Influence du nitrate de plomb et de l’acide nitrique sur les paramètres germinatifs

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Les sources de la pollution plombique :

Certaines sources naturelles sont responsables mais de façon négligeable de la diffusion du plomb dans l’environnement. D’après BONTE & DE CORMIS (1979), la concentration de plomb rencontrée à l’état naturel est de 13 à 200 mg/kg de poussières. Cette pollution est attribuée aux feux de forêts et aux aérosols volcaniques. La totalité des rejets de plomb dans la nature est due aux diverses activités humaines dont la métallurgie et le trafic routier qui en lui-même est responsable de 90%de la présence du plomb dans l’atmosphère (CAPLUN & al., 1984).

Dispersion du plomb dans l’atmosphère :

Le plomb est transporté pour moitié sous forme particulaire et pour moitié dans les eaux de ruissellements, la portion particulaire est déposée en majorité, à moins de 7m de l’autoroute. Cependant, l’étendue de la zone soumise aux dépôts de métaux lourds est spécifique à chaque site : elle varie principalement selon trois grands facteurs : la densité du trafic, le régime des vents dominants et la topographie de la route et du site. Autour des mines et des usines traitant le plomb, la contamination due aux retombées, s’étend parfois dans un rayon de 10 Km autour des cheminées des fonderies (DJURI C., 1971).

Mode de contamination des végétaux :

Par voie aérienne :

Après avoir traversé l’atmosphère et une couche d’air stable au voisinage du couvert végétal appelée couche limite, les polluants atteignent les feuilles. Les particules très fines de plomb peuvent pénétrer par les stomates mais il est improbable que de grandes quantités de plomb pénètrent de cette manière et ce processus ne peut être responsable que d’une faible part de la contamination des feuilles par le plomb. Les poussières, contenant les métaux lourds s’accumulent sur les parties aériennes, particulièrement les feuilles, par le processus d’intércéption-déposition. Ce dépôt de surface des feuilles peut être qualifié de « pollution latente » car la cuticule est considérée comme une barrière imperméable qui s’oppose à la pénétration dans les feuilles. Le dépôt peut, cependant, éventuellement pénétrer dans la plante, après sa dissolution qui va dépendre de l’intensité des épisodes humides et de leur acidité ; ainsi la cuticule peut laisser passer des éléments. Quand les feuilles vieillissent, l’efficacité de cette barrière est altérée, il apparaît des microfissures et les polluants qui restent normalement en surface peuvent facilement pénétrer. Il a été constaté que des feuilles mortes accumulent plus de plomb que les feuilles vivantes, probablement à cause d’une dégradation des couches épidermiques qui permettent l’accession du plomb à un niveau interne.

Par le sol :

La contamination par le sol résulte de la présence des polluants qui ont été dispersés et qui se sont déposés sur le sol. Si les polluants se trouvent sous une forme utilisable par la plante, ils seront absorbés par les racines de la même façon que les plantes puisent leurs substances nutritives dans le sol. Une fois absorbés par les racines, ils pourront être transmis aux parties aériennes. Pour l’ensemble des métaux, les formes chimiques les plus toxiques, sont les formes solubles car elles sont plus biodisponibles et pénètrent mieux dans les organismes vivants.
L’absorption de plomb par les racines reste faible. D’autre part il est généralement accepté que seulement une faible proportion du plomb absorbé par les racines soit transportée vers les parties aériennes. En effet (KOEPPE, 1970) montre que si les racines en contact avec des sols fortement contaminés accumulent de grandes quantités de plomb, la majorité du plomb est liée à la surface des racines et que si le plomb est assimilé, la plus grande partie est immobilisée dans les racines sous forme de complexe « plomb-phosphate » ou par la liaison aux parois cellulaires.
En règle générale, on peut indiquer que vis-à-vis de la pollution autoroutière, le sol et les racines jouent un rôle de filtre efficace et que la contamination des végétaux provient avant tout des parties aériennes, qui constituent souvent le début des chaînes alimentaires avec tous les problèmes que cela peut entraîner, en particulier au niveau de la santé humaine.
Les facteurs favorisants l’absorption du plomb sont résumés comme suit :
– l’augmentation de la température (ARVIK & ZIMDAHL, 1974).
– la réduction du phosphate et de la luminosité (ALLCAWAY, 1968).
– la pauvreté du milieu en calcaire.
– le pH du sol : à pH acide le plomb est relativement mobile ce qui facilite son absorption ; à pH basique il est peu soluble donc la plante en absorbe moins (LAGERWERFF, 1971).

