Soutenance mémoire
Test de la boite claire/obscure (Light/Dark Box ; LDB)
Le test de LDB est appliqué en ce sens que le rat préfère naturellement les endroits obscurs tout en évitant ceux bien éclairés. Cette conduite éthologique est utilisée pour estimer le degré d’anxiété chez l’animal (Arrant et al., 2013). Le test est fait dans le dispositif de l’OF après avoir divisé le plancher en 2 compartiments : un d’eux (le compartiment obscur) a été peint en noir et éclairé par une lampe rouge faible, et l’autre (le compartiment clair) a été laissé transparent et éclairé par une lampe blanche brillante (Fig. 6). Une ouverture jouant le rôle d’une porte a été créée entre les 2 compartiments, ce qui permet à l’animal de se déplacer librement d’un compartiment à l’autre. Au début du test, la ratte est placée dans le compartiment clair et ses activités comportementales sont enregistrées pendant 5 min.
Dosage de la corticostérone plasmatique
La corticostérone plasmatique a été dosée par un kit radio USA). Brièvement, 0,1 ml d’échantillon a été mélangé avec 0,5 ml d’antisérum pré tubes à essai en polypropylène. Après une incubation de 30 min à une température ambiante, un traceur radioactif en H3 a été ajouté aux tubes qui sont vortexés, incubés pendant 1h à 37°C puis refroidis pendant 15 min à 4°C. Par la suite, 0,2 ml d’une solution charbonnée froide a été ajouté aux tubes qui sont vortexés, incubés pendant 10 min au froid puis centrifugés à 15 min à 4°C. Finalement, le surnageant a été enlevé, auquel on ajoutait un cocktail de scintillation afin de déterminer le taux de radioactivité présente. La réactivité croisée ( 40 cm), l’hémoglobine (Hgb, hemoglobin), l’hématocrite (HCT,volume corpusculaire moyen (MCV, mean corpuscular volume), la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration de la corticostérone plasmatique La corticostérone plasmatique a été dosée par un kit radio-immunologique ( vement, 0,1 ml d’échantillon a été mélangé avec 0,5 ml d’antisérum pré tubes à essai en polypropylène. Après une incubation de 30 min à une température ambiante, un a été ajouté aux tubes qui sont vortexés, incubés pendant 1h à 37°C puis refroidis pendant 15 min à 4°C. Par la suite, 0,2 ml d’une solution charbonnée froide a été ajouté aux tubes qui sont vortexés, incubés pendant 10 min au froid puis centrifugés à 200 15 min à 4°C. Finalement, le surnageant a été enlevé, auquel on ajoutait un cocktail de scintillation afin de déterminer le taux de radioactivité présente.
Profil hématologique de la progéniture
Les portées des rattes ayant mis bas ont été vérifiées pour déterminer le nombre de ratons nés. Par conséquent, une ou deux paires sexuelles (mâle-femelle) ont été retirées de chaque portée et immédiatement décapitées. Le sang a été recueilli dans des tubes EDTA et utilisé pour mesurer les mêmes paramètres hématologiques ayant été déterminés chez les mères au jour gestationnel . Cette analyse hématologique a été aussi faite à l’aide d’un automate d’hématologie (PCE-210 model 2009, Japan).
