Importance des Actinomycètes dans la production des kératinases

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Marché mondial et origine des protéases

Parmi les enzymes industrielles les protéases sont les plus vendues dans le monde et occupent plus de 65% du marché total d’enzymes (Figure 1) [32]. Les ventes mondiales des protéases sont estimées à plus de 50 milliards euros annuellement [3, 28]. Toutefois, ce sont les protéases alcalines de détergence, actives et stables à des pH alcalins, qui occupent la plus grande partie [4, 32]. Ce marché mondial est dominé par la société Novo Nordisk-Danmark (40 %) et la société Gist-Brocades-Hollande (20 %).
Les protéases microbiennes représentent approximativement 60 % du marché mondial des enzymes, elles sont préférées aux enzymes d’origines animale et végétale puisqu’elles possèdent toutes les caractéristiques souhaitables pour leurs applications biotechnologiques [34]. Ainsi, on distingue :
Les protéases bactériennes
La plupart des protéases commercialisées, essentiellement les protéases alcalines et les protéases thermostables, sont produites par des souches du genre Bacillus et Streptomyces. Les protéases les plus connues sont : la subtilisine (Carlsberg) produite par B lichniformis [35] utilisée dans les détergents, La subtilisine commerciale (BPN) produite par B amyloliquefaciens [36] et la protéase (SGPA) produite par [37, 38]. Les protéases bactériennes neutres sont actives à des pH allant de 5 à 8, elles sont faiblement thermo tolérantes et grâce à leur faible vitesse de réaction, ces protéases génèrent moins de coproduits amères lors de l’hydrolyse des protéines alimentaires, comparées à celles d’origine animale, d’où leur utilisation dans l’industrie alimentaire [29].D’autre part, les protéases alcalines bactériennes telles que les kératinases, sont caractérisées par leur importante activité à des pH alcalins, dans une zone de pH de 8 à 12 et présentent une température optimale d’activité autour de 60°C, elles sont caractérisées par leur large spécificité vis-à-vis des substrats. Ces différentes propriétés les rendent plus recherchées au niveau industriel [4].
Les protéases fongiques
Les champignons produisent un spectre plus large d’hydrolases que les bactéries. Ainsi, Aspergillus oryzae produit des protéases acides, neutres et alcalines. En fait, les protéases fongiques sont actives dans une large gamme de pH (entre 4 et 11) et montrent une large spécificité vis-à-vis des substrats. Cependant, elles ont un rendement réactionnel et une thermo tolérance plus faible que les protéases bactériennes [4, 16].
Les protéases fongiques acides présentent un optimum d’activité compris entre 3 et 5 sont stables à des pH allant de 2,5 à 6. Elles sont particulièrement utilisées dans l’industrie fromagère. Les protéases fongiques neutres sont des métalloprotéases actives à un pH voisin de 7 et sont inhibées par les agents chélatants comme EDTA. Elles sont utilisées pour supplémenter l’action des protéases végétales, animales et bactériennes et pour réduire le goût amer des hydrolysats protéiques alimentaires. Elles sont produites par plusieurs espèces telles que : Trichoderma harzianum, Aspergillus fumigatus et Aspergillus clavatus [39, 40, 41]