Effet du plomb sur la physiologie des plantes :

A des concentrations fortement élevées, le plomb agit sur la croissance et des nécroses foliaires ainsi que des signes de chlorose sont constatés (JOHNSON & al., 1977). Alors qu’à un faible degré de pollution, ces symptômes sont peu prononcés ou même absents. Ce qui laisse supposer que les fortes concentrations locales de plomb affectent des processus cellulaires importants ; l’un des effets est la diminution des activités enzymatiques. Ce qui s’explique par la liaison du plomb sur les groupements (SH) des enzymes et la substitution d’éléments essentiels (VAN ASSCHE & CLIJSTERS, 1990 ; VANGRONSVELD & CLIJSTERS, 1994). La liaison du métal aux groupements –SH, essentiel pour la stabilité de la structure tertiaire de l’enzyme, affecte la conformation de l’enzyme et inhibe son activité. Le blocage des groupements –SH inhibe l’activité de plus de cent enzymes connues (SEREGIN & IVANOV, 2001).

Effet du plomb sur la nutrition minérale :

HUANG et al., (1997a) ont trouvé que le plomb peut significativement inhiber les canaux de transport de Ca2+. Toutes les altérations membranaires qui peuvent apparaître sont dues à la formation de complexes avec les groupements sulphydryl et carboxyl ou à une dégradation peroxydative des lipides membranaires.

Effet du plomb sur le régime hydrique :

Une diminution du degré de transpiration et de la quantité d’eau contenue dans les feuilles a été observée sur les plantes traitées avec le plomb (BARCELO & POSCHENRIEDER, 1990).

Effet du plomb sur la photosynthèse :

Il est connu que la concentration en CO2 est un des facteurs qui influence l’ouverture des stomates, une faible concentration provoque leur ouverture et une forte leur fermeture.
La réduction de la conductance stomatique entraîne également une diminution de l’assimilation du CO2 (photosynthèse) chez les plantes exposées à la circulation automobile. La pollution automobile n’a pas seulement un effet sur la photosynthèse via l’ouverture des stomates; elle provoque aussi des altérations des capacités photosynthétiques (métabolisme intracellulaire). Le plomb semble affecter par conséquence l’appareil racinaire d’où une diminution de la masse racinaire. Sur le système caulinaire il est constaté une inhibition de l’intensité photosynthétique et de la transpiration (ROLFFE & BAZZAZ, 1975 ; CARLSON & BAZZAZ, 1977 ; CLIJSTERS & VAN ASSCHE, 1985) ; il est observé également une inhibition de l’activité photosynthétique à cause de l’altération des chloroplastes, l’inhibition des réactions de phosphorylation, l’inhibition de la synthèse de chlorophylle. Une réduction de la respiration et une accélération du phénomène de sénéscence sont signalées. Des études sur des chloroplastes isolés ont montré que le plomb affecte l’activité photosynthétique à tous les niveaux.
Selon MILES & al., (1972) le photosystème I est moins sensible que le photosystème II ; de ce fait la biosynthèse de la chlorophylle est inhibée. Deux enzymes de la photosynthèse sont connues pour leur sensibilité à l’action du plomb :
– L’acide δ-aminolévulinique (ALA) dehydratase (E.C.4.2.1.24.).
Cette enzyme convertit l’ALA en porphobilinogène dans la synthèse de la chlorophylle et de l’hémoglobine. PRASSAD & PRASSAD ; (1987) ont constaté une inhibition de l’enzyme sur des échantillons de (Pennisetum typhoideum) traités avec des concentrations de plomb. Cet effet s’explique par une interaction du métal avec les groupements sulphydryl (SH) de l’enzyme.
La phosphorylation non cyclique est très sensible à l’action des métaux lourds. Une concentration toxique de 20µM de plomb inhibe aussi bien la phosphorylation cyclique que non cyclique (HAMPP et al., 1973a). L’interaction des métaux lourds avec le groupement fonctionnel –SH est généralement le mécanisme d’inhibition des réactions enzymatiques concernées. Ceci s’applique aux effets sur le photosystème II et la NADP oxydoréductase (HAMPP & al., 1973b). Les interactions –SH sont suggérées pour expliquer les effets du plomb sur l’activité des enzymes chloroplastiques la ribulose 1,5-biphosphate-carboxylase (RuBPC ; EC 4.1.1.39) et la phosphoribulokinase. Il est clair que la fixation photosynthétique du CO2 est affectée par les métaux lourds. Tous ces éléments inhibent le photosystème II, par contre le photosystème I est moins sensible (MILES & al., 1972 ; BAZZAZ & GOVINDJEE, 174 ; WONG & GOVIDJEE, 1976 ; WRISHER & MEGLAJ, 1980 ; BECERRIL & al., 1988).

