Importance de la symbiose Rhizobia-légumineuses

Importance de la symbiose Rhizobia-légumineuses

La symbiose Rhizobia-légumineuses

La symbiose fixatrice d’azote est un processus complexe déterminé par deux partenaires, cette association est à bénéfice réciproque entre la légumineuse et les bactéries du sol appelées rhizobia. L’un des systèmes les plus étudiés est celui associant les bactéries rhizobiales avec les légumineuses (Patriarca et al., 2004 ; Gage, 2004; Stacey et al., 2006), car la plus grande partie des légumineuses (88 % des espèces étudiées) interagissent avec les bactéries du genre Rhizobium pour former des nodules fixateurs d’azote (de Faria et al., 1989). La biogéographie explique la distribution actuelle des organismes vivants, de point de vue de facteurs historiques et écologique, surtout concernant les légumineuses à large distribution (Doyle et Luckow, 2003). Les familles des légumineuses fixatrices d’azote ne semblent pas partager un ancêtre commun, le phénomène de nodulation est certainement apparu tout à fait indépendamment parmi et même à l’intérieur de certaines familles (Duhoux et Nicole, 2004). 1.1.1. Etablissement de la symbiose fixatrice de l’azote Le nodule est le résultat de l’infection des racines des légumineuses par les bactéries de la famille des Rhizobiacées. Par ce dernier, la plante-hôte offre un micro habitat exceptionnellement favorable à la bactérie tout en lui procurant des substrats carbonés provenant de la photosynthèse (Duhoux et Nicole, 2004). Le processus de la fixation, lui-même, consiste en une réduction de l’azote atmosphérique N2 sous forme ammoniacale (Figure 1). Cette réaction est catalysée par un complexe enzymatique appelé Nitrogénase (Downie, 2005).

Les étapes de la nodulation

Le site de fixation symbiotique est le nodule ; le seul organe localisé sur la racine qui présente un intérêt important pour le fonctionnement, la survie des bactéries et l’activité de la Nitrogénase (Martinez-Romero et al., 2010). La formation des nodules (Figure 2) est le résultat d’un dialogue moléculaire entre le microsymbiote et la plante-hôte (Foucher et Kondorosi, 2000; Limpens et Bisseling, 2003). L’interaction commence avec la colonisation de jeunes poils absorbants par les rhizobia et un échange d’un signale moléculaire. De leurs côtés, les bactéries reconnaissent des flavonoïdes qui sont sécrétées par la plante- hôte, ces molécules induisent la production de facteurs NOD par les rhizobia qui agissent essentiellement sur deux types de cellules au niveau de la racine (cellules épidermiques et cellules corticales) (Oldroyd, 2001). Au niveau des cellules épidermiques et grâce à une communication cellulaire par les flavonoïdes ou les bétaines (Gage, 2004), les facteurs NOD qui sont exprimés par les gènes nod (les gènes les plus étudiés), induisent une dépolarisation de la membrane plasmique, une induction de l’expression de gènes spécifiques et une modification de la croissance polaire des poils absorbants formant une structure dite en «crosse de berger» qui enferme les rhizobia (Esseling et al., 2003). Donc la structure spécifique des facteurs NOD produits par chaque espèce de rhizobbium, sert comme signal permettent la reconnaissance de la présence de la bactérie par sa plante hôte. A partir de cette niche, les rhizobia pénètrent la cellule végétale par la formation d’un cordon d’infection qui traverse d’abord le poil absorbant et se ramifie ensuite dans les cellules corticales guidant ainsi les bactéries vers les couches cellulaires intérieures (Gage, 2004). Simultanément à l’infection des poils absorbants, certaines cellules du cortex interne se différencient et se divisent à plusieurs reprises, formant un primordium nodulaire. Elles sont alors envahies par des rhizobia qui sont relâchés dans des cordons d’infection (Cermola et al., 2000 ; Brewin, 2004). Finalement, les cellules végétales infectées et les bactéries infectantes se différencient en cellules capables de fixer et d’assimiler l’azote. La structure nouvellement formée, qui est composée des bactéries différenciées en bactéroïdes enfermées dans une membrane de cellules de la plante, s’appelle un symbiosome (Emerich et Krishnan, 2014) Selon Masson-Boivin et al. (2009), dans l’interaction entre la plante- hôte et le rhizobium, les composés phénoliques (flavonoïdes, chémo- attracteurs) exsudés par la plante- hôte entraînent chez la bactérie la production de lipo-oligosaccharides spécifiques dénommés les facteurs Nod. Ce sont des signaux moléculaires qui déclenchent la division des cellules corticales de la racine conduisant à la formation d’un nouvel organe différencié chez la plante, le nodule ou nodosité. Il existe deux types de nodules : des nodules déterminés et des nodules indéterminés. Les nodules déterminés sont issus de l’auxèse des cellules du méristème apical qui cesse son activité à maturation de la nodosité. Les nodules indéterminés sont issus de mérèses du méristème apical persistant qui leur confère une croissance longitudinale. Le nodule du haricot est de type déterminé (Amarger et al., 1997). 1.1.3 Spécificité symbiotique L’une des caractéristiques majeures des associations rhizobium-légumineuses est leur spécificité d’hôte. En effet, une espèce de rhizobium donnée n’est capable, en général, d’établir une relation symbiotique efficace qu’avec un nombre limité de partenaires végétaux (Halbleib et Ludden, 2000). De même une espèce de légumineuse ne peut être nodulée que par un certain nombre d’espèces de rhizobium (Tilak et al., 2005). 1. Etude bibliographique 9 Cette spécificité est basée sur une communication moléculaire, c’est-à-dire un échange de signaux des partenaires symbiotiques (Masson-Boivin et al., 2009).

