Implications des P450s dans les évènements biologiques

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Les cytochromes P450

Historique

Dès 1955, Axelrod [4] et Brodie et al. [12] identifient un système enzymatique, dans le réticulum endoplasmique des hépatocytes, capable d’oxyder les xénobiotiques. Mais ce n’est qu’en 1958 que Garfinkel et Klingenberg [40, 67] détectent un pigment liant le monoxyde de carbone dans des microsomes hépatiques de rat et de porc. Ils remarquent alors que le complexe monoxyde de carbone-enzyme réduite (le fer est sous la forme ferreux) présente un maximum d’absorption à 450 nm. Il fut démontré plus tard qu’il s’agit d’une hémoprotéine, identifiée comme un nouveau membre des cytochromes de type b [102, 103]. Cette hémoprotéine sera alors appelée cytochrome P450. La première voie métabolique étudiée impliquant le P450 fut l’hydroxylation des stéroïdes au niveau des glandes corticosurrénales [16, 32]. Ce rôle d’oxydase fut confirmé dans le système microsomal hépatique, au niveau du réticulum endoplasmique [25].
Depuis la découverte des P450s, le nombre de publications concernant ce sujet ne cesse d’augmenter. Entre 1990 et 2000, 21000 articles ont été publiés dans la base de données PubMed [111] (1500 en 1990 jusqu’à 2500 en 2000) contre seulement 11000 entre 1980 et 1990, et 4500 entre 1970 et 1980. En 2006, on comptait 3400 articles et ce nombre devrait encore augmenter dans les années à venir.

Classification et nomenclature

Les P450s dériveraient d’un gène ancestral commun datant de 3,5 milliards d’années et les premiers P450s seraient issus des bactéries, des levures et des plantes [46].
En 1995, Nelson et al. [99] répertoriaient 481 gènes codant pour les P450s et 22 pseudogènes. Ces gènes ont été décrits chez 85 eucaryotes (incluant les vertébrés, les invertébrés, les champignons et les plantes) et 20 procaryotes. De nombreux autres P450s ont été isolés depuis. On dénombre ainsi pour le moment 708 familles et 814 sous-familles, et 125 allèles, correspondant à 3043 séquences différentes [98].
A l’heure actuelle, on dénombre 18 familles de P450s humains et 43 sous-familles.
Cinquante-sept gènes codant pour les P450s humains et 58 pseudogènes ont été séquencés. Ces enzymes sont classées selon une méthode basée sur les homologies de séquences en acides aminés [96]. Ainsi, deux P450s appartiennent à la même famille lorsque leur séquence en acides aminés présente une homologie de plus de 40% (par exemple la famille 3). Les séquences avec plus de 55% d’homologies appartiennent à la même sous-famille (par exemple la sous-famille A) [97].
Les P450s sont abrégés ainsi : CYP pour cytochrome P450, un nombre pour la famille, une lettre majuscule pour la sous-famille puis un nombre pour l’isoforme. Par exemple, CYP3A4 est le 4ème isoforme du cytochrome P450 appartenant à la famille 3 et à la sous-famille A.

