Influences des régulateurs de croissance sur la croissance et le développement des potentialités organogènes d’Artemisia annua

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Exigence écologique

L’armoise annuelle s’adapte très bien aux conditions ensoleillées. Les graines germent à partir de 7°C et sa température optimale de croissance se situe entre 20 à 25 °C. Elle pousse à diverses altitudes dans le monde et sur la majorité des types de sol dont le pH est situé entre 4,5 et 8,5. Elle requiert toutefois un sol avec un bon drainage, car elle n’apprécie pas l’engorgement (OMS, 2006).

Les variétés de l’Artemisia annua

Au Nigeria, une étude réalisée sur six années (2003-2008) a mis en évidence la possibilité de cultiver des souches d’armoise annuelle productives en climat tropical. Elle a cependant aussi souligné que le taux d’artémisinine varie significativement avec les semences choisies, la saison culturale, l’apport en eau et les pratiques culturales (Brisibe et al., 2012).
Depuis 2013, l’ENSA de Thiès a entrepris la sélection d’une variété d’armoise annuelle à partir d’un écotype du Kenya. Le but était de sélectionner des plantes au meilleur développement végétatif et au stade de floraison retardé afin de produire le plus de biomasse. Cependant, les plants de la variété « Apollon » de chez Mediplant se sont montrés bien plus productifs lors des tests effectués en champs par Martinez-Correa et al.,( 2017).
Un essai réalisé à Thiès en 2016 a permis de montrer que la descendance obtenue à partir des semences récupérées de la variété « Apollon » présentait des caractéristiques comparables par rapport à leurs parents au niveau du développement des plantes. Il est donc économiquement intéressant de récupérer les semences de plantes élites de la première génération de la variété « Apollon » cultivées en champs (Sougnez, 2017).