Application des protéases en biotechnologie

Généralement les enzymes sont largement utilisées par l’industrie aussi bien dans les biotechnologies blanches que moléculaires. Ainsi, 65% de ces enzymes sont des protéases dont les domaines d’applications sont variés. On distingue :
Industrie des détergents
Les premières enzymes fournies à cette industrie étaient les protéases, qui occupent aujourd’hui encore une position dominante. Les protéases représentent environ 60 % des ventes mondiales d’enzymes pour les détergents ménagers et environ 50 % des enzymes pour les détergents pour lave vaisselle automatique. Ces enzymes possèdent des propriétés nettoyantes croissantes et une grande stabilité face aux oxydants, Elles facilitent l’élimination des taches comme l’herbe, le sang, l’œuf et la sueur. Dans les détergents pour les vaisselles, elles aident à supprimer les films d’aliments protéiques comme l’œuf et le jus de viande [42].
Industrie de tannerie
Le traitement enzymatique en tannerie est préféré aux méthodes conventionnelles qui requièrent l’utilisation de produits chimiques polluants. Cette approche présente de nombreux autres avantages, notamment, le contrôle facile et rapide du processus avec réduction des pertes [43]. En 1997 des travaux de recherches ont apporté l’utilisation de la protéase alcaline de B. subtilis IIQDB32 pour le traitement des peaux de mouton [44], de même, en 1995 d’autres travaux ont utilisé la protéase alcaline de B. amyloliquefaciens pour le tannage des peaux [45]. Les protéases alcalines qui possèdent des activités élastolytiques et kératinolytiques sont très demandées dans ce type d’industrie.
Industrie agroalimentaire
Les protéases microbiennes sont traditionnellement exploitées dans différents secteurs d’industrie alimentaire. En fait, la fonction principale des protéases est l’hydrolyse protéique qui a été exploitée pour la préparation des hydrolysats protéiques de haute valeur nutritionnelle. Ces hydrolysats protéiques peuvent jouer un rôle important dans la régulation de la pression sanguine, ils sont introduits aussi dans la formulation des produits alimentaires pour nourrissons, dans des produits thérapeutiques spécifiques des régimes alimentaires et dans la fortification des jus de fruit et des boissons non alcoolisées [44].
Autres applications
Certaines protéases sont utilisées aussi en :
– Synthèse de peptides ;
– Traitement des rejets industriels ;
– Traitement de la soie ;
– Panification : Amélioration de l’élasticité de la pâte (les protéases fongiques) ;
– Industries laitière et fromagerie : Coagulation des protéines du lait et son aromatisation;
– Brasserie : Prévention du trouble au froid de la bière par action de la papaïne ;
– Préparation des hydrolysats de protéines à usage microbiologique telles que peptone, tryptone.

Les kératinases

Définition et mode d’action des kératinases

Les kératinases nommées aussi enzymes kératinolytiques représentent l’un des plus importants groupes d’enzymes protéolytiques qui ont un grand intérêt industriel et des applications dans différents secteurs, ces enzymes ont la capacité d’hydrolyser les kératines efficacement que d’autres protéases. Elles ont été classées comme des protéinases de mécanisme inconnu tel que recommandé par l’IUBMB (1978) avec le numéro [EC 3.4.21/24/99.11] [46]. Des recherches récentes ont indiqué que les kératinases sont comme les protéases à sérine en raison de leurs 97% d’homologie avec les protéases alcalines (Figure 7), et leur inhibition se fait par les même inhibiteurs des protéases à sérine, et elles peuvent être aussi des métallo-protéases [47, 48]. Ce sont des enzymes qui dégradent facilement la kératine des plumes, de laine et des cheveux ainsi que d’autres protéines fibreuses (l’élastine et le collagène) et d’autre non fibreuses (la caséine, la gélatine et l’albumine) avec un haut degré de spécificité.

Origine des kératinases

Les enzymes kératinolytique sont très répandues dans la nature et sont produites par un ensemble de micro-organismes qui se développent sous différentes conditions écologiques et environnementales, et ils montrent une grande capacité à dégrader les substrats kératiniques. Ces enzymes sont principalement sécrétées par une multitude de champignons, parasites pathogènes, dermatophytes et saprophytes tel que : Aspargillus Niger, Aspargillus versicolor,
Doratomyces microsporus, Trichophyton mentagrophytes et Microsporum canis [57, 58, 59, 60] et par des bactéries tel que le genre Streptomyce comme: Streptomyces gulbergensis, Streptomyces thermoviolaceus [61, 62, 63] et le genre Bacillus comme: Baccillus lichenoformis, Bacillus pumilus [17, 64, 65, 66]. Les kératinases bactériennes sont d’un intérêt particulier en raison de leur action sur un large éventail de substrats protéiques et tout particulièrement les kératines sur lesquelles elles agissent avec un niveau d’activité très élevé [4, 67]. L’activité kératinolytique des enzymes libérées par les micro-organismes dépendent de la nature de la souche utilisée, les propriétés du milieu de production et le mode de sécrétion [4].
Quelques exemples de travaux de recherches sur des champignons et des bactéries producteurs de kératinases ayant une activité kératinolytique et des propriétés physico-chimiques importantes sont représentés sur le Tableau 3
L’utilisation des kératinases microbiennes n’a été étudiée que récemment, les travaux de recherche et de développement sont jusqu’à présent en cours afin de créer de nouveaux produits à base de ces enzymes [68].