Table des matières

Introduction
1. Introduction
2. Situation actuelle
3. Les objectifs de la thèse
1. Etude bibliographique
1.1. La symbiose Rhizobia- légumineuses
1.1.1 Etablissement de la symbiose fixatrice de l’azote
1.1.2. Les étapes de la nodulation
1.1.3. Spécificité symbiotique
1.1.4. Importance de la symbiose Rhizobia-légumineuses
1.1.5. Le métabolisme de la fixation d’azote
1.1.6. Performances symbiotiques
1.1.7. Rôle de la rhizosphère dans la fixation symbiotique de l’azote
1.2. Les légumineuses
1.2.1. Principaux pays producteurs du haricot dans le monde
1.2.2. Consommation des légumineuses à graines dans le monde
1.2.3. Les légumineuses alimentaires en Algérie
1.2.3.1. Importance des légumineuses alimentaires en Algérie
1.2.3.2. Le haricot
1.2.3.2.1. Description morphologique et botanique
1.2.3.2.2. Classification et variétés
1.2.3.2.3. Organismes de recherche pour la culture du haricot
1.2.3.2.4. Culture du haricot en Algérie
1.2.3.2.5. La culture du haricot en plein champ
1.2.3.2.5.1. Les exigences du milieu
1.2.3.2.5.2. Condition de culture du haricot
1.2.3.2.5.3. Facteurs de l’environnement
1.2.3.2.5.4. Effet de la pluviométrie sur la croissance
1.3. Aspect biotechnologique de la fixation d’azote
1.3.1. Importance de l’azote et du phosphore pour Phaseolus vulgaris
1.3.2. Nutrition azotée chez le haricot
1.3.3. Potentiel fixateur d’azote du haricot
1.3.4. Effet du phosphore et du potassium sur la symbiose
1.3.5. Effet du stress salin sur la symbiose
1.3.6. Efficacité d’utilisation du phosphore pour la FSN
1.4. Les bactéries nodulant les légumineuses BNL
1.4.1. Principales caractéristiques
1.4.2. Evolution taxonomique des rhizobiums
1.4.3. Diversité des BNL nodulant Phaseolus vulgaris
1.4.4. Mode d’infection chez Phaseolus vulgaris
1.4.5. Gènes symbiotiques et phylogénie
1.4.6. Méthodes appliquées à l’étude de la diversité des BNL
1.4.6.1. Méthodes phénotypiques
1.4.6.2. Méthodes génotypiques
1.4.6.2.1 L’amplification in vitro de l’ADN
1.4.6.2.1.1. Principe de la PCR
1.4.6.2.1.2. Technique de la RFLP
1.4.6.2.2. Collection génomique
1.4.7. Conservation du matériel biologique
2. Matériel et méthodes
2.1. Etats des lieux, prospections et choix de l’agroécosystème
2.2. Echantillonnage
2.3. Analyses physico-chimiques des sols
2.3.1. Analyses granulométriques
2.3.2. Mesure du pH
2.3.3. Détermination de la conductivité électrique
2.3.4. Dosage du calcaire total
2.3.5. Dosage du calcaire actif
2.3.6. Dosage du phosphore assimilable
2.3.7. Dosage du carbone total et de la matière organique
2.3.8. Dosage de l’azote
2.4. Collecte des nodules in natura
2.5. Piégeage des rhizobia
2.5.1. Préparation des graines
2.5.2. Culture en pots
2.5.3. Prélèvement des plantes
2.5.4. Conservation des nodules
2.6. Isolement des bactéries à partir des nodules
2.6.1. Stérilisation des nodules
2.6.2. Isolement des bactéries
2.7. Purification des isolats
2.8. Détermination de quelques caractéristiques des isolats
2.8.1. Etude macroscopique
2.8.2. Etude microscopique
2.8.3. Caractéristiques distinctives des BNL
2.8.4. Absorption du rouge Congo
2.8.5. Vitesse de croissance
2.8.6. Test mannitol- mobilité
2.9. Mise en collection