Effet du plomb sur les enzymes :

Un des mécanismes d’inhibition directe est le déplacement d’un cofacteur d’une enzyme par un métal toxique compétitif pour un même site de liaison. L’exemple le mieux connu est l’inhibition par le plomb de la déshydratase de l’acide δ-aminolevulinique (ALAD. PBG synthétase, EC 4.2.1.24) qui contient un atome de Zinc par sous-unité catalytique, sous forme tétracoordinée à trois résidus de cystéine et un d’histidine. Dans ce cas, le plomb déplace le Zinc mole pour mole de son site de liaison, provoquant ainsi un effet inhibiteur. Les cinétiques d’inhibition de l’ALAD par le plomb semblent être initialement non-compétitives (V max diminuée) ; toutefois la constante de Michaelis (Km) de l’enzyme pour son substrat diminue légèrement indiquant un modèle d’inhibition de type « mixte » (FEILLET ; 2000).
L’interaction directe du métal avec les composants cellulaires peut déclencher une variété de réponses métaboliques entraînant le développement rapide de la plante la conduisant ainsi à une sénescence précoce.
Le « point de stress » est défini comme un état métabolique où la régulation positive des voies est à ses limites (ELSTNER & al., 1988). En ce qui concerne la toxicité par le plomb , ce point est probablement atteint à des doses minimes de métaux dans les tissus concernés ; au-delà de ce seuil l’état physiologique de la cellule peut être transformé irréversiblement (VAN ASSCHE & CLIJSTERS, 1990). Ce changement se traduit par une augmentation de l’activité de certaines enzymes et c’est ce qui est définis comme « l’induction enzymatique ». Elle joue un rôle métabolique important dans les conditions de stress par les métaux lourds. Selon (GWZODZ & al., 1997 ; LEE & al., 1976 ; MAIER , 1978 ; XIONG, 1997) le plomb accroît l’activité des enzymes anti-oxydatives des stress métaboliques, par exemple la guaiacol peroxidase et l’ascorbate peroxidase chez les plantes. Ces enzymes détoxifient les peroxides. La guaiacol peroxidase se localise dans les vacuoles et le cytosol et libère des produits de réaction physiologiquement actifs (e.g. le processus de lignification).
Dans les plantes, il existe trois types d’isoenzymes superoxyde dismutase (SANDMANN & BÖGER, 1983 ; PALMA, SANDALIO & DEL RIO, 1986) : Fe-SOD (dans les chloroplastes), Mn-SOD (dans les mitochondries) et la Cu-Zn-SOD (dans les chloroplastes et le cytosol) ; ce sont des métalloenzymes, un déficit ou un excès de métal affecte leur capacité et modifie ces enzymes (WECKX & LIJSTERS, 1996).
Récemment un second groupe d’enzymes (liées à la voie de l’ascorbata-glutathion) s’est vu augmenter leur activité sous l’effet des métaux lourds (CUYPERS & al., 2000 ; GUPTA & al., 1999 ; FOYER, 1993). Selon cette voie les peroxydes sont détoxifiées par l’ascorbate peroxydase, le substrat oxydé est recyclé par la monodehydroascorbate réductase utilisant comme coenzyme le NADP, le monodehydroascorbate est oxydé en dehydroascorbate qui en retour est converti en ascorbate par la déhydroascorbate réductase. Les électrons nécessaires à cette réaction sont fournis par le glutathion qui en retour est réduit par la glutathion réductase avec le NADPH comme donneur final d’électrons. La figure n°1 montre la voie du Glutathion-ascorbate, ci-dessous.