Le comportement anxieux dans l’ETM
Dans l’ETM, les femelles exposées à un prédateur ont montré une plus grande latence au cours des premières (basales) et troisièmes sessions d’évitement en comparaison avec les femelles C et Q (P < 0,001), et une plus grande latence au cours de la deuxième session d’évitement par rapport aux rattes Q seulement (P < 0,001). Le prétraitement à la quercétine a abouti à une diminution significative de la latence au cours des deux premiers évitements comparativement aux rattes PS (P < 0,001). En plus, toutes les latences d’échappement ont été significativement diminuées chez les rattes PS par rapport aux rattes C et Q (P < 0,001). Cependant, malgré la diminution persistante par rapport aux rattes non stressées, la latence a été significativement améliorée au cours des échappements 1 (P < 0,01), 2 (P < 0,001) et 3 (P < 0,05) chez les rattes PS + Q en comparaison avec les rattes PS. Il est intéressant de noter que la latence relative à l’évitement basal (P < 0,001) et aux évitements 1 et 2 (P < 0,05) a été atténuée davantage alors que celle relative aux échappements 1 et 3 (P < 0,01) a été augmentée chez les rattes Q par rapport aux témoins. L’ANOVA 2 a indiqué un effet significatif du traitement, des sessions et de l’interaction traitement × sessions pour toutes les latences d’évitement et d’échappement (P < 0,001) (Fig. 15).
Les mesures hématologiques néonatales
Les mesures hématologiques à la naissance (PND 1) ont indiqué une augmentation significative en RBC et PLT avec une diminution significative en MCHC chez tous les nouveau-nés des groupes PS et PS + Q par rapport aux groupes non stressés C et Q (P < 0,001). Le niveau d’Hgb augmentait significativement chez les femelles stressées (P < 0,001) alors que le paramètre MCV montrait une diminution considérable chez les mâles PS et PS + Q (P < 0,001), et à moindre degré chez les femelles PS (P < 0,01), comparativement aux homologues non stressés. Particulièrement, alors que toutes les femelles prénatalement stressées avaient des valeurs élevées en HCT (P < 0,001), ce paramètre se décroissait chez les mâles PS (P < 0,001) mais s’accroissait chez les mâles PS + Q (P < 0,05) par rapport aux homologues C et Q. L’ANOVA 2 a révélé un effet significatif du traitement, du sexe et de l’interaction traitement × sexe pour tous les paramètres hématologiques (P < 0,001) (Tab. 6).
Effets du stress de prédation sur les paramètres des rattes et de leur progéniture
Le stress de prédation est un modèle animal valide pour l’étude des désordres neuropsychiatriques dérivant d’un traumatisme psychologique chez l’être humain. Ce modèle a été appliqué à plusieurs stades du développement reproductif chez les rongeurs (Figueiredo et al., 2003). Dans la présente étude, le stress de prédation gestationnel a provoqué une anxiété maternelle immédiate au jour 19. Ceci a été révélé par des tests comportementaux, à savoir l’EPM, l’OF, le LDB et l’ETM. Dans l’EPM, les rattes stressées ont particulièrement montré une augmentation du temps passé dans les bras fermés avec une diminution du nombre d’entréesdans les quatre bras. L’OF a aussi révélé que le temps passé dans la zone périphérique augmentait alors que le temps passé dans le centre du dispositif diminuait chez les femelles PS. Ces attitudes anxieuses sont renforcées par un déclin du nombre de redressements (i.e. l’exploration verticale), ce qui pourrait davantage refléter une perturbation de l’activité motrice spontanée des mères gestantes, compromettant alors leurs soins postpartum envers les nouveau-nés. Effectivement, Mashoodh et al. (2009) ont rapporté que la menace de prédation après délivrance cause un comportement anxieux chez les femelles et altère leurs soins envers la descendance, aboutissant ainsi à des changements persistants du comportement des ratons. Par ailleurs, les femelles stressées entrent rapidement dans la zone obscure du LDB et y passent un temps considérable, évitant ainsi l’environnement éclairé. Cet évitement comportemental a été clairement notifié dans l’ETM durant lequel les femelles PS prenaient plus de temps pour quitter le bras fermé au cours des trois sessions d’évitement, tandis qu’elles s’échappent rapidement aux bras ouverts au cours des trois sessions d’échappement comparativement aux femelles nonstressées. Il a été démontré qu’un stress psychologique au cours de la dernière semaine de gestation est associé à