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Inhibition des voies de réparation des cassures double brin de l’ADN pour une thérapie combinée anti-cancéreuse
Les agents chimiothérapeutiques
La toxicité des CDB de l’ADN est exploitée en thérapie anti-cancéreuse (Connell et al., 2004; Jeggo and Lavin, 2009). Afin de lutter contre le développement et la progression tumorale, la radiothérapie, seule ou en combinaison avec des traitements chimiothérapeutiques, va être utilisée. Ces agents sont en général des radiations ionisantes (RI) (rayons X ou ɣ), ou des molécules dites radiomimétiques (car elles miment l’effet des rayons) comme par exemple la Calichéamicine, la Néocarzinostatine ou la Bléomycine. Le but de ces radiomimétiques est de pouvoir générer une proportion plus grande de CDB, de manière aléatoire dans le génome, par rapport à l’effet seul des RI. Ces agents induisent donc directement des CDB, ou bien des CSB qui seront ensuite converties en CDB par la réplication. Ce mécanisme réplicatif est par ailleurs « suractivé » dans les tumeurs, où les cellules sont dans un état hyper-prolifératif. Ainsi, les cellules cancéreuses sont plus sensibles face à ces agents. Cependant, les cellules des tissus sains en prolifération (follicule pileux, muqueuse intestinale, lignées hématopoïétiques) sont aussi particulièrement sensibles à ces agents ce qui explique certains de leurs effets secondaires (alopécie, troubles digestifs, aplasie médullaire).
Les cassures générées par des RI sont directes (Siddiqi and Bothe, 1987) ou bien on lieu par l’intermédiaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), produites par interaction de ces rayons avec les molécules d’eau. (Van Der Schans, 1978). Dans chaque cas, des CSB proches l’une de l’autre mènent à une CDB. Les rayons restent l’un des traitements les plus efficaces sur les tumeurs solides (Delaney et al., 2005).
Les cassures générées par des molécules radiomimétiques proviennent d’une attaque radicalaire, par déshydrogénation du désoxyribose sur les deux brins d’ADN. Le site de lésion ainsi créé conduit à une perte de base puis un clivage de la chaine d’ADN (Chen et al., 2005) (Povirk, 1996). Les problèmes majeurs rencontrés lors de l’utilisation de ces génotoxiques en thérapie anti cancéreuse sont le ciblage spécifique de la tumeur (sans affecter non spécifiquement les tissus sains environnants), l’hétérogénéité interindividuelle au niveau de la sensibilité de chaque patient aux différents agents clastogènes (doses parfois trop fortes ou trop faibles) et pouvant conduire au décès du patient ou parfois même à la réactivation du cancer (Barnett et al., 2009; Guo et al., 2015) et enfin, la sensibilité de chaque tumeur à ces traitements, qui doivent être par conséquent adaptés en fonction des mutations présentes au sein des cellules concernées par exemple (Dietlein et al., 2014; Pearl et al., 2015).
L’avantage d’une utilisation combinée de molécules chimiothérapeutiques en plus des rayons, est d’augmenter la sensibilité de la tumeur face à ces derniers (effet synergique), faisant ainsi face à des mécanismes de radio-résistances acquises ou intrinsèques, et tout en limitant les doses de rayons afin de réduire la cytotoxicité au niveau des cellules saines (Begg et al., 2011). Notamment, l’utilisation d’agents radiosensibilisants permet d’augmenter grandement l’efficacité des radiothérapies et agents génotoxiques anti-cancéreux.
Les résistances développées face aux agents génotoxiques apparaissent à travers divers mécanismes. L’un de ces mécanismes est la sur-expression de certaines protéines de réparation de l’ADN (Begg et al., 2011). Des revues spécialisées décrivent les avantages d’une inhibition des voies de réparation de l’ADN dans le but d’augmenter significativement l’efficacité des drogues antinéoplasiques dans les cellules cancéreuses (Begg et al., 2011; Dietlein et al., 2014; Pearl et al., 2015; Srinivasan and Gold, 2012). Cette stratégie de compromettre certaines protéines de réparation de l’ADN (mais également des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire) a été validée pour plusieurs cibles protéiques par modulation de leur niveau d’expression (Begg et al., 2011; Dietlein et al., 2014; Jekimovs et al., 2014; Pearl et al., 2015; Srinivasan and Gold, 2012).