Les enzymes du blé :

Les enzymes sont des protéines qui exercent une activité catalytique spécifique d’un très grand nombre de réactions chimiques. Les principaux facteurs du milieu qui contrôlent leur fonctionnement sont la température, le pH et l’activité de l’eau. En général, leur activité croît de manière exponentielle avec l’élévation de température du milieu réactionnel jusqu’au environs de 60-70°C, température à partir de laquelle elles perdent l’intégrité nécessaire à leur bon fonctionnement. Parmi les nombreuses enzymes réparties dans les différentes régions histologiques du grain de blé (dans le germe et la couche à aleurone) et dont la mobilisation est nécessaire pour assurer la germination de la graine, celles qui appartiennent aux familles des hydrolases et les oxydo-réductases sont les seules dont la présence a été mise en relation avec la qualité d’utilisation des farines (FEILLET, 2000).

Les enzymes amylolytiques :

Les enzymes amylolytiques sont capables d’hydrolyser l’amidon (amylose et amylopectine) et ses produits de dégradation (dextrines, oligosaccharides).
Elles se différencient par leur aptitude à couper les liaisons glycosidiques α-(1,4) ou α-(1,6), par leur mode d’action – au hasard à l’intérieur de la chaîne d’unité glucosyles (endo-enzymes) ou à partir des extrémités non réductrices (exo-enzymes)- et par les produits de fin de réaction. Selon ces critères, il est distingué les α-amylases, les β-amylases, les pullulanases et les amyloglucosidases.

Les α-amylases (EC 3.2.1.1.) :

Ce sont des endo-enzymes dont la masse moléculaire est comprise entre 50 et 60 KDa. Elles hydrolysent au hasard les liaisons α- (1,4) des chaînes d’amylose et d’amylopectine de l’amidon, à l’exception des liaisons terminales, en libérant quelques molécules de glucose, des oligosides de 2 (maltose) à 7 unités d’anhydro-glucose et des dextrines résultant de la résistance des liaisons α-(1,6) de l’amylopectine à l’hydrolyse.

Les β-amylases (EC 3.2.1.2) :

Ce sont des exo-enzymes de masse moléculaire voisine de 60 KDa. Elles hydrolysent les liaisons α-(1,4) des chaînes d’amylose et d’amylopectine à partir de leur extrémité non réductrice en libérant du maltose : ce sont des enzymes saccharifiantes. Elles peuvent hydrolyser la totalité de l’amylose mais ne peuvent pas franchir les liaisons α-(1,6) de l’amylopectine, de sorte que 55 à 60 % seulement de celles-ci sont dégradés. Elles n’hydrolysent pas l’amidon natif.