Répartition

Les P450s [73] sont présents chez de nombreuses espèces : les mammifères, les oiseaux, les poissons, les reptiles, les insectes, les mollusques, les arthropodes, les crustacées, les champignons, les plantes, les bactéries. Chez les mammifères, ces enzymes sont présentes dans de nombreux tissus : foie, rein, peau, épithélium nasal, gonades, placenta, cerveau, poumon, rate, pancréas, tractus gastro-intestinal. Les P450s sont en revanche absents des muscles, des os et des globules rouges, mais néanmoins présents au niveau de l’endothélium vasculaire et des globules blancs.
Dans le foie, les P450s se trouvent dans les hépatocytes dans la membrane du réticulum endoplasmique lisse. Entre 12 et 15% des protéines du réticulum endoplasmique sont composées de P450s. Les P450s représentent 1 à 2% du poids d’un hépatocyte. Les P450s les plus abondants dans le foie sont ceux de la famille 3A, 2C et 1A (Figure 10). Ces P450s sont donc en particulier impliqués dans la métabolisation des molécules exogènes absorbées per os, et sont donc indispensables à considérer lors des études de toxicologie et de pharmacologie. En effet, le foie est le premier organe responsable de forte métabolisation rencontré par les médicaments (par l’intermédiaire du système porte après passage au niveau de l’intestin), ce qui a pour conséquence un effet de premier passage hépatique pouvant diminuer fortement la biodisponibilité des médicaments administrés per os. Nous étudierons en particulier les P450s de la famille 3A, puisque ceux-ci métabolisent environ 60% des médicaments actuellement sur le marché. Quelques exemples de substrats des P450s sont présentés dans le tableau V et des exemples de substrats du CYP3A4 en particulier sont indiqués dans le tableau VI.
Chez les mammifères, il existe une autre classe de P450s : les P450s mitochondriaux. Ils sont intégrés dans les membranes internes des mitochondries. Les plus connus sont ceux du cortex des glandes surrénales. Ils interviennent dans la biosynthèse des hormones stéroïdes, mais semblent également avoir un rôle dans le métabolisme des xénobiotiques [2].

Cycle catalytique

Le rôle physiologique principal des enzymes de la superfamille P450 est la mono-oxygénation. La réaction catalysée peut être résumée ainsi : RH + O2 + 2H+ + 2e- ROH + H2O
RH étant le substrat et ROH le métabolite formé.
La réaction médiée par le P450 implique en effet la combinaison d’une molécule de dioxygène avec un substrat organique RH pour produire une molécule d’eau et un métabolite mono-oxygéné. Les 2 équivalents réduits sont apportés par le NADPH ou le NADH, en fonction du type de P450 [73].
A l’état « normal », l’enzyme est ferrique dans un état de bas spin. La fixation du substrat entraîne un changement de spin vers le haut spin. Le potentiel redox est alors suffisamment bas pour que l’enzyme puisse être réduite par un électron. Le fer devenu ferreux peut alors fixer l’oxygène moléculaire. Le complexe oxygéné formé, en équilibre entre deux formes isoélectroniques, peut alors être réduit par un deuxième électron. C’est cette réaction qui initie l’étape catalytique et l’activation de l’oxygène. S’en suit un apport de deux protons avec libération d’une molécule d’eau, puis la libération du produit métabolisé par le P450 (Figure 12).

Implications des P450s dans les évènements biologiques

Les P450s sont impliqués dans le métabolisme oxydatif, peroxydatif et réducteur de substrats endogènes comme les stéroïdes, les prostaglandines et les acides gras, mais aussi exogènes tels les polluants de l’environnement, les médicaments, les carcinogènes [22, 50].