La NHEJ comme cible dans une approche de chimiothérapie
Une détection et réparation rapide des CDB générés par des rayons ou autres agents, est indispensable à la cellule tumorale afin d’assurer sa survie. La NHEJ est la voie principale de réparation de ce type de dommage et elle intervient dans toutes les phases du cycle cellulaire (Shrivastav et al., 2008). Ce mécanisme NHEJ est donc une cible de choix dans une stratégie de ciblage pour augmenter l’efficacité des thérapies anticancéreuses. D’ailleurs, il a été prouvé plusieurs fois que le défaut de NHEJ par des mutations du complexe DNA-PK ou XRCC4/Cer-XLF/Lig4 conduisait à une augmentation significative de la sensibilité aux rayons ionisants (Woodbine et al., 2014). Les voies de réparation de secours (NHEJ Backup ou B-NHEJ, non décrite ici) pourraient prendre le relais à l’issue d’une telle inhibition. Cependant, ces mécanismes de secours ne seraient clairement pas suffisants puisque par exemple, les patients atteints du syndrome LIG4 (par défaut de l’ADN ligase IV) sont fortement radiosensibles (Tomkinson et al., 2013). D’ailleurs, le blocage de la C-NHEJ pourrait également prévenir l’accès des CDB aux protéines des autres voies de réparation par l’intermédiaire de la protéine KU liée aux cassures (Cheng et al., 2011). Nous ne re-décrirons pas ici ce mécanisme de C-NHEJ mais nous ferons l’état des lieux concernant l’existence d’inhibiteurs spécifiques de certaines des protéines impliquées dans ce dernier ainsi que les pistes restant à explorer dans cette voie, notamment l’inhibition du complexe XXL de ligature. L’inhibition de protéines impliquées dans la voie de RH ne sera pas abordée au cours de cette étude.
Inhibition de la sous-unité catalytique de la DNA-PK (DNA-PKcs)
La DNA-PKcs est surexprimée dans certaines tumeurs et les lignées cellulaires résistantes aux radiations ionisantes, indiquant ainsi un rôle dans la croissance et la survie tumorale (Ader et al., 2002). Au vu de cela, de son rôle pivot au sein de la NHEJ, et de sa qualité de protéine kinase, la DNA-PKcs semble être une cible d’intérêt dans le développement de radio ou chimio sensibilisants (Hsu et al., 2012). Plusieurs inhibiteurs de la DNA-PKcs ont déjà été identifiés. Les plus efficaces ont pour cible la poche de liaison à l’ATP de son domaine kinase (Allen et al., 2003). Certains de ces inhibiteurs ont atteint l’étape d’évaluation préclinique (Davidson et al., 2013; Dietlein et al., 2014).
Par exemple, la Wortmannin (Figure 10) a été l’un des premiers inhibiteurs découvert pour l’inhibition de cette protéine. Cette molécule possède un IC50 proche de 5nM et a montré une inhibition significative de la DNA-PKcs et donc de la réparation des CDB, conduisant à une sensibilité accrue aux rayons ionisants et à l’étoposide (Collis et al., 2005).
Les interactions Protéine-Protéine : un défi thérapeutique
Les interactions protéine-protéine (PPI) sont les bases moléculaires à l’origine de presque tous les processus physiologiques et sont souvent dérégulées lors de certaines maladies graves. Dans les cancers, les PPI peuvent avoir des rôles régulateurs importants comme dans le cycle de division cellulaire ou la signalisation cellulaire. Ainsi, des changements d’affinité ou de spécificité au sein de ces interactions peuvent conduire à des malfonctions telles qu’une croissance cellulaire non contrôlée (Nero et al., 2014). Une protéine ne fonctionne jamais en tant qu’entité unique mais est au cœur d’un vaste réseau d’interactions avec d’autres composants cellulaires. On estime à environ 650.000 PPI pour environ 100.000 protéines produites au sein de la cellule (l’ « intéractome » protéine-protéine) (Kelly and Stumpf, 2008). Aujourd’hui, plus de 300.000 paires d’interactions ont été identifiées dans le génome humain (Nero et al., 2014). L’ « intéractome » humain représente ainsi un vaste champ de cibles thérapeutiques intra et extracellulaires potentielles et donc une opportunité certaine pour des interventions pharmacologiques. Ces PPI sont l’un des enjeux majeurs aujourd’hui en recherche post-génomique pour comprendre, représenter et inhiber ces dernières et restent une branche encore peu exploitée en recherche d’inhibiteurs pharmacologiques.
