Influence du milieu réactionnel sur la synthèse enzymatique des esters de sucre 

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Composition des enzymes

La majorité des enzymes connus sont de nature protéique, c’est-à-dire résultats de la condensation d’acides α-aminés de la série L, avec formation d’une liaisonamide entre le groupe carboxyle d’un acide aminé et le groupe amine d’un autre acide aminé et ainsi de suite, de proche en proche, pour constituer une protéine (polypeptide de masse moléculaire élevée).
Certains enzymes sont des holoprotéines constituées uniquement d’un enchainement d’aminoacides ; d’autres sont des hétéroprotéines ossédantp deux parties, une partie protéique « l’apoenzyme » et une partie non protéique « le cofacteur », appelées « holoenzymes ». Dans ce cas sans le coenzyme la catalyse ne peut avoir lieu. Les cofacteurs sont des corps chimiques indispensable à l’activité des enzymes. Ils peuvent être des ions métalliques ou des petites molécules présentent dans les milieux biologiques. Pour les cofacteurs qui sont plus complexes, ils sont synthétisés par des cellules apelées coenzymes (Lehninger et al., 1994).

Efficacité catalytique des enzymes

Enzymes et biocatalyses pouvoir catalytique : L’utilisation d’une enzyme permet de diminuer l’énergie d’activation E a (figure2) et d’augmenter les vitesses réactionnelles comme on peut les utiliser même à des faibles concentrations (10-8 à 10 -6).
spécificité : Pour chaque enzyme, on peut définir une réaction chimique et le plus souvent un substrat caractéristique.
Sensibilité : Les enzymes sont sensibles à la géométrie des molécules car, ils peuvent discriminer des stéréoisomères.

Structure des enzymes

Les caractéristiques spatiales des protéines sont al clé de leurs fonctions. La structure des enzymes est définie à plusieurs niveaux :

Structure primaire

C’est l’ordre d’enchaînement des acides aminés de série L, liés entre eux par une liaison peptidique. Ce premier niveau de structure est responsable au moins indirectement des niveaux supérieurs d’organisation et ainsi de toutes les propriétés des protéines, en particulier des propriétés catalytiques des enzymes.

Structure secondaire

Elle résulte de l’établissement de liaisons hydrogène entre les groupements amide (-NH) et carbonyle (-CO) du squelette peptidique. Il existe trois principales catégories de structures secondaires selon le repliement des liaisons peptidiques : les hélices (de type alpha), les feuillets (de type bêta) et les coudes .

Structure tertiaire

La chaîne polypeptidique déjà ordonnée en structure secondaire peut se replier sur elle-même pour former unemolécule de configuration spatiale bien déterrminé. Les liaisons intramoléculaires (pont dissulfure, liaisons hydrogènes, liaisons ioniques, liaisons hydrophobes) responsables de la stabilité de la structure tertiaire se foorment à partir des chaînes latérales des acides a minés.

Structure quaternaire

Les protéines sont soouvent constituée de plusieurs sous-unitéss qui correspondent chacune à une chaîne polypepptidique de structure tertiaire définie. L’assocciation de ces sous-unités entre elles par le mêmme type de liaisons que celles rencontrées au niveau de la structure tertiaire constitue la structure quaternaire de la protéine. C’est de cettte association dont dépendl’activité de la protéinn (Smith G., 1995).

Mécanisme d’action des enzymes

La fonction des enzymes est liée à la présence dans leur structure (secondaire et tertiaire) d’un site particulier appelé lesite actif. Schématiquement, il a laa forme d’une cavité dans lequel vont se fixer les suubstrats grâce à plu sieurs liaisons chimiques faibles.
Il y a une douzaine d’acide aminés autour du site actif avec seulemennt 2 ou 3 qui sont directement impliqués,les autres ont un rôle purement structural .
De façon extrêmement simpliifiée, voici le mécanisme d’action d’une en me. Dans la figure 2, on voit un substrat, c’est-à-dire la molécule qui va être modifiée, arrivésur l’enzyme. Une fois arrivée à proximité il se produit les phénomènes suivants (Andrés I., 2008 :
. le substrat se positionne dans la cavité
. l’enzyme le fixe
. la réaction se produit
. le substrat transformé est relâchée.