Métabolisme des xénobiotiques

Plus de 200000 molécules chimiques peuvent être métabolisées par les P450s humains, catalysant plusieurs types de réactions différentes dont les oxydations, réductions, déshalogénations [73], désaturations, clivages d’esters, déshydratations… [48]
Chez les mammifères et les autres espèces animales, les P450s des familles CYP1, CYP2 et CYP3 catalysent les réactions de phase I du métabolisme de la majorité des composés exogènes auxquels est exposé l’organisme. Le foie est le principal organe où se trouvent ces enzymes chez les mammifères, même si une activité métabolique a déjà été décrite dans d’autres organes et tissus (intestin, sein, poumon, prostate, cerveau…).
Les P450s catalysent un très grand nombre de biotransformations, qui se différencient principalement par l’activité biologique éventuelle du métabolite obtenu [48]. Dans la plupart des cas, ce dernier n’a pas d’activité. Le substrat subit en effet une étape de fonctionnalisation, ce qui permettra aux enzymes de conjugaison de phase II d’augmenter l’hydrophilie du composé et de faciliter ainsi son élimination urinaire ou fécale. Il peut cependant arriver que le métabolite formé par action d’un P450 présente une activité biologique. Ainsi, le produit obtenu à la suite du métabolisme d’un composé par un P450 peut être toxique pour l’organisme, par activation de procarcinogènes ou formation de radicaux libres [45]. Les métabolites formés sont de nature électrophile et vont réagir avec des structures nucléophiles de l’organisme pour conduire à des réactions néfastes, réactions avec des protéines ou des lipides à l’origine de nécrose, ou avec des acides nucléiques à l’origine de mutations voire de cancers. Dans le tableau III sont présentés quelques exemples de réactions induites par les P450s pouvant générer la formation de métabolites toxiques.
Un autre aspect de la toxicité causée par les P450s est l’apparition d’effets indésirables lors d’interactions médicamenteuses. Par exemple, des torsades de pointes peuvent apparaître lorsque des inhibiteurs du CYP3A4 sont administrés avec le cisapride. De même, des rhabdomyolyses ont été associées à la coadministration de statines et d’inhibiteurs du CYP3A4 [29].
Les P450s sont donc impliqués dans des phénomènes de toxicité, mais la formation d’un métabolite présentant une activité biologique peut également être bénéfique dans le cas de l’activation d’une prodrogue en molécule active avec des propriétés thérapeutiques. C’est le cas par exemple de l’ifosfamide et du cyclophosphamide, des cytotoxiques alkylants faisant partie de la classe des moutardes à l’azote [115].
Les P450s ont également un rôle au niveau de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie des xénobiotiques et donc au niveau de leur impact clinique. La métabolisation par le P450 a en effet une influence sur la durée de vie du composé actif dans l’organisme et donc sur son activité thérapeutique. En effet, un composé métabolisé rapidement par le P450 en un métabolite inactif n’aura que peu de temps pour exercer son action au niveau de la cible thérapeutique puisque sa demi-vie sera considérablement diminuée. Par exemple, les dérivés de l’ergot de seigle ont un temps de demi-vie d’élimination très court. Ce sont les métabolites produits par action du CYP3A, possédant un temps de demi-vie plus long, qui sont actifs et responsables de l’activité sur plusieurs heures, notamment dans le traitement des migraines et des hypotensions orthostatiques.
De plus, des interactions médicamenteuses peuvent être bénéfiques voire recherchées. Certains inhibiteurs de protéases utilisés dans le traitement du VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine), comme le saquinavir ou l’indinavir, ont une faible biodisponibilité par voie orale qui est améliorée par l’administration concomitante de ritonavir. En effet, le ritonavir forme un complexe avec le fer du CYP3A qui est ainsi bloqué. L’inhibiteur de protéases, qui est donc beaucoup moins métabolisé, peut alors exercer son action thérapeutique [37]. De même, l’administration d’un inhibiteur du CYP3A4 avec la ciclosporine permet de réduire les doses et par conséquent le coût de l’immunosuppresseur [29].
Un paramètre important à considérer concernant l’action des P450s, et plus généralement en toxicologie, est la dose. Prenons l’exemple de la ciclosporine, médicament utilisé contre le rejet de greffe et dans le traitement de certaines maladies auto-immunes. Elle est métabolisée par le CYP3A4 en plusieurs métabolites oxygénés dont certains possèdent une activité pharmacologique. L’administration de cette molécule à faibles doses permet d’obtenir un effet thérapeutique immunosuppresseur. A forte dose, la ciclosporine devient néphrotoxique de façon dose-dépendante. De fortes concentrations peuvent être obtenues par exemple après une consommation excessive de jus de pamplemousse, inhibiteur du CYP3A4 [30].
Les P450s métabolisent des substrats de structure et taille très variées. Les différentes isoformes des CYP3A peuvent par exemple métaboliser un nombre important de substrats (plus de 300), de masse moléculaire très variée : de 190 Daltons pour la N-hydroxy-Arginine à 1200 Daltons pour la ciclosporine.