Utilisation et mécanisme d’action de la molécule d’Artemisinine

Artemisia annua, est utilisée depuis plus de 2000 ans dans la médecine chinoise traditionnelle afin de traiter de nombreux maux dont le paludisme. C’est en 1972 que l’artémisinine a été isolée et caractérisée comme le principe actif à effet antipaludique de la plante. Cette molécule a montré son efficacité et ne présente que peu ou pas d’effets secondaires (Aftab et al., 2014).
L’artémisinine, (la molécule) est une lactone sesquiterpénique comptant un pont endopéroxyde (O-O) et sept centres asymétriques. Il a démontré son efficacité pour tuer rapidement les stades asexués du parasite Plasmodium falciparum dans le sang. Son action s’expliquerait par l’ouverture de son pont endopéroxyde en présence du fer et la libération des radicaux qui bloquent la synthèse des protéines du parasite (par inhibition de la Ca++ ATPAS) ce qui tue le parasite (Onimus et al., 2011).
L’artémisinine, ainsi que ses dérivés semi-synthétiques: Dihydroartemisine, artemether, artesunate and arteether, préparées à partir de la molécule d’artemisinine sont aujourd’hui utilisés en combinaison avec d’autres molécules antipaludiques dans les ACTs (Artemisinin-based combination therapies), traitements recommandés par l’Organisation Mondiale de la santé pour limiter les risques de développement de résistances par le parasite (Blanc et al., 2008).
Cependant, l’apparition d’une résistance de Plasmodium falciparum face aux ACTs est déjà survenue depuis 2005 au sud-est de l’Asie (Onimus et al., 2011).
Après avoir observé une meilleure efficacité des feuilles de la plante entière (consommées par ingestion orale et non via infusion) par rapport à la dose équivalente en artémisinine pure, dans un modèle de paludisme sur rat, l’étude d’Elfawal et al., (2015) démontre la capacité de ce traitement à surpasser la résistance de Plasmodium yoelii sur l’artémisinine pure.
Il semble qu’une résistance à la plante entière est obtenue trois fois moins rapidement qu’avec la molécule pure utilisée dans la médecine actuelle (Onimus et al., 2011).
Ces résultats s’expliqueraient par la multitude de composés secondaires du système de défense de la plante qui augmenteraient sa biodisponibilité et offriraient un effet de synergie. Ils tentent donc au contraire à favoriser la forme non pharmaceutique de l’armoise annuelle dans le traitement du paludisme pour son efficacité prouvée et contre l’apparition de résistance (Onimus et al., 2011). Récemment, un essai clinique mené au Kivu (Daddy et al, 2017) a montré qu’il était possible de guérir des patients infectés par des souches de Plamodium falciparum résistantes aux ACT avec des tablettes constituées de feuilles séchées d’Artemisia annua.
L’artémisinine a un rôle anti-inflammatoire et antipyrétique, elle est active non seulement sur le Plasmodium falciparum, mais également sur de nombreuses bactéries et virus et notamment le VIH (Lubbe et al., 2012).
Elle a été utilisée avec succès dans la désinfection de l’eau et sur certaines parasitoses comme les leishmanioses ou les schistosomiases (Sen et al., 2010).
Quant à l’effet anticancéreux, il a été prouvé à plusieurs reprises par in vitro sur des lignées de cellules cancéreuses provenant de différentes origines: seins, poumons, reins, ovaires, prostates tissu hématopoïétique (Onimus et al., 2011).
Enfin elle a un rôle dans le freinage de la prolifération cellulaire cancéreuse (Ferreira et al., 2005). L’armoise annuelle, est aussi utilisée contre la fièvre dans la médecine chinoise traditionnelle, présente bien d’autres vertus médicinales. De récents articles soulignent l’activité antimicrobienne de son huile contre un grand nombre de champignons et bactéries gram-négatives et gram-positives. Ses feuilles auraient également des propriétés antivirales, anti-inflammatoires, antioxydants, immunosuppressives et seraient bénéfiques contre l’hypertension. Enfin, l’artémisinine montre un réel potentiel dans la lutte contre le cancer. (Onimus et al., 2011).
Outre ses effets intéressants dans l’efficacité des traitements contre le cancer, les recherches montrent une toxicité de cette molécule ciblée uniquement sur les cellules cancéreuses et mettent en avant ses divers modes d’action contre l’apparition d’une éventuelle résistance. Les études sont encore controversées sur son effet potentiel dans la lutte contre le VIH/sida (Aftab et al., 2014).
L’armoise annuelle est aussi une plante riche en huiles essentielles, polysaccharides, saponines, coumarines, acides, minéraux, flavonoïdes et polyphénols. Outre leurs effets thérapeutiques, ces molécules expliqueraient le gain d’efficacité antipaludique observé lors de la consommation de la plante entière plutôt que l’artémisinine pure par un effet de synergie (Aftab et al., 2014)

Etats de connaissances concernant la culture d’Artemisia annua

Relais- Sénégal dans la production d’Artemisia annua

Relais: Les entreprises faisant parties du réseau français qui oeuvrent dans le développement d’activités économiques dans un but d’insertion des personnes en situation d’exclusion (Sougnez, 2017).
Relais-Sénégal: est un centre de tri de vêtements de seconde main créé en 2006 à Diamniadio, au Sénégal. Cette entreprise a une finalité sociale. Elle a pris place sur un terrain de 6 ha du village de Terokh puis a inclus 4 ha de parcelles au niveau du village de Yendane huit mois plus tard. Ces deux villages voisins sont situés dans le département de Tivaouane, dans la région de Thiès (Sougnez, 2017).
En 2004 le Relais – Sénégal a accepté que leur domaine soit le lieu d’essais pour la production d’armoise annuelle (Sougnez, 2017).
Ceux-ci ont été réalisés durant la saison sèche par l’ENSA (Ecole Nationale Supérieure Agriculture, de l’Université de Thiès) en collaboration avec le laboratoire d’Agroécologie tropicale d’horticulture de Gembloux Agro Bio Tech de l’Université de Liège (Sougnez, 2017).
Les résultats ont permis de sélectionner une variété adaptée aux conditions locales pour la culture sous irrigation pendant la saison sèche (Sougnez, 2017).
En 2015-2016, lors de la saison sèche, des essais complémentaires ont été réalisés sur le domaine en collaboration avec l’Université de Liège afin de parfaire l’itinéraire technique de la culture. L’objectif était alors d’y optimiser la production de feuilles et de tiges d’armoise annuelle en étudiant les effets de la densité de plantation, de la pratique de coupes et de la fertilisation (Sougnez, 2017).

