Soutenance mรฉmoire
Importance des cellules germinales et interactions cellules germinales
Prolifรฉration et migration
En plus des gรจnes spรฉcifiques des cellules germinales, tels que Nanos3, Vasa, Dazl, Mvh, les CGP de souris expriment aussi des gรจnes associรฉs ร la pluripotence, tels que Oct4, Nanog, Sox2. Nanog n’est pas indispensable ร la spรฉcification des CGP mais est essentiel pour le maintien des cellules germinales. Sox2, quant-ร -lui, est dรฉtectรฉ dans les CGP ร partir de E7.5 et rรฉgule l’expression de Kit, qui est impliquรฉ dans la survie et la prolifรฉration des CGP (Irie et al., 2014). Dรจs le stade E7.5, les CGP sont identifiables et forment un cluster d’environ 40 cellules, ร l’extrรฉmitรฉ postรฉrieure de la lignรฉe primitive, ร la base de l’allantoรฏde de l’embryon de souris (Ginsburg et al., 1990). Elles poursuivent ensuite leur migration via le mรฉsentรจre dorsal (E7.75) pour atteindre le territoire gonadique ร E10-11 (Richardson et Lehmann, 2010). Il a รฉtรฉ dรฉmontrรฉ in vitro que les crรชtes gรฉnitales exercent un chimiotactisme positif sur les CGP, par l’intermรฉdiaire de facteurs, et que le TGF-๏ข pourrait รชtre l’un d’entre eux. De plus, le rรฉcepteur ร tyrosine kinase c-kit et son ligand Kit Ligand (KL), interviennent dans la multiplication et la migration des CGP (McLaren 1994). Chez les embryons femelles souris, les CGP continuent ร prolifรฉrer jusqu’ร E13.5, stade auquel leur nombre avoisine les 25 000 et elles entrent ensuite en prophase I de mรฉiose (Speed, 1982).
Modรจle de spรฉcification spontanรฉe des CGPs – exemple poisson-zรจbre
A la diffรฉrence des mammifรจres, chez d’autres organismes, les CGP se diffรฉrencient de faรงon spontanรฉe par la localisation de dรฉterminants maternels, prรฉsents sous forme d’ARNm et de protรฉines, dans le cytoplasme germinal de l’embryon, dรจs les premiers stades embryonnaires (Figure 8). Chez ces espรจces, Vasa semble รชtre l’un des facteurs majeurs du dรฉveloppement de la lignรฉe germinale, tandis qu’il n’aurait qu’un rรดle mineur dans la mise en place de celle-ci chez des espรจces ร spรฉcification induite (mammifรจres, Wylie, 1999).Chez le poisson-zรจbre, la spรฉcification des CGP semble dรฉpendre du cytoplasme germinal, dans lequel de nombreuses molรฉcules d’ARNn d’origine maternelle rรฉsident, telles que vasa et nanos. L’identification du gรจne homologue vasa chez le poisson-zรจbre a permis de dรฉcrire le dรฉveloppement des CGP de cette espรจce. Les ARNs de cet homologue vasa peuvent-รชtre localisรฉs au niveau des clivages, dรจs les stades 2 et 4 cellules, dans les embryons de poisson-zรจbre et sont ensuite exprimรฉs dans les CGP (Yoon et al., 1997). Par hybridation in situ de vasa, des CGP sont identifiables aux niveaux des somites 2 et 3, dรจs le stade de dรฉveloppement 5 somites des embryons (12h aprรจs la fรฉcondation (hpf). Ces CGP sont de grosses cellules par rapport aux cellules somatiques qui les entourent (Yoon et al., 1997). La protรฉine vasa est รฉgalement prรฉsente dans les cellules germinales, du dรฉbut de la spรฉcification ร la maturation de celles-ci, mais aussi de la diffรฉrenciation ร l’รฉtablissement de la gonade adulte mรขle ou femelle chez le poisson-zรจbre (Braat et al., 2000).
