Soutenance mémoire
Importance des cellules germinales et interactions cellules germinales
Prolifération et migration
En plus des gènes spécifiques des cellules germinales, tels que Nanos3, Vasa, Dazl, Mvh, les CGP de souris expriment aussi des gènes associés à la pluripotence, tels que Oct4, Nanog, Sox2. Nanog n’est pas indispensable à la spécification des CGP mais est essentiel pour le maintien des cellules germinales. Sox2, quant-à-lui, est détecté dans les CGP à partir de E7.5 et régule l’expression de Kit, qui est impliqué dans la survie et la prolifération des CGP (Irie et al., 2014). Dès le stade E7.5, les CGP sont identifiables et forment un cluster d’environ 40 cellules, à l’extrémité postérieure de la lignée primitive, à la base de l’allantoïde de l’embryon de souris (Ginsburg et al., 1990). Elles poursuivent ensuite leur migration via le mésentère dorsal (E7.75) pour atteindre le territoire gonadique à E10-11 (Richardson et Lehmann, 2010). Il a été démontré in vitro que les crêtes génitales exercent un chimiotactisme positif sur les CGP, par l’intermédiaire de facteurs, et que le TGF- pourrait être l’un d’entre eux. De plus, le récepteur à tyrosine kinase c-kit et son ligand Kit Ligand (KL), interviennent dans la multiplication et la migration des CGP (McLaren 1994). Chez les embryons femelles souris, les CGP continuent à proliférer jusqu’à E13.5, stade auquel leur nombre avoisine les 25 000 et elles entrent ensuite en prophase I de méiose (Speed, 1982).
Modèle de spécification spontanée des CGPs – exemple poisson-zèbre
A la différence des mammifères, chez d’autres organismes, les CGP se différencient de façon spontanée par la localisation de déterminants maternels, présents sous forme d’ARNm et de protéines, dans le cytoplasme germinal de l’embryon, dès les premiers stades embryonnaires (Figure 8). Chez ces espèces, Vasa semble être l’un des facteurs majeurs du développement de la lignée germinale, tandis qu’il n’aurait qu’un rôle mineur dans la mise en place de celle-ci chez des espèces à spécification induite (mammifères, Wylie, 1999).Chez le poisson-zèbre, la spécification des CGP semble dépendre du cytoplasme germinal, dans lequel de nombreuses molécules d’ARNn d’origine maternelle résident, telles que vasa et nanos. L’identification du gène homologue vasa chez le poisson-zèbre a permis de décrire le développement des CGP de cette espèce. Les ARNs de cet homologue vasa peuvent-être localisés au niveau des clivages, dès les stades 2 et 4 cellules, dans les embryons de poisson-zèbre et sont ensuite exprimés dans les CGP (Yoon et al., 1997). Par hybridation in situ de vasa, des CGP sont identifiables aux niveaux des somites 2 et 3, dès le stade de développement 5 somites des embryons (12h après la fécondation (hpf). Ces CGP sont de grosses cellules par rapport aux cellules somatiques qui les entourent (Yoon et al., 1997). La protéine vasa est également présente dans les cellules germinales, du début de la spécification à la maturation de celles-ci, mais aussi de la différenciation à l’établissement de la gonade adulte mâle ou femelle chez le poisson-zèbre (Braat et al., 2000).
Marqueur des cellules germinales
Le gène Vasa code pour un type DDX4 d’hélicase RNA ATP-dépendante (Bachvarova et al., 2009). Ce gène est très conservé au cours de l’évolution ; il a été caractérisé chez D. melanogaster par Hay et al. (1988) et de nombreux orthologues ont été retrouvés chez différentes espèces de Vertébrés, comme le gène vas chez D. rerio (Yoon et al., 1997), Xvlg-1 chez le xénope Xenopus laevis (Ikenishi et al., 1996), Cvh chez le poulet Gallus gallus (Tsunekawa et al., 2000) et Mvh chez la souris M. musculus (Toyooka et al., 2000). Chez le tilapia du Nil, l’épissage alternatif donne deux formes d’ARNm de Vasa, une forme longue vas et une forme raccourcie dans la région 5’vas-s. Les formes vas-s et vas dominent respectivement dans les ovaires et dans les testicules (Kobayashi et al., 2002). Vasa a une fonction dans la structuration postérieure et dans la spécification des cellules germinales chez l’embryon (Gustafon et al., 2011). Il participerait également au maintien de la totipotence cellulaire, en inhibant les gènes conduisant à la différenciation somatique (Raz, 2000), ce qui fait de lui l’un des déterminants majeurs de la lignée germinale. Durant la gonadogenèse, il est présent dans les testicules et les ovaires des vertébrés, au niveau des cellules germinales des deux sexes. Vasa, qui est essentiel pour le développement des CG, est souvent utilisé comme indicateur de ce processus (Raz, 2000). C’est un outil précieux pour mettre en évidence (protéine – immunohistochimie) ou bien étudier l’expression (transcrit – hybridation in situ et qPCR), mais il ne s’exprime que dans les CG à des stades précoces (spermatogonies, spermatocytes primaires). Il existe des animaux transgéniques vasa-GFP chez le poisson-zèbre et le médaka (Saito et al., 2006), dont les CG sont rendues fluorescentes grâce au couplage avec la GFP, une protéine issue de la méduse. A ce jour il n’existe pas de lignée vasa-GFP chez le tilapia.