des symptômes d’anxiété et de dépression chez les animaux d’expérimentation (Adamec et Shallow, 1993; Hebb et al., 2002). A cet égard, le comportement d’anxiété relatif au stress de prédation a été rapporté chez des rats mâles (Roseboom et al., 2007). La menace de prédation a été aussi associée à une augmentation des tendances d’évitement et d’évaluation du risque (risk assessment), aussi bien qu’à des épisodes prolongés de congélation (freezing) et d’immobilité (Li et al., 2004; McGregor et al., 2002). Les études préliminaires ont aussi indiqué que les animaux stressés par un prédateur montrent un évitement considérable de la chambre claire du LDB (Adamec, 2001). Ceci étant vrai, il est globalement accepté que les comportements d’évitement et d’échappement dans l’ETM sont reliés à l’anxiété généralisée et au désordre de panique, respectivement (Zangrossi et Graeff, 1997). Reliée aux signes cliniques de l’anxiété chez l’être humain, une perte pondérale forte a été remarquée au jour gestationnel 20 (i.e. 24h post-stress) chez les rattes PS. Il a été rapporté que le stress aigu de prédation cause une chute en poids corporel chez les rats mâles (Figueiredo et al., 2003). Cependant, d’autres études biologiques ont indiqué que l’exposition prolongée de rats sauvages (Burwash et al., 1998) ou de hamsters (Zhang et al., 2003) aux odeurs d’un prédateur n’avait aucun effet sur le poids corporel. Il est intéressant de noter que la perte pondérale chez les mères stressées pourrait être interprétée par une diminution de la prise d’aliments due à l’anxiété intense suite au stress. Cette anxiété prépartum pourrait influencer les fœtus au moyen des glucocorticoides, des neuromédiateurs ou des cytokines maternels (Merlot et al., 2008). En fait, on a encore démontré que cette anxiété est liée à une hypercorticostéronémie, envisageant un rôle clé de la corticostérone dans ces désordres neurologiques et de toute conséquence possible qui en dérive. Les études précédentes ont mis en évidence l’incrimination de cette hormone dans le développement de certains symptômes anxieux et dépressifs (Johnstone et al., 2000; Salomon et al., 2011; Weinstock, 1997). Cependant, l’intervention d’autres agents hormonaux ou nerveux reste possible. La corticostérone en excès est potentiellement capable de traverser la barrière placentaire en agissant sur des cibles cérébrales de la progéniture. Le stress peut aussi induire la sécrétion de la CRH placentaire, un intermédiaire hormonal liant les axes corticotropes maternel et fœtal (Goland et al., 1993). Ces constatations sont en accord avec des données hypothétiques à propos d’un lien pathologique entre le stress intense, les dysfonctions immunitaires et les désordres neurocomportementaux. Etant donné qu’une relation bidirectionnelle entre les systèmes nerveux et immunitaire vient d’être prouvée, tout manque d’adaptabilité neuroendocrinienne à un stress traumatique peut entrainer un déséquilibre dans la production des cytokines, favorisant dans certains cas le taux de cytokines pro-inflammatoires en provoquant le comportement de maladie (sickness behavior). C’est ainsi que la conduite comportementale maternelle et l’émotivité de la progéniture se déstabiliseraient par un niveau plasmatique élevé de corticostérone. Le comportement anxieux des femelles stressées a été associé à des changements hématologiques importants. Les conditions stressantes sont susceptibles d’affecter les variables sanguins à travers l’activation de l’axe corticotrope et le système nerveux autonome (Hasan et al., 1993). Le décroissement considérable en RBC, Hgb, HCT et MCV avec l’augmentation de la MCHC pourraient être expliqués par l’hyperventilation respiratoire en réponse à l’exposition au prédateur, une condition qui était accompagnée d’une absence de la capacité de combattre-oufuir (fight-or-flight) que les animaux habituellement possèdent dans une telle confrontation de prédation. L’absence de la capacité de combattre-ou-fuir est reliée à une activité musculaire minime, et par conséquent à un faible besoin en oxygène, aboutissant à la production d’érythrocytes microcytiques et hyperchromiques à bas niveau par l’organisme maternel. En plus, les rattes PS ont manifesté un niveau élevé de plaquettes (PLT) suite au stress. La thrombocytose induite par le stress pourrait servir à préparer l’organisme pour d’éventuelles blessures suite à l’expérience traumatisante.
