Importance des contrôles pour l’expression des gènes

 Importance des contrôles pour l’expression des gènes

La production des protéines en quantité et de qualité nécessaire pour la vie d’une cellule dépend du bon déroulement des étapes indiquées précédemment. Des erreurs sont possibles à chaque niveau. C’est pourquoi, des systèmes de contrôle détectent ces erreurs, les corrigent ou les éliminent. La qualité des ARNs par exemple est très contrôlée (Figure 1) afin d’éviter la traduction d’ARN dit « aberrant ». Par le terme aberrant, on considère ici les ARNs qui, étant apparentés à des ARNm qui codent pour des protéines cellulaires, ne servent pas à cette fonction.

La transcription est la plus grande source d’erreur pour la synthèse des ARNs aberrants avec quatre erreurs pour un million de bases transcrites (Gout et al., 2017) c’est-à-dire cent fois plus que les erreurs de réplication de l’ADN (Lynch et al., 2016). Les erreurs peuvent être des insertions ou des délétions de base qui provoquent ensuite des changements du cadre de lecture pour la traduction et le codage de codon Stop précoce (PTC : Premature Termination Codon). Ces erreurs sont très délétères car elles peuvent aboutir à la production de protéines tronquées (Hall and Thein, 1994). L’effet de ces mutations dépend du gène dans lequel elle a lieu et si cela aboutit à la production d’une version dominant-négative de la protéine ou non.

Dans la plupart des cas, les protéines tronquées n’ont pas d’effet sur le phénotype, mais elles peuvent aussi être toxiques, en cas d’agrégation par exemple (Leeuwen et al., 1998) ou si elles entraînent une perte de fonction par effet de dose (Fan et al., 2001). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), les erreurs de transcription sont associées à un stress protéotoxique ainsi qu’à une augmentation du vieillissement (Vermulst et al., 2015).

En plus des erreurs de fidélité de la transcription, le développement du séquençage des ARNs à haut débit a permis d’identifier des catégories d’ARN non traduits provenant de la forte activité de l’ARN polymérase II. Celle-ci s’associe aux régions d’ADN dépourvues de nucléosomes et peut initier des événements de transcription sur le brin sens comme sur le brin anti-sens (Neil et al., 2009; Xu et al., 2009), en amont ou en aval des sites de démarrage de la transcription canonique (Zhang and Dietrich, 2005; Pelechano et al., 2013; Malabat et al., 2015). C’est la transcription «pervasive » (résumé dans Jensen et al., 2013). Ces transcrits plus ou moins longs peuvent avoir une terminaison de la transcription anormale et, dans ce cas, sont reconnus par un complexe de surveillance des arrêts précoces de transcription et dégradés. Ces transcrits sont appelés les transcrits cryptiques non stables (CUT : Cryptic Unstable Transcripts), ils ne sont pas visibles dans des conditions sauvages car dégradés trop rapidement. Pour les observer, il faut inactiver le contrôle nucléaire (Wyers et al., 2005; Davis and Ares, 2006; Houalla et al., 2006). Parfois, les transcrits pervasifs échappent à ce contrôle précoce et sont exportés vers le cytoplasme. Dans d’autres cas, les transcrits ont une terminaison normale et sont de tout point de vue normaux par rapport aux systèmes de contrôle qualité nucléaire. Une fois arrivés dans le cytoplasme, ces divers types de transcrits aberrants entrent en traduction, ce qui déclenche leur dégradation rapide. Cette dégradation  commence par l’enlèvement de la coiffe et est poursuivie par la dégradation par Xrn1, une exonucléase 5’ vers 3’ non spécifique. Si on observe une stabilisation d’un transcrit dans des cellules qui n’ont pas de Xrn1, on parle alors de XUT (Xrn1 dependent Unannotated Transcripts ; van Dijk et al., 2011). Certains transcrits pervasifs sont plus résistants à la dégradation et restent suffisamment stables dans le cytoplasme pour être détectés, on les appelle les SUTs (Stable Unannotated Transcripts ; Neil et al., 2009; Xu et al., 2009). Les XUTs et les SUTs sont des catégories non-exclusives, de nombreux transcrits appartiennent aux deux classes .