Désherbage

Il serait important de planter l’armoise annuelle dans un champ exempt d’adventices car elle supporte mal la compétition (Ellman, 2010).

Récolte des feuilles et des graines

Une fois les plantations arrivées à maturité, environ 5 mois après semis on peut cueillir les feuilles dès le bourgeonnement des fleurs juste avant la floraison de la plante car la concentration en artémisinine est maximun au moment du bourgeonnement et décroit rapidement après la floraison. La cueillette des feuilles se fait en pinçant l’extrémité des rameaux en remontant pour arracher les feuilles. Il est préférable de garder les petites tigelles sur lesquelles s’attachent les feuilles car elles contiennent des flavoides (Onimus et al., 2011).
Le procédé de récolte le plus simple consiste à couper et rassembler les plants puis à les étalés sur un tissus dans un endroit aéré pour le séchage. Le séchage est une étape très importante car les feuilles bien séchées peuvent se conserver plusieurs années (Onimus et al., 2011).
Toutefois, le mode de séchage est discuté dans la littérature l’exposition au soleil étant néfaste pour certains et au contraire favorable pour d’autres (Onimus et al., 2011).
Le séchage au soleil sur le site d’exploitation semblerait être plus avantageux et simple et permettrait d’augmenter le taux d’artémisinine (Sougnez, 2017).
Il est également recommandé par l’OMS de sécher les plantes au soleil plut ôt qu’à l’ombre.
Mais d’apres Onimus et al, 2011, quel que soit le mode de séchage le taux d’artémisinine augmente pendant les 3 premiers jours, sa biosynthèse étant déclenchée par le séchage.
Il faut conserver 1 ou 2 pieds pour obtenir des graines à semer ultérieurement. Dans ce cas, repérez les pieds les plus rigoureux, indemnes de ravageurs et de maladies, identifiez les avec un tissu de couleur pour les conserver jusqu’à la floraison.
Laissez sécher les semences sur pied avant de les récolter puis de les semer à nouveau (Onimus et al., 2011).
A titre indicatif, dans le cas d’une culture importante:1 hectare produits 6 à 9 tonnes de feuilles après séchage. Les feuilles séchées, une fois emballées, peuvent être commercialisées (Sougnez, 2017).

Problèmes agricoles

L’Artemisia annua est une plante à floraison à jour court, ce qui bloque sa production en zone tropicale où sa floraison précoce entrave le développement de sa biomasse. Le contrôle de la fécondation est particulièrement difficile de par la castration des plants très délicate et la synchronisation de la floraison des différents génotypes. Par ailleurs, l’hybridation serait particulièrement instable. Malgré toutes ces difficultés, certains organismes continuent les recherches sur le développement de plantes hybrides à haute teneur en artémisinine et les techniques culturales permettant d’améliorer les rendements. A partir de sélections variétales, la teneur en artémisinine a atteint 1,4 % et l’objectif visé est de 2 % (Blanc et al., 2008).