Classification des enzymes

Nomenclature systématique

Les enzymes sont généralement nommées en additionnat le suffixe ase au nom de leur substrat ou produit (exemple, l’uréase pour l’urée). Mais, le nom de l’enzyme peut être aussi lié à une propriété de cette enzyme (exemple,l’invertase hydrolyse le saccharose). Pour clarifier tout cela, elles sont classifiées par un système numérique standard. Leur numéro est attribué par l’ « Enzyme Commission » en code de 4chiffres précédé de EC « EC W.X.Y.Z. »
1er chiffre (W) : type de réaction.
2ème chiffre (X) : (sous classe) type de groupement chimique ou de liaison concernée.
3ème chiffre (Y) : (s/sous classe) nature précise de groupes et les mécanismes réactionnels mis en jeu.
4ème chiffre (Z) : numéro de série de l’enzyme à l’intérieur de la s/sous classe.
Les classes d’enzymes ainsi constituées sont au nombre de six :
1 – Oxydoréductases : Enzymes qui catalysent les réactions d’oxydo-réduction. Exemple : alcool déshydrogénase (E.C.1.1.1.1). Alcool + NAD- → aldéhyde ou cétone + NADH
2 – Transférases : Enzymes qui catalysent le transfert d’un groupe spécifique d’une molécule à une autre. Exemple : hexokinase (E.C.2.7.1.1) ATP + Hexose → ADP + Hexose – P
3 – Hydrolases : Enzymes qui catalysent la coupure hydrolytique des liaisons C—O, C—N et C—C. Exemple : l’ α-amylase(E.C.3.2.1.1) hydrolyse des liaisons 1,4— α—D – glucosidiques dans des polysaccharides contenant 3 ou plus D-glucose.
4 – Lyases : Enzymes qui coupent les liaisons C—C, C—O et C—N p ar élimination, en formant des doubles liaisons ou des cycles. Exemple : pyruvate décarboxylase (E.C.4.1.1.1)
2 − oxoacide → aldéhyde + CO
5 – Isomérases : Enzymes qui catalysent des changements géométriques ou structuraux dans une molécule. Exemple : la glucose-isomérase (E.C..53.1.5) catalyse l’isomérisation du glucose en fructose.
6 – Ligases : Enzymes qui catalysent la liaison entre deux molécules, couplée à l’hydrolyse d’une liaison phosphate de l’ATP (ou un autre triph osphate). Exemple : pyruvate carboxylase (E.C.6.4.1.1) (Henrissat B., 1991). ATP + Pyruvate + HCO3- → ADP + PO4- + oxaloacétate

Classification CAZy (Carbohydrate Active enZyme)

Cette classification repose sur une étude de la séquence d’acides aminés d’une enzyme, elle permet, notamment, de révéler les relations au cours de l’évolution entre les enzymes d’une même famille, ainsi que de prédire des données concernant leur mécanisme catalytique. La classification CAZy est divisée encinq parties :
1 – Glycoside Hydrolases (GH) : Les Glycoside-Hydrolases (EC 3.2.1.-) constituent un vaste groupe d’enzymes qui catalysent l’hydrolyse de liai sons osidiques associant un ose à un autre ose ou à une molécule non osidique.
2 – Glycosyl Transférases (GT) : La biosynthèse des liaisons glycosidiques implique des enzymes (EC 2.4.-.-) capables de catalyser le transfert spécifique d’un ose d’un intermédiaire activé (donneur) sur une autre molécule (accepteur).
3 – Polysaccharide Lyases (PL) : La rupture des liaisons osidiques par un mécanismede β-élimination est catalysée par les Polysaccharide Lyases (EC 4.2.2.-).
4 – Carbohydrate estérases (CE) : Ces estérases catalysent la O- ou la N-désacétylation des glucides. Deux groupes de substrats sont distingués, suivant que la partie acyle ou la partie alcool de l’ester provient du glucide.
5 – Carbohydrate-binding modules (CBM) : Les « modules de liaison au glucide » sont des éléments de la structure d’enzymes capables de se ierl spécifiquement à un glucide, sans présenter d’activité catalytique propre (Coutinho te al., 1999, Rajan et al., 2004).