Métabolisme des substances endogènes

Chez les espèces animales, et les mammifères en particulier, les fonctions endogènes principales des P450s incluent la biosynthèse des stéroïdes, le métabolisme des prostaglandines et des acides gras, l’oxydation lipidique et l’hydrolyse de la vitamine D3. D’autres rôles endogènes ont été suggérés, notamment pour les P450s impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques. Ainsi, le CYP1A1 a un rôle dans le catabolisme de l’hème, le CYP1A2 dans le métabolisme de l’estradiol, les CYP2A, 2B, 2C et 3A dans le métabolisme de la testostérone, le CYP2D dans le métabolisme des catécholamines et le CYP2E dans la néoglucogenèse [73].
Les P450s responsables de la biosynthèse des stéroïdes par exemple présentent une spécificité d’expression tissulaire et subcellulaire. Les P450s présents dans les mitochondries des glandes surrénales (CYP11) conduiront à la formation de pregnénolone, progestérone, corticostérone et aldostérone à partir du cholestérol. Ceux présents dans le réticulum endoplasmique des hépatocytes (CYP17, 21 et 19) aboutiront à l’androstènedione et la testostérone, et l’activité aromatase du CYP19, également présent dans le placenta et les gonades, formera les œstrogènes [73].
Ces voies métaboliques sont très importantes puisqu’un déficit en certains des P450s impliqués dans ces activités peut engendrer des maladies très graves. Ainsi, un défaut d’expression du CYP21, causé par une mutation du gène codant pour la 21-hydroxylase, conduit à une hyperplasie congénitale des surrénales, maladie génétique rare pouvant entraîner des accidents graves de déshydratation et des anomalies de la croissance [135].

