Impact des eisosomes sur la structure membranaire

Impact des eisosomes sur la structure membranaire

Alternaria brassicicola

Alternaria brassicicola est un ascomycète de la classe des Dothideomycetes. Il est responsable de la maladie des « tâches noires» des Brassicacées, autrement nommée l’alternariose. Cet agent pathogène a un spectre d’hôtes restreint aux membres de la famille des Brassicacées (Nowicki et al., 2012 ; Pochon, 2012). Les principaux symptômes causés par ce champignon sont : l’apparition de taches sombres entourées d’un halo chlorotique sur les tiges et les feuilles de ses hôtes (diminution de la surface de photosynthèse et accélération de la senescence), l’apparition de nécroses sur les siliques et l’infection des semences .
Cette dernière étape induit une réduction de la germination, de la vigueur des graines et donc d’importantes fontes des semis (Nowicki et al., 2012).
Le cycle d’infection d’A. brassicicola,  est caractéristique des champignons nécrotrophes. L’inoculum primaire du champignon est initialement présent dans les résidus de cultures et sur les graines déjà contaminées. La transmission se fait alors soit directement de la graine à la plantule, si la graine parvient à germer, soit des résidus aux parties aériennes de l’hôte.

Domaines “Membrane Compartment of Can1” (MCC)

Suite à la découverte de ces domaines, initiée par la visualisation des protéines Sur7 et Can1 marquées à la GFP sur la membrane plasmique, d’autres protéines les composant ont par la suite été identifiées (Alvarez et al., 2009 ; Grossmann et al., 2008 ; Fröhlich et al.,2009). Ainsi, plusieurs transporteurs ont été identifiés tels que des transporteurs de nutriments et deux familles différentes de transporteurs qui contiennent quatre domaines transmembranaires nommés « tetraspanners ». Une de ces familles de « tetraspanners » comprend la protéine Sur7 et ses paralogues : Fmp45, Pun1 et Ynl194c. L’autre famille de « tetraspanners » comprend les protéines Fhn1 et Nce102 (Douglas et al., 2011).

Rôles des domaines MCC/eisosomes

Le rôle des domaines MCC/eisosomes n’est pas encore bien connu, cependant plusieurs hypothèses ont été émises. Dans un premier temps, plusieurs auteurs proposent un rôle des protéines Pil1 et Lsp1 dans le déroulement de l’endocytose (Murphy et al., 2011 ; Walther et al., 2006 ; Walther et al., 2007). D’autres travaux suggèrent que les domaines MCC/eisosomes permettraient plutôt de protéger certaines protéines membranaires de l’endocytose. En effet, Grossmann et al. ont montré en 2008 que les protéines Can1 semblent plus stables au niveau des domaines MCC/eisosomes que lorsqu’elles quittent ces domaines.
Il a également été suggéré que ces domaines aient un rôle dans l’intégrité membranaire, dans la réponse à de nombreux stress (osmotiques, thermiques), et dans la résistance à la dessiccation (Dupont et al., 2010 ; Hosiner et al., 2011 ; Luo et al., 2008 ; Yoshikawa et al., 2009 ; Young et al., 2002). Les protéines des domaines MCC/eisosomes ont été décrites comme étant importantes dans le maintien de la paroi cellulaire. Par exemple, la protéine Sur7 a été décrite comme jouant un rôle potentiel dans la synthèse de la paroi suite à l’exposition des stress thermiques ou pariétaux par exemple.

Transformation d’Alternaria brassicicola

Une préculture d’A. brassicicola est prévue la veille de la transformation dans 100 ml de milieu PDB (Potato dextrose broth) (15 heures à 24°C et 175 rpm). La suspension obtenue a été divisée en deux dans des tubes 50 ml avant d’être centrifugée pendant 10 minutes à 5500 rpm. Une fois le surnageant enlevé, les culots ont été lavés à l’aide d’une solution tampon de NaCl concentrée à 0.7 M puis centrifugés, et ce à deux reprises. Le culot ainsi lavé a ensuite été resuspendu dans 20 ml de la solution enzymatique filtrée à 20 µm (20 mg/ml de Driselase (Sigma) et 10mg/ml de Kitalase (Wako) dans une solution tampon de NaCl concentrée à 0.7 M). Les tubes ont été incubés pendant 4 heures à 32°C avec une agitation par retournement effectuée toutes les 30 minutes. Au bout des 4 heures, la paroi du champignon a été digérée par les enzymes et les protoplastes obtenus ont été filtrés sur une maille d’un diamètre de 30 µm puis centrifugés pendant 7 minutes à 5000 rpm. Le culot a été resuspendu très délicatement dans 10 ml de STC (4 ml de Sorbitol 3 M, 0,1 ml de Tris pH 7.5 1 M et 0.5 ml de CaCl2 1 M), avant d’être à nouveau centrifugé et mis en suspension dans 500 µl de STC.

Microscopie électronique à balayage

L’observation des échantillons au microscope électronique à balayage a été réalisée sur le plateau IMAC de la SFR QUASAV. Les feuilles de choux de la variété Bartolo et les rosettes d’Arabidopsis thaliana de l’écotype Ler ont été inoculées avec 5 µl de suspensions des souches étudiées respectivement concentrées à 105 et 104 conidies/ml. Les plants inoculés sont placés pour la nuit dans un phytotron réglé pour être à une température de 22°C le jour et 19°C la nuit avec un cycle jour/nuit de 8 heures de lumière et 16 heures d’obscurité. Le lendemain, les feuilles sont découpées au niveau du dépôt, puis collées au socle du microscope électronique à balayage (Phenom Pro). Les échantillons sont congelés jusque -24°C le temps de l’observation. A partir des photographies obtenues en mosaïques, les nombres de tubes germinatifs et d’appressoria sont décomptés.

Inoculation sur siliques d’Arabidopsis thaliana

Les plants d’A. thaliana de l’écotype Ler ont été cultivés en condition jours longs, (16 heures d’éclairage avec une température de 22°C et 8 heures d’obscurité avec une température de 19°C). Les inoculations ont eu lieu sur des plantes présentant 10 siliques matures, soit quand elles sont âgées d’environ 5 semaines. Les 5 premières siliques ont été inoculées à l’aide de deux dépôts de 2,5 µl de suspensions concentrées à 103 conidies/ml chacun respectivement à la base et au sommet de la silique. Les plantes ont ensuite été placées dans un phytotron en condition jours longs et bâchées les deux jours suivant l’inoculation (Pochon et al., 2013).
Au dixième jour post-inoculation, les siliques ont été récoltées, les graines ainsi que les siliques ont été déposées sur milieu PDA. Les graines contaminées ont été dénombrées 3 à 4 jours plus tard.

Table des matières

1- Introduction
1-1 Pathosystème Alternaria brassicicola – Brassicacées
1-2 Domaines MCC/eisosomes
2- Matériels et méthodes
2-1 Matériel fongique
2-2 Création de mutants fongiques
2-3 Tests phénotypiques in vitro
2-4 Microscopie
2-5 Phénotypage sur plantes
3- Résultats
3-1 Localisation cellulaire des eisosomes
3-2 Impact des eisosomes sur la structure membranaire
3-3 Capacité de résistance aux stress
3-4 Etude de l’agressivité des mutants des domaines MCC/eisosomes chez Altenaria brassicicola
4- Discussion
5- Conclusion et perspectives 

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