Physiologie de la production des kératinases

Les kératinases microbiennes, produites en présence d’un substrat kératinique, sont majoritairement extracellulaires et inductibles. Toutefois, une minorité sont membranaires [69, 70]. La majorité des travaux montrent que la fraction intracellulaire contient une activité disulfure réductase qui agit en synergie avec les kératinases extracellulaires pour dégrader la kératine par réduction des ponts disulfures. Donc, la kératinolyse se fait en deux étapes; une étape de sulfitolyse ou de réduction des ponts disulfures suivi d’une protéolyse. L’étape de la sulphitolyse ce fait soit en présence d’agents réducteurs (tels que sulfate de sodium, dithiotreitol (DTT) et mercaptoethanol) [71] ou de disulfure réductase [72]. La coopération de l’un de ces actes avec l’activité kératinolytique permet d’aboutir à une dégradation complète de la kératine.
Cependant, la chronologie de ces événements et leurs natures exactes ne sont pas encore bien élucidée. Les kératinases sont largement produites sur milieu contenant un substrat kératinique comme seule source de carbone et d’azote. [73]

Propriété physicochimiques des kératinases

Les kératinases sont des métallos enzymes qui appartiennent à la famille des protéases à sérine où les groupements –SH sont impliqués dans le maintien de l’activité enzymatique. Elles ont un poids moléculaire allant de 18 à 315 kDA [77]. La kératinase la plus petite de taille (18 kDa) est produite par S.albidoflavus K1-02 [54], et la plus grande de taille (315 kDa) est produite par Microsporum canis [83]. L’activité kératinolytique peut être inhibée par un certain nombre d’agents tel que PMSF et l’EDTA [84]. Par contre les ions métalliques comme le calcium et le zinc stabilisent l’activité enzymatique à des températures très élevées [85]. Ces enzymes ne sont pas glycolysée et sont généralement actives à des pH neutres et alcalins. (Tableau 4)
Les connaissances sur les protéases thermostables sont très peu approfondies et leurs modes de fonctionnements peu connus en comparaison par des protéases alcalines conventionnelles [16]. Les kératinase thermostables (et les enzymes thermostables en général) trouvent facilement leur place dans le monde industriel des enzymes en raison de leur grande activité et stabilité. Depuis quelques années, la découverte de nouvelles protéases thermostables s’est produite par l’isolement de microorganismes étant eux-mêmes résistants à des hautes températures, ces microorganismes thermophiles préfèrent des températures élevées pour leur croissance et ont donc besoin d’enzymes thermostables pour effectuer les réactions nécessaire [16]. La température optimale d’activité des kératinases s’étend de 30 à 80°C, de plus les kératinases de Chysosporium keratinophilum et Fervidobacterium islandicum A W-1 présentent respectivement des températures optimales exceptionnelles de 90 et 100°C [70]. Une haute thermostabilité (90min à 100°C) a été mentionnée pour la kératinase produite par F.islandicum A W-1 [70]. Les kératinases sécrétées par les Actinomycètes présentent un maximum d’activité à un large éventail de pH compris entre 7 à 12 et résistent à des températures très élevées allants de 55 à 90°C tel que, la kératinase produite par Thermoanaerobacter keratinophilus qui présente une stabilité pendant 6h à 80°C. Il est indiqué aussi que la stabilité thermique de ces enzymes augmente en présence de calcium [86, 87, 88]

Applications des protéases kératinolytiques en biotechnologie

Les kératinases de microorganismes ont attiré beaucoup d’attention pendant la dernière décennie,
en raison de la multitude de leurs applications industrielles.
Actuellement, l’application la plus prometteuse des kératinases ou de microorganismes kératinolytiques est la production d’aliment nutritif et rentable pour les animaux familiaux. Les kératinases peuvent êtres aussi utilisées dans le traitement de cuir, des films photographiques, des rejets industriels, de la soie et de la protéine prion anormale.