La germination

La germination désigne l’ensemble des processus métaboliques que subit une graine après réhydratation et qui va l’acheminer vers le processus de croissance (Côme, 1982 ; Heller et al., 1989). Pour qu’une graine germe il faut lui fournir un certain nombre de conditions dont la première est sa maturité. Les caractéristiques essentielles de la germination sont une intense d’absorption d’eau et thermogène et une forte activité métabolique et. La germination est donc un processus qui consomme beaucoup d’énergie dont l’ATP (Heller et al., 2004).
Il a été démontré que le processus de la germination comprend plusieurs étapes physiologiques successives. La phase essentielle de la germination s’achève avant la croissance de la radicule et elle est appelée germination stricto sensu (Evenari, 1975).
 Etapes physiologiques de la germination
Plusieurs travaux de recherche ont permis de regrouper 3 phases essentielles de la germination au sens large de la graine:
 La phase d’imbibition qui se traduit par l’absorption d’eau par la graine sèche qui se trouvait en diapause de maturation. Cette phase se caractérise par une déshydratation maximale de la graine (Côme, 1982). Durant la phase d’imbibition, on assiste à une entrée forte et rapide d’eau à cause de son PH très élevé qui peut atteindre jusqu’à 200 Mpa (Chong & Bible, 1994). Cette phase s’accompagne aussi à une élevation de l’intensité respiratoire brève et ne dure que 6h à 12h selon les semences (Heller et al., 1989).
 La phase de la germination caractérisée par une stabilisation de l’hydratation et de l’activité respiratoire à un niveau élevé. Pendant cette phase, la graine peut être réversiblement déshydratée et réhydratée sans endommager la viabilité de l’embryon. Cette phase s’achève avec l’émergence de la radicule hors des téguments séminaux.
 La dernière phase corresponde à une reprise de l’absorption d’eau et une élévation de la consommation d’oxygène. Elle est caractérisée par un processus de croissance commençant par la radicule puis la tigelle. Certains auteurs ont qualifié cette phase de germination visible du fait de l’élongation plus rapide de la tigelle. Autrement dit, la visibilité de la radicule permet d’attester que la germination stricto sensu s’est déroulée.
 Influence des facteurs biotopes sur la germination
Il s’agit de 3 facteurs essentiels : L’eau l’oxygène et la température qui agissent comme des agents du métabolisme général et qui interviennent directement sur le processus de germination d’une graine.
 L’eau est indispensable à la germination et doit être apportée en quantité suffisante dans le milieu extérieure pour que la graine puisse l’absorber. Elle pénètre dans des enveloppes par capillarité et les cellules deviennent rapidement turgescentes ce qui active les activités respiratoires consécutives (Côme et al., 1982).
 L’Oxygène, elle est indispensable à la germination des graines même pour les plantes aquatiques qui disposent de l’oxygène dissoute dans leurs enveloppes. Les taux d’oxygène exigés par l’embryon sont relativement faibles et varient entre 0,2 et 0,5 %. Pour certaines espèces un excès d’O2 est souvent néfaste à la germination. Les enveloppes séminales laissent diffuser l’oxygène jusqu’a embryon mais renferment aussi du CO2 (Côme et al., 1982).
 La température, la température interfère avec l’oxygène au cours de la germination. La température affecte la vitesse de la germination en affectant la consommation de l’O2 par l’embryon. Elle diminue aussi la solubilité de l’O2 dans l’eau au cours d’une élévation thermique (Côme et al., 1982).
 La lumière et l’humidité
Ces deux facteurs sont très importants lors de la germination. Selon l’espèce, la lumière peut être nécessaire ou défavorable à la germination mais sous des faibles énergies. Elle peut lever ou installer un état de dormance au sein de la graine (Heller et al., 1989).
 Inaptitude à la germination
Pour qu’une graine puisse germer, il faut qu’elle soit mature mais il se peut qu’une poste maturation soit nécessaire dans certains cas. Bien qu’ayant subie une poste maturation complète, il arrive qu’une graine soit incapable de germer, alors que tous les facteurs externes et internes sont favorables à sa germination. On parle alors d’obstacle, de dormance (Willan, 1985) ou d’inaptitude à la germination (Côme 1982).

Les macroéléments

Il s’agit de 6 éléments présents à des concentrations élevées tels que l’azote (N), le calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le magnésium (Mg) et le phosphore (P) et qui interviennent en grande quantité. L’azote (N), le phosphore (P) et le soufre (S) sont des constituants fondamentaux des tissus végétaux (protéines et acides nucléides). Le potassium (k), le magnésium (Mg) et le calcium (Ca) interviennent en particulier dans le maintien de l’équilibre entre cation et anion dans la plante. Les différentes compositions ont été testées et il est apparu que des concentrations élevées en ammonium pouvaient entraîner un déséquilibre des explants; ceux-ci deviennent rapidement jaunâtres et très turgescents. Il est à noter que ce phénomène peut aussi s’observer lorsqu’on remplace l’AIB par le NOA (acide naphtoxyacétique) dans le milieu de base. Le milieu de MURASHIGE & SKOOG (1962) est donc trop concentré en ammonium et nous utilisons actuellement une solution contenant seulement 800 mg/I de NH,NO3 au lieu des 1 650 mg/1 initiaux (Riffaud et al., 1981).
De meilleurs enracinements sont fréquemment obtenus chez de nombreuses espèces par l’utilisation de solutions de macroéléments de concentrations relativement faibles (Rancillac, 1979). De même, sur divers Prunus, augmentent de manière assez régulière et importante les taux d’enracinement en utilisant des solutions de macroéléments dilués (Rin’kis, 1977).