Caractéristiques structurales et ciblage des PPI :
Pendant longtemps, les PPI ont été considérées comme des cibles non accessibles à des molécules thérapeutiques (non « druggables ») (Thompson et al., 2012) (et tout particulièrement par des petites molécules synthétiques jusqu’alors utilisées pour d’autres types de cibles thérapeutiques) au vu du fait de la nature de leur interface (large, plate et sans cavité apparente, hautement flexible). Cependant, plusieurs succès récents ont permis aux chercheurs d’être plus confiants quant à la possibilité d’un tel ciblage (Chene, 2006; Fry, 2006; Kuenemann et al., 2015; Villoutreix et al., 2014; Wells and McClendon, 2007). D’ailleurs, on dénombre actuellement plus de 12 petites molécules modulatrices de PPI (oncogéniques) en développement clinique (quelques exemples ci-dessous; Figure 19).
Analyse de la thermostabilité et des interactions des protéines purifiées par DSF et gel natif
Profil DSF des protéines XRCC4/Cer-XLF et C-terminal de la ligase 4.
La fluorescence à balayage différentiel (DSF) va nous permettre de valider le repliement, évaluer la thermostabilité ainsi que mesurer potentiellement la fonctionnalité de nos protéines purifiées du complexe de ligature (voir partie Matériels et Méthodes). Les protéines purifiées ci-dessus sont testées à une concentration de 5µM, dans un tampon PBS 1X à pH7.4 et dans un volume final de 20µL. La molécule fluorescente Sypro orange a été utilisée à une concentration finale de 10X. Ces valeurs ont été optimisées afin d’obtenir un bon signal de fluorescence. Ci-dessous est représenté le thermogramme pour les trois constructions : Le C-terminal de la ligase 4 (654-911) étiqueté histidine, XRCC4 (1-
336) étiqueté histidine et Cer-XLF (1-224) étiqueté histidine (figure 30). Le fait d’enlever l’étiquette de 6 histidines pour les trois protéines n’affecte pas le profil DSF observé.
Analyse de la fonctionnalité du complexe XRCC4/Cer-XLF par des tests de stimulation de la ligase T4
Les complexes protéiques XRCC4/Cer-XLF et XRCC4/C-ter ligase 4 utilisés n’ont pas d’activité catalytique propre. Le premier possède une fonction de « scaffold » protéique dans le mécanisme NHEJ de réparation des cassures double brin de l’ADN (permettant notamment l’amarrage d’autres facteurs de réparation) et Le domaine C-terminal de la ligase ne contient pas son domaine catalytique. Le test d’intéraction précédent en conditions natives permet d’apporter un premier élément de confirmation quant à l’activité putative d’un inhibiteur issu d’un criblage sur la prévention de l’association entre les deux protéines.
Dans le cas du complexe XRCC4/Cer-XLF, un test indirect d’activité catalytique a pu cependant être développé (Roy et al., 2015). Ce test, dont le principe est schématisé sur la figure ci-dessous (Figure 34), ne mesure pas une activité directe de ce complexe mais son effet stimulateur sur la ligase du bactériophage T4. En effet, il a été observé qu’une incubation en présence du complexe XRCC4/Cer-XLF stimulait fortement l’activité de ligation intermoléculaire de la ligase T4 sur des plasmides d’ADN linéarisés. Ainsi, on observe que la stimulation induite de la ligase T4 favorise fortement la formation de « concatémères » d’ADN (multimères), des larges fragments d’ADN linéaires re-ligués.