Traitement de cuir et caractéristique de l’effluent de tannerie

Tanner le cuir sans produire d’effluents toxiques a toujours été le problème de cette industrie réputée polluante. Les produits chimiques traditionnellement utilisés pour le tannage sont des dérivés de plantes, tandis que le procédé le plus utilisé de nos jours est le tannage au chrome (Figure 13).
L’utilisation du traitement enzymatique pour le tannage de cuir diminue les coûts et améliore la qualité du produit final qui devient plus résistant à la déchirure et présentant une teinte plus uniforme. Ce procédé biotechnologique, appliqué dans 30 à 50% de la fabrication mondiale, est employé à grande échelle en Australie, en France et au Royaume-Uni [101]. Cette approche présente de nombreux autres avantages, notamment, le contrôle facile et rapide du processus avec réduction des pertes. Les protéases alcalines qui possèdent des activités élastolytiques et kératinolytiques sont très demandées dans ce type d’industrie [46]. Lors de l’étape de chaulage, le dégraissage enzymatique, par les kératinases, est le meilleur procédé recherché puisqu’il permet d’améliorer les propriétés physiques de la peau par l’hydrolyse sélective des constituants non collagèneux de la peau et la transformation des protéines non fibrillaires comme l’albumine et la globuline. De plus, il permet la dégradation des protéines inter fibrillaires au niveau des peaux séchées, ce qui facilite l’adsorption de l’eau et raccourcit l’opération de trempage [105]. Actuellement les protéases utilisées à l’échelle industrielle sont, a titre d’exemples, Korpon EG, Actase P7, Actase P10, Actase P7, Enzymar SE12, Rinod RN, Pyrase et Confit Pancréatique [33].

L’industrie de détergents

Les enzymes protéolytiques dominent le marché des détergents depuis les anciens temps. En fait, environ 89% des enzymes de détergent sont des protéases alcalines. Néanmoins, il ya toujours un besoin de nouveaux enzymes avec des nouvelles propriétés qui peuvent élargir le champ des détergents à base d’enzyme. Parmi ces enzymes, les keratinases microbiennes présente une grande capacité de lier et hydrolyser les substrats solides. C’est une propriété importante des enzymes détergentes car elles ont la capacité d’agir sur des substrats protéiques attachés à des surfaces solides, ce qui les rend attirante pour les additifs de nettoyages. Elles peuvent également contribuer à l’élimination des cols kératiniques qui sont souvent rencontrées, tels que les colliers des chemises, sur lesquels la plupart des protéases n’agissent pas [105, 107, 108].

Traitement des déchets kératiniques

Production de farine de plumes pour alimentation animale

De grandes quantités de déchets de plumes sont produites chaque jour par les industries de la volaille, l’accumulation de ces derniers mène non pas seulement à la pollution de l’environnement mais aussi au gaspillage de ses protéines [109, 110]. En raison de leur nature insoluble, les plumes sont résistants à la dégradation par les protéases microbiennes communes, à savoir : la trypsine, la pepsine et la papaïne. Jusqu’à ces dernières années, les plumes ont été cuites à haute température et à pression très élevée pour se transformer en farine de plumes utilisée comme additif alimentaire pour les animaux. Le traitement hydrothermal, en plus d’être coûteux, a abouti à la destruction de certains acides aminés essentiels, à savoir : la méthionine, la lysine et le tryptophane, ce qui donne un produit de faible digestibilité. En raison des inconvénients multiples du traitement des plumes à haute température, l’utilisation de keratinases microbiennes a augmenté de façon significative, car elles servent d’alternatives intéressantes pour l’hydrolyse des déchets de plumes et la production de farine de plumes très riche sur le plan nutritionnel (riche en cystéine, la valine, thréonine) [109] est relativement peu coûteuse. L’application de keratinases pour l’amélioration de l’alimentation animale a été examinée en détail en 1998 [71]. Ces études ont montré que l’addition de la farine de plumes produite par hydrolyse enzymatique pour le fourrage des animaux, conduit à l’amélioration de la digestibilité et de la croissance [111].