Modèles d’études des P450s

Les différents modèles d’études des fonctions hépatiques sont représentés dans le tableau VII. Il existe de nombreux systèmes d’études, chacun ayant une utilité spécifique dans un domaine  particulier. Classiquement, la technique du foie isolé perfusé, les tranches de foie, les hépatocytes isolés et en culture sont employés en développement préclinique, les microsomes servent au screening avant les études chez l’animal.
L’Homme est le meilleur modèle d’étude. Cependant, les modèles humains in vitro pour évaluer l’hépatotoxicité sont peu utilisés en industrie pharmaceutique. En effet, les données littéraires sont peu fournies et leur utilisation entraîne des difficultés techniques, du fait de leur variabilité et de leur manque de disponibilité [34]. Les morceaux de foie humain sont en effet difficiles à obtenir, puisque les foies sont en priorité réservés pour les transplantations hépatiques. L’industrie pharmaceutique et la recherche peut toutefois obtenir des morceaux de foie sains prélevés lors d’une biopsie d’un foie malade lors de cancer par exemple, puisqu’une partie non touchée du foie est systématiquement enlevée pour éliminer au maximum les cellules tumorales. De plus, l’utilisation de foie humain pose des problèmes éthiques. Le Comité d’éthique doit donner son accord au préalable, valable uniquement pour un projet bien déterminé.
Les modèles obtenus à partir de rongeurs, en particulier les rats, sont beaucoup plus disponibles. Les rats peuvent être traités par des injections de dexaméthasone avant leur sacrifice. Ce corticoïde entraîne une surexpression des cytochromes de la famille 3A, famille la plus présente dans le foie humain. L’extrapolation des données obtenues à l’Homme est alors facilitée. Des injections de phénobarbital, de la famille des barbituriques, ou de 3-méthylcholanthrène, hydrocarbure aromatique polycyclique carcinogène, induisant les cytochromes de la famille 2 et 1 respectivement, peuvent également être réalisées [26].
Les modèles hépatiques que nous avons utilisés sont les microsomes de rat et humains, les coupes de foie de rat et humain, les hépatocytes de rat en culture primaire (hépatocytes commercialisés congelés) et les hépatocytes isolés à partir du foie de rat puis mis en culture primaire.
Les applications des modèles hépatiques in vitro dans les études de pharmacotoxicologie sont diverses et comprennent l’étude des paramètres cinétiques (Km, Vmax…), du profil métabolique des xénobiotiques, des comparaisons inter-espèces, des inductions et inhibitions enzymatiques par action des P450s et des enzymes de phase II, des P450s impliqués dans la métabolisation de divers composés, des interactions médicamenteuses, de l’influence du polymorphisme génétique, de cytotoxicité et génotoxicité… [53]
D’un point de vue réglementaire, les recommandations proposées en vue de l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM) se sont considérablement développées au cours de ces dix dernières années. Il y a une dizaine d’année, il suffisait pour le laboratoire pharmaceutique de démontrer que le composé était métabolisé ou non (grâce aux techniques du foie isolé perfusé et des coupes de foie). Au fur et à mesure des années, d’autres informations ont dû être apportées dans chaque dossier d’AMM, afin de garantir une meilleure efficacité et une meilleure sécurité au médicament mis sur le marché. Ainsi, le ou les métabolites sont identifiés et leurs éventuelles activités thérapeutiques, toxicités, réactivités vis-à-vis des macromolécules sont déterminées. Ensuite, le lieu où se passe le métabolisme, le ou les organes impliqués, sont mentionnés (grâce à l’utilisation de l’organisme entier). Les systèmes enzymatiques impliqués sont indiqués (avec l’utilisation d’hépatocytes ou de microsomes), en vue de prévoir les interactions possibles avec les voies métaboliques de produits endogènes, exogènes (interactions médicamenteuses) ou de nutriments. Dans ce même but et pour étudier le polymorphisme génétique, les isoformes impliquées sont également citées (à la suite d’études sur enzymes purifiées ou avec des inhibiteurs). Ainsi, un médicament substrat du CYP3A ou du CYP2D6 a toutes les chances d’être rejeté dès le début du développement. En effet, environ 60% des médicaments sur le marché sont métabolisés par le CYP3A, ce qui augmente le risque d’interactions médicamenteuses. En ce qui concerne le CYP2D6, il est soumis à un important polymorphisme génétique, un médicament métabolisé par cette isoforme ne pourra donc pas être utilisé de la même façon dans toutes les populations.

Régulation de l’expression des P450s

La variabilité d’expression intra- et inter-espèces des P450s est régulée par de nombreux facteurs : par des facteurs non génétiques incluant les facteurs environnementaux, les produits chimiques, les aliments, les médicaments (inducteurs ou inhibiteurs), le sexe, l’âge, la physiologie, les pathologies… et par des facteurs génétiques, c’est-à-dire le polymorphisme.