Recherche de sites « druggables » sur les protéines XRCC4 et Cer-XLF
Comme évoqué dans le chapitre introductif, une surface protéique « druggable » doit posséder certaines caractéristiques (interface flexible, résidus hydrophobes, taille de la surface accessible au solvant…). Lors d’un criblage rationnel basé sur la structure, une étape importante est la sélection d’une ou des structures protéiques représentatives sur lesquelles sera lancée l’étape de docking. Il est donc important de prendre en considération toutes les structures disponibles issues de la base de données PDB (provenant par exemple d’un cristal ou d’une structure par RMN), d’une simulation de dynamiques moléculaires ou même d’une modélisation par homologie. Ces différentes structures obtenues expérimentalement ou in silico peuvent, pour une même protéine, avoir des différences mineures de conformation mais pouvant influencer fortement le résultat d’un criblage virtuel. L’utilité de ces variations structurales est de multiplier nos chances d’obtenir des molécules touches potentielles en explorant la variabilité conformationnelle de notre récepteur.
Les structures protéiques utilisées dans mon étude ont toutes une origine cristalline et sont présentes sous forme apo- ou complexée à leur partenaire XRCC4 ou Cer-XLF. J’ai tout d’abord effectué une analyse des différentes structures disponibles dans la PDB. Puis, j’ai comparé les formes apo- ou complexée de mes protéines afin d’en tirer des conclusions quant aux modifications structurales induites et à la flexibilité de mon interface. Le but étant de définir des sites potentiellement.
Echantillonnage conformationnel pour le criblage virtuel – Simulations de dynamiques moléculaires sur la tête XRCC4 et analyse des centroides de chaque cluster
Durant cette trajectoire, la cavité (site 2) se referme et se stabilise dans une conformation moins accessible pour une petite molécule par l’intermédiaire d’une liaison hydrogène entre la chaine latérale du glutamate 55 et le squelette de la serine 110 (figure 42). L’analyse des centroÏdes (de chaque cluster de conformations) au cours de cette trajectoire ne me permet d’obtenir qu’une population de conformères largement majoritaire (centroÏde 1 : 6143 structures). Une forme relaxée représentative de ce centroÏde majoritaire a donc été extraite. L’analyse comparative du plot de Ramachandran entre cette forme tronquée relaxée et la forme cristalline par le programme PROCHECK (Morris et al., 1992) montre que cette forme relaxée est très stable au cours de la trajectoire et possède 86,7% de résidus dans des régions favorables en fin de DM contre 76.1% avant la DM. Cette forme relaxée de XRCC4 présente des variations au niveau du site 2 à cibler mais en dépit d’une cavité moins accessible par rapport à la structure cristalline de départ, elle représente une seconde structure possible pour le criblage virtuel. Ces deux structures de XRCC4 (cristalline 1FU1 et relaxée par DM) ont donc été utilisées dans ce but :
– Structure relaxée par DM : recherche de molécules ciblant le site 1.
– Structure cristalline 1FU1 : recherche de molécules ciblant le site 2. Concernant Cer-XLF, la structure « ouverte » 3SR2 issue du complexe avec XRCC4 sera utilisée pour cibler le site 1. Trois docking semi-flexibles seront donc lancés sur trois structures représentatives et dans le but de trouver des molécules inhibitrices de l’interaction XRCC4/Cer-XLF.
(A) Analyse des centroÏdes obtenus et leur population de conformères. Le centroÏde 1 est largement majoritaire avec 6143 structures. (B) Superposition entre la structure cristalline 1FU1 du domaine XRCC4 1-126 (vert) et la forme relaxée par DM (cyan) représentant la structure représentative du centroÏde 1. On observe le mouvement et la stabilisation du glutamate 55, fermant ainsi la cavité du site 2 dans la structure relaxée. (C) stabilisation du glutamate 55 au sein du site 2 par un pont hydrogène avec la serine 110.