Production de farine de plumes pour engrais

Les farines de plumes riches en protéines générées pour l’alimentation animale peuvent également être appliquées en agriculture biologique comme engrais azoté [105]. L’agriculture biologique repose sur l’utilisation de l’azote organique riche qui sert à améliorer la croissance des plantes et augmenter l’activité microbienne dans le sol. Parmi les engrais azotés traditionnels, le guano qui a été largement utilisé [71]. Toutefois, en raison des dépenses élevées, il est nécessaire de chercher d’autres solutions. La farine de plumes riche en azote (15% N), présente une source peu coûteuse et facilement disponible pour le remplacer, elle fournit non seulement l’azote pour les plantes et favorise l’activité microbienne, mais elle restructure aussi le sol pour augmenter sa capacité de rétention d’eau. La farine de plume obtenue par hydrolyse microbienne présente plus d’avantages que celle obtenue par hydrolyse chimique en raison de sa haute valeur nutritive, sa production facile et sa fiabilité économique.

Le traitement des rejets industriels

L’utilisation de protéases alcalines (kératinase) est introduite aussi dans le traitement des déchets de différentes industries alimentaires et des activités ménagères. En effet, elles solubilisent les déchets protéiques et aident ainsi à baisser la demande biologique en oxygène. Des travaux de recherche réalisés [112] ont rapporté l’utilisation d’une kératinase de B. subtilis pour le traitement des déchets de volailles (plumes) et en 1985 ont décrit la composition d’un produit contenant des enzymes protéolytiques de B. subtilis, B. amyloliquefaciens et Streptomyces sp [113] avec un agent réducteur qui active la dégradation des cheveux et aide dans le nettoyage des conduites bouchées.

Traitement des films photographiques

Les films photographiques sont formés de polyester, comme matière de base, enveloppés par une couche de gélatine et une couche d’argent (1,5 à 2 % par unité de masse). La gélatine, protéine fibreuse formée par des fibrilles de collagène raccourcies par chauffage intense, n’est pas dégradable par la pluspart des protéases. Cependant, cette activité a été observée pour les protéases kératinolytiques. En effet, ces dernières jouent un rôle critique dans la récupération de l’argent qui recouvre les films photographiques. Conventionnellement, cet argent est récupéré par le traitement thermique des films, ce qui est à l’origine de la pollution. Plusieurs protéases ont été utilisées dans ce type d’application, telle que la kératinase alcaline de B. subtilis qui permet la décomposition de la couche de gélatine et la récupération de l’argent à la suite d’une incubation à 50-60°C pendant 30 min [114, 115].

Utilisation des kératinases microbiennes dans l’hydrolyse des amyloïdes

La protéine prion pathogène provoque la transformation de la protéine normale, physiologique et soluble en une forme amyloïde insoluble. Les protéines prions des mammifères présentent un haut degré d’homologie (85 à 97 %). En d’autres termes leur composition est très proche. Les protéines prions pathogènes sont donc capables, après introduction dans un autre organisme, de provoquer la transformation des protéines prions normales endogènes [116] en protéines anormales. La résolution du problème de réduction du caractère pathogène à l’aide de microorganismes a requis l’étude préalable de l’activité de protéases sécrétées sur des substrats modèles. Les kératines sont des bons substrats modèles car elles présentent de nombreuses similarités structurelles avec les amyloïdes infectieux [117]. Les kératines ne peuvent être détruites que par des protéases hautement actives, comme les kératinases sécrétées par les bactéries appartenant au genre Ba cillus ou Streptomyces actives en conditions dénaturantes qui déstabilisent les substrats résistant à la protéolyse [118].

D’autres applications

D’autres applications potentielles de keratinases consistent à :
– Décontaminer les instruments médicaux, de matériel de laboratoire et des éléments interchangeables tels que les lentilles de contact et des outils dentaires [116, 117].
– Effectuer la digestion anaérobique des déchets de volailles pour produire du gaz naturel utilisé comme carburant [119]
– Modifier les fibres de la soie et de la laine [69]
– En médecine et synthèse de produits pharmaceutiques pour éliminer des acnés ou le psoriasis, éliminer les cals humaines pour la préparation des vaccins contre les dermatophytoses et des additifs dans des agents d’éclairage de la peau car ils stimulent la dégradation de la kératine.
– Récupérer l’argent à partir de traitement des films radiographiques par des kératinases.

