

Isolement à partir d’une larve d’insecte

La méthode a été la même que celle dans l’isolement à partir du sol mais à la place du sol, 0,2 g de larves a été mélangé avec 1 ml d’eau distillée stérilisée (Fisher et Garczynski, 2012).

Identification partielle de bactérie entomopathogène

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste Danois Hans Christian Gram, qui a mis au point le protocole en 1884 (Larpent et al., 1988).
Cette technique est basée sur les propriétés de laparoi bactérienne vis-à-vis de l’éthanol 90° (Vincent, 1970).
Le but de la coloration Gram a été de répartir lesbactéries en deux groupes distincts, les bactéries à Gram positifs et bactéries à Gram négatifs.
D’après le principe de la coloration Gram, après coloration, les bactéries Gram + deviennent violettes alors que les bactéries Gram-apparaissent en rose.
La répartition des bactéries en Gram + ou Gram- a té un critère systématique important pour la classification des bactéries. Elle permet de visualiser facilement les bactéries et de donner des indications sur leurs formes et leurs tailles.
Le colorant utilisé a été le violet de gentiane (Annexe 3) qui colore l’intérieur des bactéries. Pour bien fixer le violet de gentiane sur la cellule, quelques gouttes de lugol ont été déposées sur le frottis. Celles-ci ont été ensuitedécolorées par un mélange d’alcool-acétone. En raison de leur paroi de structure plus épaisse et de composition chimique particulière, les bactéries Gram+ gardent la coloration violette. Les bactéries Gram – , avec une paroi plus fine et plus perméable à la décoloration, perdent al couleur violette. De manière à visualiser les bactéries Gram – , elles ont été recolorées avec de la fuchsine (rose). Bien que le résultat de la coloration de Gram puisse dépendre de l’étatphysiologique des bactéries (âge de la colonie, conditions de croissances…), elle reste la technique de coloration de base de la bactériologie.

Table des matières

INTRODUCTION
I- SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I-1- Généralités sur les insectes nuisibles
I-1-1- Insectes nuisibles pour l’agriculture
I-1-2- Insectes nuisibles pour la santé humaine : les moustiques vecteurs des maladies ..
I-2- La lutte biologique contre les insectes ravageurs
I-2-1- Définition
I-2-2- Mécanisme d’action des agents de lutte biologique
I-2-3- Avantages de l’utilisation des agents de lutte biologique
I-2-4- Inconvénients de l’utilisation des insecticides biologiques
I-3- Pratiques culturales contre les insectes ravageurs
I-4- Lutte chimique
I-5- Exemples de microorganismes entomopathogènes les plus utilisés en lutte biologique
I-5-1- Champignon entomopathogène
I-5-2- Bactéries entomopathogènes
II- MATERIELS ET METHODES
II-1- MATERIELS BIOLOGIQUES
II-1-1- Larves de coléoptère (vers blancs)
II-1-2- Larves de moustique
II -2- METHODES
II-2-1- Isolement de champignon entomopathogène du genre Beauveria
II-2-1-1- Isolement à partir des larves d’insecte
II-2-1-2- Isolement à partir du sol
II-2-2- Identification partielle des champignons isolés
II-2-3- Isolement de bactérie entomopathogène
II-2-3-1-Isolement à partir du sol
II-2-3-2- Isolement à partir d’une larve d’insecte
II-2-4- Identification partielle de bactérie entomopathogène
II-2-5- Test de virulence de la bactérie : Bacillus sur les larves de moustique
II-2-5-1- Dénombrement des bactéries pour le test
II-2-5-1-1- Dénombrement de la forme spore
II-2-5-1-2- Dénombrement de la forme végétative
II-2-5-2- Calcul de la concentration bactérienne (UFC/ ml)
II-2-5-3- Test de pathogénicité
III- RESULTATS
III-1- Isolement et identification partielle des champignons entomopathogènes
III-2- Isolement et identification partielle des bactéries entomopathogènes
IV- DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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