Origine non génétique

Induction

Une des caractéristiques des P450s est que certaines de ces enzymes, en particulier celles impliquées dans la métabolisation des xénobiotiques, sont inductibles. L’induction est souvent un procédé de régulation lent, car il fait intervenir un mécanisme transcriptionnel ou post-transcriptionnel [136].
L’expression du CYP3A peut être induite par des xénobiotiques. Une telle induction entraîne un métabolisme accéléré soit des xénobiotiques (auto-induction), soit de médicaments substrats du CYP3A administrés simultanément, en altérant leurs profils pharmacocinétique et pharmacodynamique [82]. Ce phénomène sera à l’origine d’une diminution des concentrations plasmatiques, avec un risque d’échec thérapeutique. Par exemple, le phénobarbital, inducteur du CYP2B, est rapidement métabolisé par le P450 qu’il induit. La conséquence sera une diminution des concentrations plasmatiques de phénobarbital et une réapparition des crises d’épilepsie chez les patients.
Les mécanismes d’induction des P450s sont complexes et diffèrent selon la sous-famille de P450s concernée. Une augmentation de la transcription est le plus souvent mise en jeu, mais il existe des augmentations de stabilité ou des diminutions de dégradation des ARNm ou de la protéine elle-même. Le premier mécanisme d’induction démontré a été celui de l’augmentation du taux du CYP1A1 après traitement par des hydrocarbures aromatiques polycycliques comme les dioxines. Le processus est initié par liaison du ligand au récepteur Ah cytosolique. Le complexe est alors transloqué dans le noyau. Le récepteur Ah s’associe à une seconde protéine, l’ARNT (Ah Receptor Nuclear Translocator). Ce complexe se lie à une séquence consensus XRE (Xenobiotic Responsive Element) présente dans le promoteur du gène de la protéine induite et active donc la transcription du CYP1A1 [60]. Le CYP3A est également inductible. Il existe en effet un récepteur à la pregnénolone PXR (Pregnan X Receptor) et une séquence de fixation de ce récepteur dans le promoteur des P450s humains. Le récepteur fixe des stéroïdes mais également une grande variété de médicaments dont la rifampicine et les glucocorticoïdes. Deux autres mécanismes impliquant des récepteurs sont connus. Il s’agit des PPAR (Peroxisome Proliferator Activator Receptor) et CAR (Constitutive Androstane Receptor), ce dernier, par liaison des barbituriques, permet l’induction du CYP2B6 [39]. D’autres cytochromes, comme le CYP2E1, sont induits par des mécanismes de stabilisation des ARNm mais également par des mécanismes de stabilisation de la protéine sous l’effet de l’éthanol. En effet, la dégradation de ce P450 par les protéases est retardée car l’éthanol diminue l’activité des protéasomes [107].
Sur le tableau VIII sont indiqués quelques exemples d’inducteurs des P450s en fonction de l’isoforme qu’ils induisent. Certains inducteurs induisent plusieurs isoformes de P450, comme la rifampicine qui induit les CYP2B6, 2C8, 2C19, 2C9, 2D6 et 3A. Des exemples d’inducteurs du CYP3A4 en particulier sont présentés dans le tableau VI.

Table des matières

INTRODUCTION
1. ETAT ACTUEL DES CONNAISSANCES
1.1. Les phases du métabolisme
1.1.1. Phase I
1.1.2. Phase II
1.1.3. Phase III
1.2. Les cytochromes P450
1.2.1. Historique
1.2.2. Classification et nomenclature
1.2.3. Répartition
1.2.4. Structure
1.2.5. Cycle catalytique
1.2.6. Implications des P450s dans les évènements biologiques
1.2.7. Modèles d’études des P450s
1.2.8. Régulation de l’expression des P450s
1.3. La P-glycoprotéine
1.3.1. Historique – Résistance aux chimiothérapies anticancéreuses
1.3.2. Répartition – Localisation
1.3.3. Structure
1.3.4. Fonctions
1.3.5. Modulation de l’activité ATPasique de la P-glycoprotéine
1.4. Couplage fonctionnel entre le cytochrome P450 3A et la P-glycoprotéine
1.4.1. Substrats communs au CYP3A et à la P-gp
1.4.2. Co-régulation du CYP3A et de la P-gp
1.4.3. Interaction fonctionnelle entre le CYP3A et la P-gp au niveau intestinal
1.4.4. Interaction fonctionnelle entre le CYP3A et la P-gp au niveau hépatique
1.4.5. Différences entre les interactions fonctionnelles au niveau intestinal et hépatique
2. MATERIELS ET METHODES
3. RESULTATS ET DISCUSSION
3.1. Mesures in vitro pour le choix des substrats
3.1.1. Les précurseurs de la résorufine
3.1.2. La 7-benzyloxy-4-trifluorométhylcoumarine
3.1.3. Le vérapamil-bodipy
3.2. Microscopie à épifluorescence
3.2.1. Foie humain
3.2.2. Foie de rat
3.2.3. Hépatocytes de rat
3.2.4. Fibroblastes de Hamster Chinois D/ADX
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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