Importance des Actinomycètes dans la production des kératinases

Les Actinomycètes représentent un groupe important de microorganismes producteurs de kératinases. Ces bactéries jouent un rôle important dans la décomposition, la minéralisation et l’hydrolyse de la kératine des plumes, des cheveux, de la laine et d’autres déchets kératiniques [47]. Les Actinomycètes thermophiles ont certains avantages par rapport aux souches mésophiles dans l’accumulation accélérée de la biomasse et la production d’enzymes thermostables capables de briser de nombreux composés organiques, grâce à leur capacité de catalyse à haute température et leurs grandes stabilités [89]. Plusieurs espèces d’Actinomycètes sont capables de croitre et d’utiliser les substrats kératiniques comme seule source de carbone et d’azote. En effet, en 2005, des travaux de recherche ont isolé une souche du genre Thermoactinomyces [90] et l’ont utilisée pour la biodégradation des déchets de kératine qui pourraient être appliqués dans l’industrie d’agriculture pour préparer des mélanges contenant des peptides et des acides aminés. Une autre bactérie de ce genre Thermoactinomyces candidus a pu être induite par la présence dans le milieu de culture de laine de mouton comme seule source de carbone et d’azote [120].

Les caractéristiques principales des Actinomycètes

Les Actinomycètes sont des bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies circulaires, constituées de filament qui irradient par croissance et centrifuge tout autour du germe qui leur a donné naissance [121]. Cela explique leur dénomination «Actinomycètes», du grec aktino : rayons et mycetes : champignons, ou champignons rayonnant [122]. Les bactériologistes considèrent les Actinomycètes comme des bactéries tandis que les mycologistes, les considèrent comme des champignons [123]. Aujourd’hui, ce problème est résolu et ce groupe de micro organismes est définitivement classé parmi les bactéries. Leurs propriétés chimiques, physiologiques et immunologiques les rangent parmi les procaryotes, leur paroi cellulaire ne renferme ni chitine ni cellulose mais une glycoprotéine contenant la lysine ou de l’acide diaminopimélique et leur cytologie est celle des bactéries. Ces caractères confirment leur classification parmi les bactéries. Il s’agit d’un groupe supragénérique, rassemblant des bactéries très diverses dispersées dans la systématique, ou les genres Nocardia, Actinomyces, Mycobacterium, Corynebacterium, Streptomyces, Actinomadura et Bifidobacterium ont des caractéristiques très rapprochées. Les Actinomycètes sont des bactéries à coloration de Gram positive dont le coefficient de Chargaff (G+C%) est supérieur à 55%, généralement compris entre 60 à 75%. Elles tendent à croitre lentement comme des filaments ramifiés (0.5 à 1 µm de diamètre). Sur des milieux solides, les Actinomycètes forment, en une semaine environ, des colonies souvent pigmentées provenant de l’accumulation des filaments ramifiés à contour lisse u échancré à aspect compact, poudreux ou en chou-fleur.
En général, les Actinomycètes sont des hétérotrophes, mais plusieurs espèces sont capables d’êtres chimio-autotrophes. Certaines ont des exigences nutritionnelles tels que les vitamines et certains acides aminés. Ils colonisent fréquemment les substrats insolubles tels que le charbon par pénétration mécanique de la matrice et peuvent dégrader les protéines insolubles comme les kératines et les hémicelluloses, comme la cellulose et le xylane [124].
Les Actinomycètes préfèrent un pH neutre ou peu alcalin, elles sont généralement mésophiles, d’autres sont thermophiles tolérant des températures avoisinant 50°C et peuvent aller jusqu’à 60°C [125, 126].