Les pullulanases (EC 3.2.1.41) :

Elles coupent spécifiquement les liaisons α-(1,6) mais ne peuvent aller au-delà de la libération du maltose. Elles ont une action déramifiante et permettent aux β-amylases de poursuivre leur activité. Les pullulanases ne peuvent pas hydrolyser l’amidon natif car leur action ne débute qu’après rupture du polymère.

Les amyloglucosidases (EC 3.2.1.3) :

Elles hydrolysent les liaisons α-(1,4) en libérant du glucose à partir des extrémités non réductrices de l’amylose et de l’amylopectine. Elles hydrolysent les liaisons α-(1,6), mais beaucoup plus lentement. Ce sont des exo-enzymes qui hydrolysent rapidement les chaînes longues.
Les enzymes amylolytiques naturellement présentes dans le blé sont des α-amylases et des β-amylases. Les mécanismes d’action des enzymes amylolitiques sont indiqués dans la figure n°2.

Détermination des paramètres biochimiques :

Détermination de l’activité de la lipase :

La méthode utilisée est celle de LUTSKANOV (1994).
Dans une éprouvette, il est mélangé 1g de graines broyées et 10 ml de solution tampon pH 8. Solution tampon : Cette solution est préparée à partir de 96.05 ml de solution de Na2 HPO4 0,2 M ajustée à pH 8 par une quantité en ml d’une solution d’acide citrique 0,1N. Mode opératoire : dans quatre Erlen-meyers de 100 ml, il est déposé :
-3ml d’huile d’olive.
-2ml de solution tampon contenant les graines broyées.
Trois Erlen-meyers sont placés à 30°C. Le quatrième Erlen-meyer est considéré comme un témoin
dans lequel est introduit :
-5ml d’Ether.
-10ml d’alcool à 90°C.
Le contenu est titré avec du NaOH 0,1 N en présence de phénophtaléine Après un temps de 30min le premier essai est titré de la même manière. Après 60min et 90min le deuxième et le troisième essai sont dosés successivement.
L’activité de la lipase est exprimée en ml de NaOH 0,1 N utilisée pour titrer les acides gras obtenus après action de l’enzyme contenu dans 1 g de produit. A = (A−B)×F×5
Où :
A : Quantité de NaOH 0,1 N utilisée pour titrer l’essai expérimental (ml).
B : Quantité de NaOH 0,1 N utilisée pour titrer l’essai témoin (ml).
F : Titre de NaOH 0,1N.
5 : Coefficient de dilution.
C : Masse des graines.

Détermination de l’activité amylasique :

La méthode a été téléchargée sur INTERNET, elle se base sur la méthode de BERNFELD, (1951).

Détermination de la somme (α + β) amylasique :

Réactifs :
– 0,02M Tampon Phosphate, pH 6,9 ajusté avec du NaCl 0,006M.
– NaOH 2N.
Réactif colorant :
– 1gr de 3,5-acide Dinitrosalicylique sont solubilisés dans 50 ml d’eau distillée.
– 30g de tartrate double 4 fois hydraté sont ajoutés.
– 20 ml de NaOH 2N sont additionnés.
– La solution est ajustée à 100 ml et protégée contre le CO2 .
– La préparation peut être conservée pendant 2 semaines.
Solution d’amidon à 1% :
– 1g d’amidon est dissous dans 100 ml de tampon phosphate sodium 0,02 M pH 6,9.
– Dans un becher, après refroidissement le contenu est complété à 100 ml.
– Incuber à 25°C pendant 4-5 min. avant chaque usage.
Solution de maltose :
– 180 mg de maltose sont dissous dans 100 ml d’eau distillée.
Il est procédé de la manière suivante :
Extrait enzymatique :
– 5g de blé broyé sont mis dans 50 ml d’eau distillée. La solution est agitée toutes les 5 min, pendant une demie heure, puis filtrée.
Test enzymatique :
– 0,5ml du filtrat enzymatique sont pipetés dans un tube.
– Le blanc est préparé avec 0,5ml d’eau distillée.
– L’incubation est à 25°C pendant 3-4min.
– 0,5ml de la solution d’amidon sont ajoutés et le mélange est incubé de nouveau pendant 3min.
– 1ml de la solution d’acide dinitrosalicylique est coulé dans chaque tube.
– Tous les tubes sont incubés au bain-marie pendant 5min et refroidis.
– Après avoir versé 10ml d’eau distillée, la lecture à A 540 nm est réalisée.