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Table des matières
1. INTRODUCTION
2. MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1. Matériel biologique
2.1.1. Animaux d’élevage
2.1.2. Enceinte d’élevage
2.2. Méthodes
2.2.1. Identification œstrale et accouplement
2.2.2. Groupes expérimentaux
2.2.3. Administration de la quercétine
2.2.4. Stress de prédation
2.2.5. Planification expérimentale
2.2.5.1. Expérimentation 1 : Étude maternelle
2.2.5.2. Expérimentation 2 : Étude de la progéniture
2.2.6. Tests comportementaux relatifs à l’étude maternelle
2.2.6.1. Test de labyrinthe en croix surélevé (Elevated Plus-Maze ; EPM)
2.2.6.2. Test du champ ouvert (Open Field ; OF)
2.2.6.3. Test de la boite claire/obscure (Light/Dark Box ; LDB)
2.2.6.4. Test du labyrinthe surélevé en forme de T (Elevated T-maze ; ETM)
2.2.6.5. Test de nage forcée (Forced Swim Test ; FST)
2.2.7. Prélèvements maternels
2.2.8. Profil hématologique maternel
2.2.9. Mesure de la corticostérone plasmatique
2.2.10. Statut oxydatif maternel
2.2.10.1. Glutathion réduit (GSH)
2.2.10.2. Glutathion-S-Transférase (GST)
2.2.10.3. Malondialdéhyde (MDA)
2.2.10.4. Protéines
2.2.11. Étude tératologique
2.2.12. Profil hématologique de la progéniture
2.2.13. Profil immunitaire de la progéniture
2.2.14. Tests comportementaux relatifs à l’étude de la progéniture
2.2.14.1. Test du champ ouvert (OF)
2.2.14.2. Test de suppression néophobique de nourriture (Novelty suppressed feeding ; NSF)
2.2.14.3. Test de la boite claire/obscure (LDB)
2.2.14.4. Test de reconnaissance des objets (Novel Object Recognition ; NOR)
2.2.15. Analyse statistique des données
3. RÉSULTATS
3.1. Etude maternelle
3.1.1. Changement pondéral
3.1.2. Comportement anxieux dans l’EPM
3.1.3. Comportement anxieux dans l’OF
3.1.4. Le comportement anxieux dans le LDB
3.1.5. Le comportement anxieux dans l’ETM
3.1.6. Taux plasmatique de corticostérone
3.1.7. Les mesures hématologiques gestationnelles
3.1.8. Paramètres du stress oxydatif cérébral
3.1.9. Le comportement dépressif dans le FST
3.2. Etude de la progéniture
3.2.1. Les mesures fœtales et néonatales relatives à la tératologie
3.2.1. Les mesures hématologiques néonatales
3.2.2. Les paramètres immunitaires au cours de la vie postnatale précoce
3.2.3. L’émotivité de la progéniture durant la péri-adolescence
3.2.3.1. L’activité locomotrice dans le test du champ ouvert (OF)
3.2.3.2. Le comportement anxieux dans le test de suppression néophobique de nourriture (NSF)
3.2.3.3. Le comportement anxieux dans la boite claire/obscure (LDB)
3.2.3.4. Les capacités cognitives dans le test de reconnaissance des objets (ORT)
4. DISCUSSION
4.1. Effets du stress de prédation sur les paramètres des rattes et de leur progéniture
4.2. Effets de la quercétine sur les paramètres des rattes et de leur progéniture
5. CONCLUSION
6. PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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