Marqueur des cellules germinales
Le gรจne Vasa code pour un type DDX4 d’hรฉlicase RNA ATP-dรฉpendante (Bachvarova et al., 2009). Ce gรจne est trรจs conservรฉ au cours de l’รฉvolution ; il a รฉtรฉ caractรฉrisรฉ chez D. melanogaster par Hay et al. (1988) et de nombreux orthologues ont รฉtรฉ retrouvรฉs chez diffรฉrentes espรจces de Vertรฉbrรฉs, comme le gรจne vas chez D. rerio (Yoon et al., 1997), Xvlg-1 chez le xรฉnope Xenopus laevis (Ikenishi et al., 1996), Cvh chez le poulet Gallus gallus (Tsunekawa et al., 2000) et Mvh chez la souris M. musculus (Toyooka et al., 2000). Chez le tilapia du Nil, l’รฉpissage alternatif donne deux formes d’ARNm de Vasa, une forme longue vas et une forme raccourcie dans la rรฉgion 5’vas-s. Les formes vas-s et vas dominent respectivement dans les ovaires et dans les testicules (Kobayashi et al., 2002). Vasa a une fonction dans la structuration postรฉrieure et dans la spรฉcification des cellules germinales chez l’embryon (Gustafon et al., 2011). Il participerait รฉgalement au maintien de la totipotence cellulaire, en inhibant les gรจnes conduisant ร la diffรฉrenciation somatique (Raz, 2000), ce qui fait de lui l’un des dรฉterminants majeurs de la lignรฉe germinale. Durant la gonadogenรจse, il est prรฉsent dans les testicules et les ovaires des vertรฉbrรฉs, au niveau des cellules germinales des deux sexes. Vasa, qui est essentiel pour le dรฉveloppement des CG, est souvent utilisรฉ comme indicateur de ce processus (Raz, 2000). C’est un outil prรฉcieux pour mettre en รฉvidence (protรฉine – immunohistochimie) ou bien รฉtudier l’expression (transcrit – hybridation in situ et qPCR), mais il ne s’exprime que dans les CG ร des stades prรฉcoces (spermatogonies, spermatocytes primaires). Il existe des animaux transgรฉniques vasa-GFP chez le poisson-zรจbre et le mรฉdaka (Saito et al., 2006), dont les CG sont rendues fluorescentes grรขce au couplage avec la GFP, une protรฉine issue de la mรฉduse. A ce jour il n’existe pas de lignรฉe vasa-GFP chez le tilapia.
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Table des matiรจres
Remerciements Rรฉsumรฉ Rรฉsumรฉ en anglais Table des matiรจres Abrรฉviations Partie Introduction Contexte et problรฉmatique de la thรจse : l'intรฉrรชt de la stรฉrilisation en aquaculture Synthรจse bibliographique Morphogenรจse gonadique Mammifรจres : formation de la gonade indiffรฉrenciรฉe, diffรฉrenciation testiculaire et ovarienne. Poissons tรฉlรฉostรฉens Gรจnes impliquรฉs dans la gonadogenรจse et la diffรฉrenciation du sexe Chez les mammifรจres Diffรฉrenciation testiculaire . Sex determination region Y (Sry) Sry-box 9 (Sox9) Fiber Fibroblast growth factor 9 (Fgf9) L'hormone antimรผllรฉrienne (Amh) Les rรฉcepteurs ร Amh (AmhR2) Steroidogenic factor 1 (Sf-1) Diffรฉrenciation ovarienne Wingless-related MMTV integration site 4 (Wnt4) R-spondin-1 (Rspo1) Forkhead-box-L2 ou Foxl2 et lโaromatase ou cytochrome P450arom ou cyp19a1 Chez les poissons tรฉlรฉostรฉens Diffรฉrenciation testiculaire Dรฉterminants majeurs du sexe Sry-box 9 (Sox9) Doublesex and mab-3 (DM)-related transcription factor1 (Dmrt1) Gรจnes codant pour les enzymes impliquรฉes dans la stรฉroรฏdogenรจse Hormone antimรผllรฉrienne (Amh) Rรฉcepteur ร l'amh de type II (AmhR2) Diffรฉrenciation ovarienne Aromatase ou cytochrome P450arom ou cyp19a1 Forkhead-box-L2 (Foxl2) Importance des cellules germinales et interactions cellules germinales - cellules somatiques Spรฉcification des cellules germinales primordiales. Modรจle de spรฉcification induite des CGPs - exemple de la souris. Induction Prolifรฉration et migration Modรจle de spรฉcification spontanรฉe des CGPs - exemple poisson-zรจbre. Vasa Marqueur des cellules germinales Exemple du tilapia du Nil Rรดle des cellules germinales Cas du poisson-zรจbre Cas des mammifรจres Interaction cellules germinales - somatiques Cellules somatiques Interactions cellulaires Cas du mรฉdaka Cas du poisson-zรจbre Cas des mammifรจres Apoptose des CG en rรฉponse ร un stress environnemental (tempรฉrature) ou chimique Cas du poisson-zรจbre Cas du pejerrey Cas des mammifรจres Facteurs externes influenรงant la diffรฉrenciation et/ou la fertilitรฉ de la gonade Diffรฉrenciation du sexe : masculinisation et fรฉminisation Stรฉroรฏdes sexuels chez les mammifรจres et les tรฉlรฉostรฉens Voies de synthรจse des androgรจnes et des oestrogรจnes Induction d'une inversion sexuelle par les hormones stรฉroรฏdiennes appliquรฉes chez les alevins, avant et pendant la diffรฉrenciation sexuelle. Induction d'une inversion sexuelle par des inhibiteurs de l'aromatase, appliquรฉs chez les adultes, aprรจs la maturation sexuelle. La tempรฉrature Chez les mammifรจres Chez les poissons La fertilitรฉ/stรฉrilitรฉ Les mรฉthodes de stรฉrilisation utilisรฉes en aquaculture Les manipulations gรฉnรฉtiques : la triploรฏdisation. Mรฉthodes de stรฉrilisation envisagรฉes en aquaculture Approche รฉcologique : les tempรฉratures stรฉrilisantes. Une plante mรฉdicinale: la graine de papaye Carica papaya Mรฉthodes efficaces, mais non autorisรฉes en aquaculture Transgรฉnรจse Une molรฉcule chimique le busulfan. Prรฉsentation de la thรจse Modรจle biologique : le tilapia du Nil, Oreochromis niloticus Taxonomie Biologie Comportement de reproduction La thermosensibilitรฉ Intรฉrรชt du contrรดle du sexe et de la stรฉrilisation en aquaculture Intรฉrรชt รฉconomique et importance du contrรดle du sexe, chez le tilapia du Nil. Effet de la tempรฉrature sur la diffรฉrenciation sexuelle du tilapia Stรฉrilitรฉ et tilapia Utilisation des manipulations gรฉnรฉtiques : la triploรฏdisation Utilisation d'une plante mรฉdicinale, la graine de papaye Carica papaya Objectifs du travail Partie 2 : Matรฉriels et Mรฉthodes Animaux et expรฉrimentations Traitements tempรฉratures des alevins Traitements tempรฉratures des juvรฉniles Traitements au busulfan sur des alevins et des juvรฉniles Administration par injection intra-pรฉritonรฉale ร la dose de 40 mg de busulfan/kg de poids vif Administration par incorporation ร l'alimentation aux doses de 40-80-160 mg busulfan/Kg d'aliment Sexage Extraction des ARN totaux, traitement DNase et Reverse transcription Extraction des ARN totaux Traitement DNAse et Reverse transcription. PCR quantitative en temps rรฉel ou qPCR. Analyse histologique des gonades Analyses immunohistochimiques des protรฉines Vasa et PCNA Protocole รฉlaborรฉ sur la plateforme PHIV du CIRAD Protocole รฉlaborรฉ par Histalim Essai TUNEL Protocole รฉlaborรฉ sur la plateforme PHIV Protocole รฉlaborรฉ par Histalim Expรฉrimentation busulfan injectรฉ en intra-pรฉritonรฉal ร une dose de 40 mg/kg de poids vif de poissons Sex-ratio (SR ou phรฉnotype gonadique), Index gonado-somatique (RGS) et survie Structure cellulaire 2.2. Deuxiรจme sรฉrie d'expรฉrimentation : busulfan dans l'aliment ร des doses de 40, 80 et 160 mg/kg d'aliment Sex-ratio (SR ou phรฉnotype gonadique), Index gonado-somatique (RGS) et survie Structure cellulaire Y-a-t-il un impact du busulfan sur les cellules germinales des gonades de tilapias femelles et mรขles Au niveau molรฉculaire. Profil d'expression du gรจne Vasa Profil d'expression du gรจne amh Profil d'expression du gรจne cyp19a1a Discussion Gรฉnรฉrale Conclusion Bibliographie Annexes
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