Détermination de l’α – amylase :

Pour la détermination de l’α-amylase, la β-amylase est d’abord dénaturée par chauffage de l’extrait enzymatique avant la réalisation de l’essai à 70°C et il est procédé de la même manière que précédemment.

Détermination de la β – amylase :

La β-amylase est déterminée par calcul. β-amylase = (α + β) amylase – α-amylase.

Analyse statistique :

Pour l’étude du pourcentage de germination, des activités lipasiques et des activités amylasiques, il a été utilisé l’analyse de la variance à deux critères de classification modèles fixes (DAGNELIE, 1975).
Les représentations graphiques en 3D (en relief) ont été réalisées avec le logiciel STATISTICA 5.1.

Table des matières

INTRODUCTION.
I. RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1.Généralités
I.2.Les caractéristiques physico-chimiques du plomb..
I.3.Les sources de la contamination plombique
I.4.Dispersion du plomb dans l’atmosphère
I.5.Modes de contamination des végétaux
I.5.1. Par voie aérienne
I.5.2. Par le sol
I.6.Effet du plomb sur la physiologie des plantes
I.6.1.Effet du plomb sur la nutrition minérale
I.6.2.Effet du plomb sur le régime hydrique
I.6.3.Effet du plomb sur la photosynthèse
I.7.Effet du plomb sur les enzymes
I.8.Les enzymes du blé
I.8.1.Les enzymes amylolytiques
I.8.1.1. Les α-amylases
I.8.1.2. Les β-amylases
I.8.1.3. Les pullulanases
I.8.1.4. Les amyloglucosidases
I.8.2.Les lipases
I.9..Les effets de la pollution plombique sur les enzymes du blé
II.MATERIEL ET METHODES
II.1.Matériel végétal utilisé
II.2.Méthodes d’analyses
II.2.1.Préparation des solutions chimiques
II.2.2.Détermination des paramètres germinatifs
II.2.2.1.Taux moyen de germination
II.2.2.2.Vitesse moyennede germination
II.2.3.Détermination des paramètres biochimiques
II.2.3.1.Détermination de l’activité de la lipase
II.2.3.2.Détermination de l’activité amylasique
II.2.3.2.1.Détermination de la somme (α + β) amylasique.
II.2.3.2.2. Détermination de l’α- amylase
II.2.3.2.3. Détermination de la β- amylase
II.2.4.Analyse statistique
III.RESULTATS ET DISCUSSION
III.1.Influence du nitrate de plomb et de l’acide nitrique sur les paramètres germinatifs
III.1.1.Influence du nitrate de plomb sur les paramètres germinatifs
III.1.2.Influence de l’acide nitrique sur les paramètres germinatifs
III.2.Influence du plomb sur les activités enzymatiques
III.2.1.Effet du plomb sur l’activité lipasique
III.2.1.1.Influence du plomb sur l’activité lipasique au bout de 30minutes de réaction enzymatique
III.2.1.2.Influence du plomb sur l’activité lipasique au bout de 60minutes de réaction enzymatique
III.2.1.3.Influence du plomb sur l’activité lipasique au bout de 90minutes de réaction enzymatique
III.2.2.Influence du plomb sur les activités amylasiques
III.2.2.1.Influence du plomb sur l’activité α-amylasique
III.2.2.2.Influence du plomb sur l’activité β-amylasique
Conclusion
Références bibliographiques

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