Les microéléments

Appelés parfois oligo-éléments, et bien qu’ils ne soient nécessaires à la plante qu’en faibles concentrations, leur rôle est essentiel. Ils jouent un rôle essentiel dans le mécanisme enzymatique comme activateur ou constituant de coenzyme. Les principaux d’entre eux sont le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le molybdène (Mo), le bore (B) et le chlore (Cl), le cobalt (Co), le nickel (Ni), etc (Margara, 1984).
Certains oligo-éléments sont liés à l’activité des régulateurs de croissance. C’est le cas du zinc qui est lié à la synthèse du tryptophane, précurseur de l’AIA. Une déficience en bore entraine une inhibition de la synthèse des cytokinines mais augmente les niveaux d’auxine.
Le nitrate d’argent (AgNO3) est un puissant inhibiteur de l’action de l’éthylène (Beyer, 1976). Le thiosulfate d’argent a été utilisé par Lemos et Blake (1996) pour lutter contre la chute des feuilles chez l’Annona squamosa cultivé in vitro.

Les éléments organiques

 Les sucres
Dans le cas des tissus végétaux placés en culture in vitro l’assimilation chlorophylienne est nulle ou insuffisante pour rassurer la survie et le développement de l’explant. Dès lors, on ajoute des sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de culture pour fournir à l’explant une source de carbone (Margara, 1984).
Dans la nature, les sucres sont photosynthétisés à partir du gaz carbonique atmosphérique, de l’eau et des sels minéraux du sol en présence de la lumière.
Les deux sucres les plus utilisés sont d’abord le saccharose ensuite le glucose. En général le saccharose constitue la meilleure source de carbone et on l’apporte à la concentration de 30g/l (Augé et al., 1986).
D’après Geoges & Sherrington, (1984), l’efficacité de Nitrate et d’ammonium ainsi que l’effet des cytokinines et de la division cellulaire peuvent dépendre de la concentration de saccharose. Cependant il est à noter que le rapport des glucides n’a pas seulement pour rôle d’optimiser la croissance des tissus mais peut orienter également l’organogenèse et le déterminisme du développement embryonnaire. Le manque de sucre est souvent un facteur limitant. Les oses inhibent la synthèse de la chlorophylle mais le degré d’inhibition est en fonction de l’espèce à partir de laquelle l’espèce est prélevée.
Spanjersberg & Gautheret, (1963) ont montré que le glucose favorise la rhizogenèse chez Topinambour violet de Renne.
 Les vitamines
En culture in vitro, l’emploi de diverses vitamines favorise fréquemment, la croissance des tissus en produisant des réactions catalytiques indispensables aux métabolismes des cellules de la plante. D’après Georges et Sherrington, (1984), les vitamines les plus utilisées sont la thiamine (B1), l’acide nicotinique, la pyridoxine, (vitamine B6), le myo-inositol, l’acide folique, la riboflavine, la biotine: Elles appartiennent essentiellement au groupe B et sont souvent utilisées en association. La thiamine, est une vitamine apportée à raison de 0, 1mg/L, d’ailleurs Skoog, (1962) a démontré l’importance de thiamine et du myo-inositol dans la culture de tissus du tabac. Aussi, l’acide ascorbique (1 à 10mg/L) éventuellement associé à l’acide citrique (50 à 100 mg/L) ou le tocophénol (vitamines E) n’est pas utilisé comme vitamine mais plutôt comme un antioxydant pour éviter le brunissement de certains tissus. Quant à l’acide pantothénique, il joue un rôle sur la croissance de certains tissus.
Oswold, (1977) cité par Mbengue, (1966) a démontré que la vitamine E utilisée à la concentration 0,9 mg/l sous une forme acétate induit la formation des cals et la germination embryonnaire. Elle augmente la sensibilité des cellules de la plante aux auxines.
D’après Augé et al, (1986), les vitamines sont utilisées à des concentrations à l’ordre de milligramme par litre et le myo-inositol est apporté à des concentrations de 10 – 100mg/L.
 Les acides aminés
Bien que les tissus végétaux soient autotrophes à l’azote, possèdent la faculté d’utiliser les nitrates et éventuellement l’azote ammoniacal. Il a parfois été observé que l’apport d’acides aminés favorisait la prolifération des cals. Les acides aminés les plus utilisés en culture in vitro sont: la glycine, la glutamine, l’alanine, ou occasionnellement la proline ou la tyrosine.
Ces acides aminés sont apportés individuellement ou en mélange complexe comme l’hydrolysat de caséine (Margara, 1984).
La forme nitrate est considérée comme la meilleure forme de présentation de l’azote pour les tissus en culture. L’azote intervient probablement sur le contrôle pratique du pH (Georges et al., 1987). Dans la synthèse, les ions nitrates sont réduits en ammoniaque avant l’utilisation dans la biosynthèse.