Immobilisation des enzymes

Enzymes et biocatalyses
L’application de la catalyse enzymatique aux processus chimiques diminue l’utilisation de produits nocifs dans l’environnement et réduit ainsi le coût de traitement. Les enzymes offrent un avantage distinct dû à leur spécificité,la biodégradabilité et la limitation de la formation de sous-produits. Quelques critères doivent être réunis pour qu’une enzyme soit un catalyseur industriel viable. L’enzyme doit être compatible et stable. Au niveau fonctionnel, la stabilité d’une enzyme limite souvent son application pratique dans des processus médicinaux et biotechnologiques. Une alternative consiste à im mobiliser l’enzyme sur une matrice approprié. Du point de vue industriel, les biocatalyseurs immobilisés présentent une stabilité augmentée, des changements dans l’activité enzymatique, le pH optimum et l’affinité pour le substrat ont été observés (Balcão et al., 1996 ; Ivanov et al., 1997 ; Ramachandra et al., 2002).
Les méthodes d’immobilisation d’enzymes peuvent être regroupées en cinq grandes catégories :

Immobilisation par adsorption

L’immobilisation par adsorption repose sur l’établissement d’interactions de type liaisons de faible niveau énergétique (Van der Wals, ionique, hydrogène, transfert de charges, échange de ligands, hydrophobe, pont métallique…)entre les groupes fonctionnels situés à la surface de la molécule d’enzyme et ceux présents à la surface du support insoluble. Les paramètres qui conditionnent l’efficacité de l’adsorption sont : la concentration d’enzyme, l’aire spécifique disponible par unité de masse desupport, le temps de contact, le milieu, le support.

Immobilisation par microencapsulation

L’enzyme en solution aqueuse est enfermé dans des microencapsules sphériques. Dont la paroi est une membrane semi-perméable qui peut être liquide ou solide. Cette membrane retient l’enzyme, mais laisse passer le substrat et le produit.

Immobilisation par inclusion

La molécule d’enzyme est retenue physiquement soit à l’intérieur du réseau tridimensionnel d’un gel ou d’un polymère, soit à l ’intérieur du volume défini par une membrane ou une microcapsule. Cette rétention peut éventuellement être accompagnée d’une réticulation covalente par un réactif polyfonctionnel.

Immobilisation par réticulation

Le principe est ici de ponter les molécules d’enzymes entre elles, ou entre elles et d’autres protéines, à l’aide d’un réactif polyfonctionnel tel que le glutaraldéhyde, afin d’obtenir des macrostructures insolubles.

Immobilisation par des liaisons covalente

Lorsque l’on désire éviter tout risque de libération des moléculesd’enzymes dans le milieu, la solution de choix est l’établissement de liaisons covalentes. Il faut pour cela impliquer les groupes fonctionnels présents à la surface de la molécule d’enzyme, dont la réactivité chimique est très limitée.
Aucune méthode d’immobilisation n’est générale. Ilfaut prendre en compte à la fois la nature et la pureté de la préparation d’enzyme miseen œuvre, le type de réaction (substrat, produit, milieu réactionnel, pH, température), lescontraintes économiques spécifiques, pour choisir la méthode adéquate (Amorim et al., 2003 Bagi; et al., 1997).

Dénaturation des enzymes

La structure tertiaire ou quaternaire des enzymes, dépend des forces responsables des liens reliant entre eux les radicaux des acides aminés constituant sa structure primaire. Dans certaines conditions, ces liens peuvent se défaire. L’enzyme peut alors changer de forme.
Comme nous le verrons plus loin, la fonction biologique d’une protéine est intimement liée à sa forme. La protéine modifiée ne peut donc généralement plus assurer sa fonction. Elle est alors dite dénaturée. Les trois principaux facteurspouvant provoqué la dénaturation d’une protéine (Dixon et al., 1979)sont:
La chaleur : L’agitation thermique a pour effet de briser les faibles liaisons hydrogène reliant les radicaux de la chaîne.
Un pH extrême :La plupart des protéines se dénaturent en milieu trop acide ou trop alcalin.
Un milieu très concentré en électrolytes(ions).