Préparation et filtrage d’une base de données virtuelle de molécules
Les molécules que nous avons choisies pour notre criblage devaient être accessibles sur internet, annotées, avec une grande diversité chimique et commercialement disponibles afin de pouvoir rapidement tester les molécules touches prioritaires dans nos essais de validation biochimique et biophysique. Les molécules provenant des bases de données : Asinex, Chemblock, Enamine, Chembridge, CNE, Maybridge, NCI, Otava, Prestwick, Sinova, TCM, Zenobia et un sous-jeu de données de ZINC ont été téléchargées dans un format classique .sdf puis traitées grâce à des scripts (non développés) afin :
– De les convertir au format .mol2,
– D’enlever les sels (nettoyage),
– De rajouter les hydrogènes manquants pour un pH donné à 7.2,
– De vérifier l’état d’ionisation,
– De générer une conformation 3D énergétiquement favorable,
– Enfin, de les convertir au format .pdbqt (format nécessaire au lancement du docking sur Autodock Vina).
Au final, pour un temps de calcul raisonnable, un total d’environ deux millions de molécules d’une taille comprise entre 350 et 800 Daltons ont été sélectionnées. Les interfaces protéiques étudiées étant assez larges (notamment les sites 1) et en sachant que le profil physico-chimique caractéristique d’un modulateur d’interaction protéine-protéine inclus également une taille plus importante des molécules par rapport à des modulateurs de cibles conventionnelles (Pagliaro et al., 2004 ; Reynes et al., 2010), j’ai choisi de ne pas me limiter à des molécules d’une taille inférieure ou égale à 500 Daltons, une taille habituellement choisie en accord avec les règles de Lipinski (Lipinski et al., 2001). Ces molécules ont ensuite été filtrées sur un critère de solubilité avec un LogP < 2 à pH 7.2. Seront enfin supprimés, les duplicats, les molécules possédant un groupement toxique (mutagènes), les faux positifs connus (avec des fonctions réactives, des « warheads » ou des motifs d’agrégation). Le logiciel « Screening Assistant 2 » (Guilloux et al., 2012) sera utilisé à cet effet. Un total de 520.446 molécules a été obtenu pour le docking sur les protéines XRCC4 et Cer-XLF.
Docking sur les têtes XRCC4 et Cer-XLF – Tri et analyse des hits potentiels
Le criblage que nous souhaitons effectuer est un criblage virtuel basé sur la structure. Les différentes étapes sont schématisées ci-dessous (Figure 43). Nos expériences de docking sont lancées sur des structures cristallographiques ou issues de simulations de dynamiques moléculaires avec une chimiothèque virtuelle préalablement filtrée (discuté ci-dessus). Ce docking est semi-flexible ce qui signifie que certaines chaines latérales de résidus clés au niveau du site d’intérêt seront rendus flexibles. A la fin de ce docking, les poses théoriques les plus énergétiquement stables d’après la fonction de score du programme seront extraites. Le centre de gravité de chacune des molécules sera comparé au centre de gravité du site d’intérêt et les ligands les plus proches de ce site seront conservés. Les 200 meilleures molécules d’après leur score seront extraites et seront finalement conservées uniquement les molécules qui forment au moins une liaison hydrogène et un contact hydrophobe avec les résidus clés identifiés précédemment. L’étape de docking, bien que sujette à de nombreux faux-positifs, est une étape de pré-criblage permettant un enrichissement en molécules touches potentiellement actives et permettant de réduire l’espace chimique à un nombre de candidats dont les tests biophysiques et biochimiques sont physiquement possibles.