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Table des matières
Remerciements Résumé Résumé en anglais Table des matières Abréviations Partie Introduction Contexte et problématique de la thèse : l'intérêt de la stérilisation en aquaculture Synthèse bibliographique Morphogenèse gonadique Mammifères : formation de la gonade indifférenciée, différenciation testiculaire et ovarienne. Poissons téléostéens Gènes impliqués dans la gonadogenèse et la différenciation du sexe Chez les mammifères Différenciation testiculaire . Sex determination region Y (Sry) Sry-box 9 (Sox9) Fiber Fibroblast growth factor 9 (Fgf9) L'hormone antimüllérienne (Amh) Les récepteurs à Amh (AmhR2) Steroidogenic factor 1 (Sf-1) Différenciation ovarienne Wingless-related MMTV integration site 4 (Wnt4) R-spondin-1 (Rspo1) Forkhead-box-L2 ou Foxl2 et l’aromatase ou cytochrome P450arom ou cyp19a1 Chez les poissons téléostéens Différenciation testiculaire Déterminants majeurs du sexe Sry-box 9 (Sox9) Doublesex and mab-3 (DM)-related transcription factor1 (Dmrt1) Gènes codant pour les enzymes impliquées dans la stéroïdogenèse Hormone antimüllérienne (Amh) Récepteur à l'amh de type II (AmhR2) Différenciation ovarienne Aromatase ou cytochrome P450arom ou cyp19a1 Forkhead-box-L2 (Foxl2) Importance des cellules germinales et interactions cellules germinales - cellules somatiques Spécification des cellules germinales primordiales. Modèle de spécification induite des CGPs - exemple de la souris. Induction Prolifération et migration Modèle de spécification spontanée des CGPs - exemple poisson-zèbre. Vasa Marqueur des cellules germinales Exemple du tilapia du Nil Rôle des cellules germinales Cas du poisson-zèbre Cas des mammifères Interaction cellules germinales - somatiques Cellules somatiques Interactions cellulaires Cas du médaka Cas du poisson-zèbre Cas des mammifères Apoptose des CG en réponse à un stress environnemental (température) ou chimique Cas du poisson-zèbre Cas du pejerrey Cas des mammifères Facteurs externes influençant la différenciation et/ou la fertilité de la gonade Différenciation du sexe : masculinisation et féminisation Stéroïdes sexuels chez les mammifères et les téléostéens Voies de synthèse des androgènes et des oestrogènes Induction d'une inversion sexuelle par les hormones stéroïdiennes appliquées chez les alevins, avant et pendant la différenciation sexuelle. Induction d'une inversion sexuelle par des inhibiteurs de l'aromatase, appliqués chez les adultes, après la maturation sexuelle. La température Chez les mammifères Chez les poissons La fertilité/stérilité Les méthodes de stérilisation utilisées en aquaculture Les manipulations génétiques : la triploïdisation. Méthodes de stérilisation envisagées en aquaculture Approche écologique : les températures stérilisantes. Une plante médicinale: la graine de papaye Carica papaya Méthodes efficaces, mais non autorisées en aquaculture Transgénèse Une molécule chimique le busulfan. Présentation de la thèse Modèle biologique : le tilapia du Nil, Oreochromis niloticus Taxonomie Biologie Comportement de reproduction La thermosensibilité Intérêt du contrôle du sexe et de la stérilisation en aquaculture Intérêt économique et importance du contrôle du sexe, chez le tilapia du Nil. Effet de la température sur la différenciation sexuelle du tilapia Stérilité et tilapia Utilisation des manipulations génétiques : la triploïdisation Utilisation d'une plante médicinale, la graine de papaye Carica papaya Objectifs du travail Partie 2 : Matériels et Méthodes Animaux et expérimentations Traitements températures des alevins Traitements températures des juvéniles Traitements au busulfan sur des alevins et des juvéniles Administration par injection intra-péritonéale à la dose de 40 mg de busulfan/kg de poids vif Administration par incorporation à l'alimentation aux doses de 40-80-160 mg busulfan/Kg d'aliment Sexage Extraction des ARN totaux, traitement DNase et Reverse transcription Extraction des ARN totaux Traitement DNAse et Reverse transcription. PCR quantitative en temps réel ou qPCR. Analyse histologique des gonades Analyses immunohistochimiques des protéines Vasa et PCNA Protocole élaboré sur la plateforme PHIV du CIRAD Protocole élaboré par Histalim Essai TUNEL Protocole élaboré sur la plateforme PHIV Protocole élaboré par Histalim Expérimentation busulfan injecté en intra-péritonéal à une dose de 40 mg/kg de poids vif de poissons Sex-ratio (SR ou phénotype gonadique), Index gonado-somatique (RGS) et survie Structure cellulaire 2.2. Deuxième série d'expérimentation : busulfan dans l'aliment à des doses de 40, 80 et 160 mg/kg d'aliment Sex-ratio (SR ou phénotype gonadique), Index gonado-somatique (RGS) et survie Structure cellulaire Y-a-t-il un impact du busulfan sur les cellules germinales des gonades de tilapias femelles et mâles Au niveau moléculaire. Profil d'expression du gène Vasa Profil d'expression du gène amh Profil d'expression du gène cyp19a1a Discussion Générale Conclusion Bibliographie Annexes
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