Domaines d’applications des enzymes

Enzymes et biocatalyses
Les principaux domaines d’utilisation sont l’indust rie des détergents, de l’amidon (liquéfaction, puis son hydrolyse en monomères de D-glucose), l’agroalimentaire (alimentation humaine et animale), la chimie fine et le secteur de la santé, ainsi que les domaines de l’analyse (elles sont très souvent utilisées pour déterminer la concentration de leur substrat par des mesures de vitesse initiale de réaction) et des capteurs (Aehle W. 2004).

Les lipases

Les lipases ou les triacylglycéroacyl-hydrolases (EC 3.1.1.3), sont des enzymes atypiques de par leur mécanisme d’action et leur spécificité de substrats. Elles peuvent agir en tant qu’hydrolases en milieu aqueux ou comme catalyseurs en synthèse organique. En tant qu’hydrolases, elles sont responsables du catabolisme des triglycérides, leurs substrats préférentiels, en acide gras et en glycérol. En milieu solvant, elles peuvent catalyser un bon nombre de réactions allant de l’estérification à l’a cidolyse ou l’alcoolyse tout en présentant une certaine énantio-régio- et chimio-sélectivitéCe. sont des enzymes d’accès facile et ne nécessitent pas de cofacteur pour leur fonctionnement, ce qui facilite leur utilisation par les chimistes.

Origines des lipases

Les lipases sont largement répandues dans la natureoù elles ont un rôle physiologique important dans le métabolisme des graisses. On les retrouve aussi bien dans le règne végétal, chez les invertébrés et les vertébrés mais également chez des nombreux microorganismes, principalement sous forme de protéines extracellulaires.

Réaction de synthèse

Estérification et thioestérification

. RCOOH + R’OH RCOOR’ + H2O
. RCOOH + R’SH RCOSR’ + H2O
Par conséquent, l’eau générée au cours de l’estérification enzymatique doit être éliminée afin de poursuivre la réaction (Chamouleau et al.,2001).
L’eau joue également dans la structure du biocatalyseur un rôle que l’on peut qualifier de « lubrifiant » qui confère à l’enzyme la flexibiliténécessaire à la catalyse (Blecker C., 1993).
Ainsi, une teneur en eau en-dessous d’un certain seuil (0,5 %) ne permet pas l’hydratation nécessaire de la lipase et entraîne une diminution du rendement de la réaction (Secundo et al., 2002).

Transestérification

Interestérification

. R1COOR’1 + R2COOR’2 R1COOR2’ + R2COOR1’

Alcoolyse

. R1COOR1’ + R2OH R1COOR2 + R1’OH

Acidolyse :

. R1COOR1’ + R2COOH R1COOR2 + R1’COOH
La transestérification implique la réaction d’un groupe acyle avec un alcool (alcoolyse) ou avec le glycérol (glycérolyse).
Il existe plusieurs applications industrielles de la transestérification par la lipase, telles que la production des équivalents du beurre de cacao, deslipides riches en acides gras polyinsaturés, des substituts de matière grasse du lait et des huiles de basse valeur calorique (Lancelot et al., 2002). L’utilisation des enzymes dans ce type de réactionest préférée à la catalyse chimique qui nécessite des conditions de réaction moins modéréesainsi qu’une étape de purification du produit final.

Immobilisation de la lipase Candida cylindracéa (CCL)

Une approche possible pour stabiliser les enzymes est leur immobilisation sur une matrice appropriée. L’immobilisation des enzymes fait modifier leur stabilité, leur activité enzymatique, leur pH optimum et leur réactivité vis-à-vis des substrats. Ces changements dépendent de la source de l’enzyme, du type de support et de la méthode d’immobilisation utilisé.
Dans notre travail nous avons immobilisé la lipase du Candida cylindracéa (CCL) par adsorption sur silice et sur célite.

Estérification enzymatique de l’α-(+)-D-glucose

L’ α-(+)-D-glucose est estérifié par l’acide laurique ne présence de la lipase de Candida cylindracéa (CCL) libre et immobilisée sur célite(CCL ) et sur silice (CCL ) à im(c) im(s) l’échelle du laboratoire. Les réactions ont lieu dans l’EMK à différentes températures. L’avancement de la réaction est suivi par CCM. Des échantillons sont prélevés à intervalles réguliers afin d’évaluer la conversion. Après un certain temps, qui dépend de la réactivité de l’enzyme, les produits obtenus sont récupérés et séparés par chromatographie sur colonne.