Les différentes étapes de maturation de l’ARN peuvent aussi être altérées. L’ajout de la coiffe est un mécanisme en deux étapes, dans un premier temps l’association d’une enzyme triphosphatase et d’une guanylyl transférase (Cet1/Ceg1 chez la levure S. cerevisiae) ajoute le guanosyl-triphosphate puis Abd1 (S. cerevisiae) transfert un groupement méthyl formant la coiffe m7 -GpppN (résumé dans Ramanathan et al., 2016). En cas de dysfonctionnement, par exemple si la méthylation n’a pas lieu, un mécanisme de contrôle nucléaire permet d’enlever la coiffe de guanine en clivant l’ARN rétablissant ainsi une extrémité 5’ monophosphate, qui sera dégradée par une exonucléase nucléaire. Chez les mammifères la protéine DXO assure seule ce contrôle (Jiao et al., 2013), chez la levure de boulanger, il existe deux systèmes redondants, la voie Rai1/Rat1 (Jiao et al., 2010) et la voie Dxo (Chang et al., 2012). Si l’épissage n’est pas correctement réalisé, des contrôles qualités nucléaires évitent l’export de ces ARNs vers le cytoplasme. La poly-adénylation peut aussi être perturbée ou arriver prématurément à des sites cryptiques (Ozsolak et al., 2010). Un ARN non poly-adénylé n’est pas protégé et il est aussitôt dégradé par l’exosome nucléaire (Hilleren et al., 2001). Un ARN non exporté voit sa queue poly(A) allongée ce qui a pour conséquence le recrutement de l’exosome nucléaire qui dégrade les ARNs (Jensen et al., 2001). Par ailleurs les liens existant entre les différentes étapes sont aussi des contrôles, à l’image du complexe de jonction des exons (EJC) chez la plupart des eucaryotes qui est déposé pendant l’épissage sur les ARNs et participe à l’export efficace des ARNs dans le cytoplasme (Le Hir et al., 2001). Enfin la traduction comporte aussi son lot d’erreur, une erreur par millier de bases (Zaher and Green, 2009). Le problème peut provenir des ARNs de transfert (ARNt) si l’anticodon et l’acide-aminé fixé ne correspondent pas. Le ribosome seul peut aussi engendrer des erreurs et incorporer un acide-aminé à la place d’un codon Stop ou décaler le cadre de lecture (résumé dans Dunkle and Dunham, 2015).

Les ARNs portants des erreurs ou résultants du manque de précision de la transcription et des étapes de maturations sont considérés comme aberrants et seront dégradés. La dégradation de ces ARNs utilise les voies classiques de dégradation des ARNs de la cellule dans le noyau et dans le cytoplasme.

La dégradation cytoplasmique des ARNs

La dégradation des ARNs dans le cytoplasme suit deux voies distinctes (Figure 2). Chez la levure S. cerevisiae, ces deux voies impliquent une première étape commune de déadénylation (Decker and Parker, 1993; Muhlrad and Parker, 1992) par les complexes Pan2/Pan3 et Ccr4/Pop2/Not (Brown and Sachs, 1998; Tucker et al., 2001). Pour la voie majeure de dégradation chez les eucaryotes, la dé adénylation des ARNs est suivie de l’hydrolyse de la coiffe (décapping) en 5’ par l’hétérodimère Dcp1/Dcp2 et le grignotage de l’ARN de l’extrémité 5’ vers le 3’ par l’exonucléase Xrn1 (Beelman et al., 1996; Couttet et al., 1997; van Dijk et al., 2002; Dunckley and Parker, 1999; Hsu and Stevens, 1993; Muhlrad et al., 1994, 1995; Steiger et al., 2003). Ce mécanisme de dégradation est secondé par la voie de l’exosome cytoplasmique qui permet après dé-adénylation de dégrader les ARNs de l’extrémité 3’ vers le 5’ (Anderson and Parker, 1998) aidée du complexe SKI (Ski2, 3, 8) et de la protéine Ski7. Ces deux voies existent chez tous les eucaryotes et leur importance varie en fonction des espèces. La dégradation des ARNs dans le cytoplasme est le dernier levier de régulation de l’expression des gènes. Le temps de vie d’un ARN varie en fonction des espèces d’ARN, de trois minutes à plus de cent minutes chez la levure S. cerevisiae (Wang et al., 2002).

Table des matières

Introduction
I. Importance des contrôles pour l’expression des gènes
II. La dégradation cytoplasmique des ARNs.
1. Dé-adénylation
2. Dégradation 5’ vers 3’
3. Dégradation 3’ vers 5’
4. Régulation des voies de dégradation des ARNs
III. Dégradation des ARNs aberrants
1. Mécanisme de la traduction
2. Contrôles dépendant de la traduction
3. Activation du NMD au niveau de ses substrats
4. Facteurs associés au NMD
5. Upf1, facteur majeur du NMD
6. Upf2, plateforme pour des interactions protéiques
7. Upf3
8. Le cycle de phosphorylation d’Upf1
9. Le recrutement de Smg5, Smg6 et Smg7 déclenche la dégradation des ARNs
10. Modèle EJC-dépendant du NMD : SURF- DECID
11. Modèle EJC-indépendant du NMD
IV. Fonctions physiologiques et patho-physiologiques du NMD et de ses facteurs
Objectifs de la thèse
Développement technologique
Analyse des données de spectrométrie de masse
Résultats
I. Recrutement d’Upf1 au niveau des ARNs cibles
1. Upf1 interagit avec les 3’-UTR de centaines d’ARNs
2. Les mutations du domaine hélicase d’Upf1 n’affectent pas ses interactions avec les autres partenaires.
II. Complexes protéiques impliqués dans le NMD et leur dynamique
1. Stratégie utilisée et introduction aux résultats
2. Article de thèse
Abstract
Conclusion

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