2.9.1. Vérification de la pureté des souches
2.9.2. Conservation des isolats purs
2.10. Etude physiologique
2.10.1 Croissance en milieu YEM liquide
2.10.2. Effet de la température
2.10.3 Croissance à différents pH
2.10.4. Métabolisme glucidique
2.10.5. Effets des différents antibiotiques
2.10.6. Solubilisation du phosphate
2.11. Test de nodulation
2.11.1. Préparation des graines
2.11.2. Préparation des suspensions bactériennes
2.11.3. Mise en place des plantules et inoculation
2.11.4. Estimation de la croissance des plantes
2.11.4.1. Phénotype des plantes
2.11.4.2. Partie aérienne
2.11.4.3. Partie racinaire
2.11.4.4. Analyse statistique
2.12. Etude génotypique
2.12.1. Aseptisation des nodules
2.12.2. Extraction et purification des l’ADN nodulaire
2.12.2.1. Extraction de l’ADN de nodules avec GES
2.12.2.2. Contrôle de l’ADN total extrait
2.12.3. Amplification de l’ADN
2.12.3.1. Amplification de l’ADN par PCR
2.12.3.2. Amplification de l’espace intergénique IGS
2.12.3.3. Contrôle du succès des amplifications
2.12.4. Analyse des fragments de restriction de l’ADN amplifié
2.12.4.1. Digestion enzymatique
2.12.4.2. Analyse des profils RFLP
2.13. Essais aux champs
2.13.1. Principe et objectif de l’expérimentation.
2.13.2. Description des sites expérimentaux
2.13.3 Dénombrement des populations natives
2.13.4. Cultivars testés
2.13.5. Protocole d’essai
2.13.6. Mise en place des essais
2.13.7. Observation et notation
2.13.8. Récolte des plantes et paramètres mesurés
2.13.9. Conservation des nodules
2.13.10. Analyses statistiques
2.14. Estimation du rendement
3. Résultats et discussion
Partie 1 : Diversité des BNL associées à Phaseolus vulgaris dans l’Ouest Algérien
3.1. Résultats des analyses physico-chimiques des sols
3.1.1 La granulométrie75
3.1.2. L’analyse chimique
3.2. Piégeage des rhizobia
3.2.1. Germination des graines
3.2.2. Paramètres de croissance
3.3. Distribution des isolats
3.4. Test de nodulation
3.4.1. Infectivité des souches isolées
3.4.2. Performances symbiotiques
3.5. Eude des isolats
3.5.1. Caractéristiques macroscopique
3.5.2. Absorption du rouge Congo
3.5.3. Vitesse de croissance
3.5.4. Caractéristiques microscopiques
3.5.5. Estimation de la croissance en milieu YEM liquide
3.5.6. Effet de la salinité
3.5.7. Effet de la température
3.5.8. Tolérance aux pHs
3.5.9. Résistance intrinsèque aux antibiotiques
3.5.10. Solubilisation du phosphate
3.5.11. Métabolisme glucidique
3.5.12. Analyse numérique
3.6. Caractérisation génotypiques des isolats
3.6.1. Amplification de l’ADN
3.6.2. Profils de restriction de la région IGS 16S-23S de l’ADNr
3.6.3. Analyse numérique
3.7. Conclusion partielle
Partie 2 : Etude du comportement des variétés de Phaseolus vulgaris aux champs
3.1. Dénombrement des populations natives de chaque échantillon de sol
3.2. Mise en place des essais
3.3. Données climatiques des stations expérimentales
3.4. Observation et notation
3.5. Estimation de la nodulation
3.6. Rendement à la récolte
3.7. Conclusion partielle
4. Conclusion générale et perspectives
4. Conclusion générale et perspectives
5. Références bibliographiques
5. Références bibliographiques
6. Annexes…

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