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Table des matières
Partie I : Chapitre introductif
I – 1 : Les cassures double-brin de l’ADN et leur réparation par NHEJ
I – 2 : Inhibition des voies de réparation des cassures double brin de l’ADN pour une thérapie combinée anti-cancéreuse
I – 3 : Inhibition cellulaire des protéines du complexe XXL de ligature et radiosensibilisation des cellules cancéreuses – Preuves de concept
I – 4 : Les interactions Protéine-Protéine : un défi thérapeutique
I – 5 : Criblage de molécules inhibitrices, dirigées contre les complexes XRCC4/Cer-XLF et XRCC4/C-ter Ligase 4 – Analyse du système d’étude, étude de la faisabilité du projet et de la démarche expérimentale
Partie II : Résultats et discussion
II – 1 : Production des protéines du complexe de ligature et tests de fonctionnalité
II – 1.1 : Expression en système bactérien et purification des protéines XRCC4, Cer-XLF et C-terminal de la Ligase 4 du complexe XXL de réparation de l’ADN
II – 1.2 : Analyse de la thermostabilité et des interactions des protéines purifiées par DSF (Fluorimétrie différentielle à balayage) et gel natif
II – 1.3 : Analyse de la fonctionnalité du complexe XRCC4/Cer-XLF par des tests de stimulation de la ligase T4
II – 2 : Inhibition de l’interaction XRCC4/Cer-XLF
II – 2.1 : Simulation de dynamique moléculaire sur le complexe XRCC4/Cer- XLF
II – 2.2 : Recherche de sites « druggables » sur les protéines XRCC4 et Cer- XLF
II – 2.3 : Echantillonnage conformationnel pour le criblage virtuel – Simulations de dynamique moléculaire sur la tête XRCC4 et analyse des centroÏdes de chaque cluster
II – 2.4 : Préparation et filtrage d’une base de données virtuelle de molécules
II – 2.5 : Docking sur les têtes XRCC4 et Cer-XLF – Tri et analyse des hits potentiels
II – 2.6 : Analyse par dynamique moléculaire de la stabilité et de l’énergie de liaison des complexes XRCC4/hit et Cer-XLF/hit sélectionnés – Modèles d’interaction
II – 2.7 : Criblage haut-débit : principe, mise en oeuvre et résultats obtenus
II – 2.8 : Analyse par DLS (Diffusion dynamique de la lumière) et RMN 1H de la solubilité et intégrité des molécules retenues
II – 2.9 : Validation biophysique des interactions protéine-ligand par DSF et STD (Différence de Transfert de saturation)-NMR
II – 2.10 : Approche peptidique : caractérisation et analyse d’interaction par RMN des peptides XRCC4 et Cer-XLF
II – 2.11 : Validation des inhibiteurs potentiels par des tests de stimulation de la ligase T4
II – 2.12 : Validation des inhibiteurs potentiels sur des essais NHEJ avec extraits cellulaires
II – 2.13 : Clonage et production de la partie N-terminale de XRCC4 (1-112 ; 1-119)
II – 2.14 : Cristallisation de la protéine XRCC4 – Trempage de cristaux
II – 2.15 : Expériences de cocristallisation
II – 2.16 : Conclusions et perspectives – Vers la structure d’un complexe XRCC4/inhibiteur
II – 3 : Inhibition de l’interaction XRCC4/C-terminal de la Ligase 4
II – 3.1 : Simulations de dynamique moléculaire sur le complexe XRCC4/Cter Ligase 4
II – 3.2 : Dynamique moléculaire et échantillonnage conformationnel de la structure clamp en solution
II – 3.3 : Préparation et filtrage d’une base de données virtuelle de molécules
II – 3.4 : Docking sur les différentes structures du clamp – Tri et analyse des hits potentiels
II – 3.5 : Analyse par dynamique moléculaire de la stabilité et de l’énergie de liaison des complexes C-ter Ligase 4/hit sélectionnés – Nouveaux classements et modèles d’interaction
II – 3.6 : Analyse par DLS et RMN 1H de la solubilité et intégrité des molécules virtuelles retenues
II – 3.7 : Tests d’interaction C-ter ligase 4-ligand par DSF et STD-NMR
II – 3.8 : Test de l’effet préventif des molécules sur l’association XRCC4/Cter Ligase 4
II – 3.9 : Modèle d’interaction entre le C-ter ligase 4 et l’inhibiteur #3101
II – 3.10 : Conclusions et perspectives – Vers la structure d’un complexe Cter Ligase4/inhibiteur
Conclusion générale et Perspectives
Article « Structure-Based Virtual Ligand Screening on the XRCC4/DNA Ligase IV
Interface »
Matériels et Méthodes
Minirevue « Looking for human DNA ligases inhibitors for combination anticancer
therapy »
Bibliographie
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