Résultats et discussion

Influence de la quantité du tamis moléculaire

L’estérification enzymatique est une réaction réversible qui se produit entre un acide carboxylique et un alcool en présence d’une lipase pour donner un ester et de l’eau. Pour favoriser la formation de l’ester il faut éliminer l’eau produite au cours de la réaction. Pour cela l’introduction d’une certaine quantité de tamis moléculaire dans le milieu réactionnel est nécessaire. Il ne faut cependant pas perdre de vue qu’un minimum d’eau est quand même nécessaire pour que l’enzyme soit active. Cette teneur en eau varie en fonction du type de la lipase utilisée.
Ceci nous amène à rechercher la quantité optimale de tamis moléculaire à introduire dans le milieu réactionnel. Nous avons varié la quantité detamis moléculaire de 5 à 50 mg en passant par des quantités intermédiaires. Les résultats obtenus sont réunis dans les figures 5, 6 et 7.

Table des matières

 Introduction générale 
Chapitre 1 : Mise au point bibliographique sur les tensioactifs
1. Introduction
2. Les différentes classes des tensioactifs
2.1. Les tensioactifs anioniques
2.2. Les tensioactifs cationiques
2.3.Les tensioactifs zwitterioniques
2.4. Les tensioactifs non ioniques
3. Domaine d’application des tensioactifs
3.1. Secteur de la détergence
3.2. Secteur de la cosmétique
3.3. Secteur industriel
4. Les esters de sucre
4.1. Synthèse par voie chimique
4.2. La synthèse enzymatique
5. Influence du milieu réactionnel sur la synthèse enzymatique des esters de sucre
5.1. L’influence de l’eau
5.2.L’influence de solvant organique
5.3. L’influence de la longueur de la chaine de l’agent acylant
5.4. L’influence de la nature de la lipase
5.5. L’influence de la température
5.6. L’influence du rapport molaire entre les substrats
6. Application potentielles des esters de sucre
7. Conclusion 
Chapitre 2 : Mise au point bibliographique sur les enzymes
1. Introduction
2. Composition des enzymes
3. Efficacité catalytique des enzymes
4. Structure des enzymes
4.1.Structure primaire
4.2. Structure secondaire
4.3. Structure tertiair
4.4. Structure quaternaire
5. Mécanisme d’action des enzymes
6. Classification des enzymes
6.1. Nomenclature systématique
6.2. Classification CAZy
7. Cinétique enzymatique (équation de Michaelis-Menten)
8. Immobilisation des enzymes
8.1. Immobilisation par adsorption
8.2. Immobilisation par micrencapsulation
8.3. Immobilisation par inclusion
8.4. Immobilisation par réticulation
8.5. Immobilisation par des liaisons covalente
9. Dénaturation des enzymes
10. Domaines d’applications des enzymes
11. Les lipases
11.1. Origines des lipases
11.2. Structure et mécanisme réactionnel des lipases
11.2.1. Mécanisme réactionnel des lipases
11.2.2. Structure des lipases
11.3. Application des lipases
11.3.1. Réaction d’hydrolyse
11.3.2. Réaction de synthèse 
11.3.2.1.Estérification et thioestération
11.3.2.2. Transestérification
11.3.2.2.1. Interestérification
11.3.2.2.2. Alcoolyse
11.3.2.2.3. Acidolyse
12. Conclusion
Chapitre 3 : Estérification enzymatique de l’α-(+)-D glucose
1. Introduction
2. La réaction d’acylation
2.1. Acylation par voie chimique
2.2. Acylation par voie enzymatique
3. Acylation enzymatique de l’α-(+)-D-glucose
4. Immobilisation de la lipase Candida cylindracéa
5. Estérification enzymatique de l’α-(+)-D-glucose
6. Résultats et discussion
6.1. Influence de la quantité du tamis moléculaire
6.2. Influence de la quantité d’enzymes
6.3. Influence de la quantité d’agent acylant
6.4. Influence de la température
6.5. Influence d’un cosolvant
7. Conclusion
Conclusion générale
Protocoles expérimentaux
Références bibliographiques 

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