Ecologie et distribution des Actinomycètes dans la nature

Les Actinomycètes sont très répandus dans la nature. Ils constituent une part de la microflore tellurique. On les trouve dans l’air, les débris végétaux, les litières, les sols, et les régions industrielles polluées par du pétrole ou des métaux lourds [127] (Tableau 6). Leur proportion par rapport aux autres micro-organismes oscilles entre 10 et 50%, les genres Streptomyces, Nocardia et Micromonospora sont les plus fréquents mais le genre Streptomyces couvre à lui seul 95% des souches d’Actinomycetes isolées. [128].
Les Actinomycètes sont aussi retrouvés dans les milieux aquatiques, dans les lacs, les rivières et les ruisseaux, dans les mères et les océans et même dans des sédiments océaniques situés à plus de 4000m de profondeur. Dans les sols sahariens, les Actinomycètes constituent 15 à 60% de la microflore totale et parfois même jusqu’à 85%. Ces pourcentage augmente jusqu’à 91% dans les parties situées entre 1 et 2 m de profondeur avec une prédominance des Streptomycètes [126]. D’une autre part le compost est considéré comme un réservoir très important d’Actinomycètes. En raison de sa composition riche en substrats organiques et surtout les composants carboniques, les microorganismes mésophiles entre autre les Actinomycètes produit de la chaleur selon la réaction suivante:

Table des matières

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1 Les protéases kératinolytiques
1.1. Les protéases
1.1.1. Classification des protéases
1.1.1.1. Selon la localisation cellulaire
1.1.1.2. Selon la nature de leur site catalytique
1.1.1.3. Selon leur besoin en ATP
1.1.2. Marché mondial et origine des protéases
1.1.3. Application des protéases en biotechnologie
1.2. Les kératinases
1.2.1. Définition et mode d’action des kératinases
1.2.2. Origine des kératinases
1.2.3. Physiologie de la production des kératinases
1.2.4. Propriété physicochimiques des kératinases
1.3. Les substrats kératiniques
1.3.1. Structure des kératines
1.3.2. Classification des kératines
1.3.3. Source des kératines
1.3.4. Valorisation de déchets de plumes
1.4. Applications des protéases kératinolytiques en biotechnologie
1.4.1. Traitement de cuir et caractéristique de l’effluent de tannerie
1.4.2. Industrie de détergents
1.4.3. Traitement des déchets kératiniques
1.4.3.1. Production de farine de plumes pour alimentation animale
1.4.3.2. Production de farine de plumes comme engrais
1.4.4. Traitement des rejets industriels
1.4.5. Traitement des films photographiques
1.4.7. Autres applications
Chapitre 2 Importance des Actinomycètes dans la production des kératinases
2.1. Les caractéristiques principales des Actinomycètes
2.2. Ecologie et distribution des Actinomycètes dans la nature
2.3. Taxonomie des Actinomycètes
2.3.1. Evolution de la taxonomie des Actinomycètes
2.3.2. Classification des Actinomycètes
2.4. Les caractéristiques biologiques des Actinomycètes
2.5. Production des kératinases par des souches du genre Actinomadura
Partie expérimentale
Chapitre 1 Recherche et identification d’une souche d’Actinomycètes thermophile productrice de kératinases isolée à partir du compost de poulet
1.1. Echantillonnage et isolement taxonomique
1.2. Détection de l’activité protéolytique et kératinolytique chez la souche Cpt29 sur milieu solide (Test semi- quantitatif)
1.3. Identification moléculaire (ARNr 16S) et analyse phylogénétique de la souche Cpt29
1.3.1. Extraction de l’ADN génomique (ADNg) à partir de la souche d’Actinomycète Cpt29
1.3.2. Analyse de l’ADNg par électrophorèse sur gel d’agarose
1.3.3. Dosage de l’ADN
1.3.4. Amplification génique de l’ADN par technique PCR
1.3.5. Préparation d’ADN plasmidique (ADNp)
1.3.6. Clonage du fragment d’ADN (pour gène de l’ARNr 16S) chez E Coli
1.3.7. Séquençage automatique de l’ADNp contenant le fragment
1.3.8. Identification par alignement et analyse phylogénétique des séquences nucléotidiques avec les banques de données
Chapitre 2 Optimisation des conditions de culture pour la production des kératinases par la souche d’Actinomycète Cpt29
2.1. Différentes méthodes de dosage utilisées dans l’optimisation des conditions de culture
2.1.1. Dosage de l’activité protéolytique
2.1.2. Dosage de l’activité kératinolytique
2.1.3. Dosage des protéines
2.2. Optimisation des conditions de culture pour de la production de kératinases par la souche CPt29
2.2.1. Temps optimum d’incubation
2.2.2. pH optimum de culture
2.2.3. Température optimal d’incubation
2.2.4. Effet des différents substrats kératiniques sur la production de kératinases
2.2.5. Effet des différentes sources de carbone sur la production de kératinases
2.2.6. Effet des différentes sources d’azote sur la production de kératinases
2.2.7. Effet des différentes sources de phosphore sur la production de kératinases
Chapitre 3 Purification et caractérisation de la kératinase produite par la souche Cpt29 isolée et identifiée
3.1. Préparation de l’extrait enzymatique à partir de la souche Cpt29
3.1.1. Précipitation fractionnée au sulfate d’ammonium
3.1.2. Traitement thermique
3.2. Chromatographie d’exclusion-diffusion sur Sephacryl S-200
3.3. Analyse de la pureté par électrophorèse en conditions dénaturante (PAGE-SDS) 52
3.3.1. Analyse de l’enzyme étudiée par zymogramme
3.4. Caractérisation biochimique et physicochimique de la kératinase purifiée
3.4.1. Effet du pH sur l’activité et la stabilité de l’enzyme
3.4.2. Effet de la température sur l’activité et sur la stabilité de l’enzyme
3.4.3. Effet des ions métalliques sur l’activité enzymatique
3.4.4. Effet des inhibiteurs sur l’enzyme
3.4.5. Effet des tensioactifs sur l’activité et la stabilité de la kératinase étudiée
3.5. Détermination de l’extrémité NH2-terminale de la kératinase étudiée (MALDI-TOF)
3.7. Mise en évidence de la dégradation des plumes par l’enzyme purifiée
RESULTATS ET DISCUTIONS
Chapitre 1 Identification et classification d’une nouvelle souche d’Actinomycète thermophile Cpt29
1.1. Taxonomie phénotypiques
1.2. Mise en évidence de l’activité protéolytique de la souche Cpt29 sur milieu solide
1.3. Mise en évidence de l’activité kératinolytique de la souche Cpt29 sur milieu solide
1.4. Identification moléculaire de la souche Cpt29
1.4.1. Analyse phylogénétique
Conclusion
Chapitre 2 Optimisation des conditions de culture pour la production des kératinases par la souche Actinomadura sp Cpt29
2.1. Production de protéases kératinolytiques par la souche A keratinilytica Cpt29 sur milieuliquide
2.2. Recherche des conditions optimales de culture pour la production de kératinases
2.2.1. Le temps optimum d’incubation
2.2.2. Le pH optimum de culture
2.2.3. La température optimale de culture
2.2.4. Effet des différents substrats kératiniques sur la production de kératinases par la souche A keratinilytica Cpt29
2.2.5. Effet de l’addition de différentes sources de carbone sur la production de kératinases par la souche Cpt29
2.2.6. Effet de l’addition de différentes sources d’azote sur la production de kératinases par la souche Cpt29
2.2.7. Effet des différentes sources de phosphore sur la production de kératinases par la souche Cpt29
Conclusion
Purification et caractérisation de l’enzyme KERAK-29
3.1. Purification
3.2. Caractérisation de la kératinase «KERAK-29» purifiée
3.2.1. Contrôle de la pureté de l’enzyme par PAGE-SDS et de l’activité enzymatique par zymogramme
3.2.2. Détermination de la taille de la KERAK-29 par méthode (MALDI-TOF/MS)
3.2.3. Séquençage de l’extrémité NH2-terminale de la KERAK-29
3.2.4. Effet du pH sur l’activité et la stabilité de la KERAK-29
3.2.5. Effet de la température sur l’activité de la KERAK-29
3.2.6. Effet des ions bivalents sur l’activité et la thermostabilité de la KERAK-29
3.2.7. Effet des inhibiteurs et des agents réducteurs sur l’activité de la KERAK-29
3.2.8. Effet de certains additifs de détergents sur l’activité et la stabilité de la KERAK29
3.3. Dégradation des plumes de poulet par la KERAK-29
Conclusion
Conclusion générale
Annexes
Annexe 1
Annexe 2
Références bibliographiques

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