Table des matières

LISTE DES ANNEXES
RESUME
ABSTRACT
INTRODUCTION
I. Synthèse bibliographique
1 Généralités sur l’Artemisia annua
1.1 Taxonomie et description botanique
1.2. Répartition géographique
1.3. Exigence écologique
1.4. Les variétés de l’Artemisia annua
1.5. Utilisation et mécanisme d’action de la molécule d’Artemisinine
2. Etats de connaissances concernant la culture d’Artemisia annua
2.1. Relais- Sénégal dans la production d’Artemisia annua
2.2 Période culturale
2.3. Semis
2.4. Repiquage
2.5. Irrigation
2.6. Désherbage
2.7. Récolte des feuilles et des graines
3. Problèmes agricoles
4. La germination
5. Généralités sur la culture in vitro
5.1. Historique
5.2. Conditions de culture
5.3. Le milieu de culture
5.3.1. Les macroéléments
5.3.2. Les microéléments
5.3.3. Les éléments organiques
5.3.4. Les régulateurs de croissances
5.4. La micro propagation ou multiplication végétative in vitro
II.MATERIEL ET METHODES
1. Le matériel végétal
1.1. Les graines d’Artemisia annua
1.2. Les boutures d’Artemisia annua
2. Méthodes
2.1. Germination in vitro
2.2. La multiplication végétative in vitro de l’Artemisia annua
2.2.1. Multiplication avec les 2 milieux nutritifs de base MS0 et B5
2.2.1.1. La désinfection des explants
2.2.1.2. Milieux de culture
2.2.2. Influences des régulateurs de croissance sur la croissance et le développement des potentialités organogènes d’Artemisia annua
2.2.2.1. La désinfection des explants
2.2.2.2. Milieux de culture
2.3. Conditions de culture
2.4. Enracinement
2.5. Acclimatation
2.6. Analyses statistiques
III. RESULTATS ET DISCUSSION
1. Résultats
1.1. Désinfection des explants d’Artemisia annua
1.2. La germination in vitro
1.3. Micropropagation de l’Artemisia annua dans les deux milieux de base MS0 et B5
1.3.1. Variation des paramètres de croissance et de développement après 15 jours de culture
1.3.2. Variation des paramètres de croissance et de développement après 30 jours de culture
1.4. Influences des combinaisons hormonales sur la croissance et le développement des vitroplants d’Artemisia annua
1.4.1. Influences des combinaisons hormonales sur les paramètres de croissance et de développement après 15 jours de culture
1.4.2 Influences des combinaisons hormonales sur les paramètres de croissance et de développement après 30 jours de culture
1.5. Corrélation des paramètres de croissance et de développement étudiés
1.6. Enracinement
1.7. Acclimatation
2. Discussion
2.1. Désinfection
2.2. Germination in vitro
2.3. Effet des deux milieux de base sur la croissance et le développement de l’Artemisia annua
2.4. Influences des combinaisons hormonales sur la croissance et le développement de l’Artemisia annua
2.5. Enracinement
2.6. Acclimatation
CONCLUSION ET PERSPECTIVE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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