Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires 

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Les prélèvements respiratoires

Les infections respiratoires sont les infections les plus fréquentes et peuvent survenir à tout âge.23 Les agents les plus fréquemment incriminés sont les virus. Néanmoins, les causes bactériennes ne pouvant être éliminées à l’examen clinique, un traitement peut être indiqué sans prélèvement bactériologique en ambulatoire.18, 50 En effet, les prélèvements respiratoires ne sont indiqués que s’ils sont susceptibles de modifier la prise en charge du patient56 et malgré des explorations approfondies, aucune étiologie n’est en effet retrouvée dans plus de 40 % des cas de pneumopathie aiguë communautaire.7, 50 Ainsi, le nombre d’examens microbiologiques des sécrétions broncho-pulmonaires et des expectorations (code 5210 de la NABM) était de l’ordre de 95’000 actes en France en 2015.10 Chez le patient hospitalisé, les prélèvements non invasifs seront réalisés pour les pneumopathies aigues, les prélèvements invasifs (code 5230 de la NABM, soit environ 30’000 actes en France en 201510) ayant une place en seconde intention pour les patients de réanimation ou en première intention pour les patients immunodéprimés. En cas de suspicion de pneumopathie acquise par ventilation mécanique, les analyses bactériologiques quantitatives des prélèvements respiratoires ont un rôle diagnostic important et permettent de diminuer l’exposition aux antibiotiques par rapport à des stratégies diagnostiques cliniques.15
De grandes variabilités de performances peuvent être retrouvées pour un même type de prélèvements. Une répartition non uniforme des bactéries dans le prélèvement (dans les expectorations par exemple69) peut expliquer ces variations.
Quand ils sont indiqués, les prélèvements respiratoires devront être réalisés sans retard, avant toute antibiothérapie.2 Les recommandations préconisent une prise en charge préanalytique rapide (transport et conservation avant ensemencement).23, 44, 53, 56 Une prise en charge dans les 2h est en effet recommandée pour éviter la perte de viabilité de Streptococcus pneumoniae ou Haemophilus influenzae et la prolifération d’autres germes (bacilles à Gram négatif). En effet, une perte de viabilité des germes fragiles a été décrite au-delà de 4 heures (en liaison avec la présence d’enzymes lysosomales dans le prélèvement).7 Si le prélèvement ne peut être pris en charge dans les 2 heures, une conservation à +4°C pendant 24h est possible.30

Prélèvements respiratoires non protégés

L’examen cytobactériologique des crachats (ECBC) présente l’avantage d’être non invasif et d’être facile de réalisation. Néanmoins, de grandes variabilités de performances sont observées et une contamination d’origine salivaire est retrouvée dans 50 % des cas.18 Afin d’éviter la contamination par la flore oropharyngée, des conditions strictes de recueil doivent être observées : la prélèvement doit être fait après 1 à 2 heures de jeûne (idéalement le matin), après rinçage de la bouche au sérum physiologique (ou eau distillée) stérile et lors d’une toux productive profonde, aidée si besoin d’un kinésithérapeute.13
Avant ensemencement, un examen direct par lecture au microscope optique après coloration de Gram est réalisé pour éliminer les prélèvements les plus à risque de contamination salivaire, définis par les critères de Bartlett, Murray et Washington (cf Tableau 1). Ces critères ne s’appliquent cependant pas à la culture des légionelles et des mycobactéries pour lesquels la présence est nécessairement pathologique.18 La présence de bactéries à l’examen direct pourra également être renseignée, bien que son utilité soit controversée.28, 39, 43, 45, 47, 48, 52, 57

Principaux pathogènes étudiés au sein des prélèvements

Pathogènes entériques

Les bactéries du genre Salmonella spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies, souvent mobiles, appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, pouvant coloniser le tractus intestinal des vertébrés.27 Certains sérotypes sont exclusivement humains (exemple : Salmonella Typhi = Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhi).37 Leur présentation clinique est large : allant du portage asymptomatique à la fièvre typhoide létale.21 Les salmonelloses correspondent à deux entités selon leur appartenance à un sérovar typhoïde ou non typhoïde. La première présentation (sérovars Typhi et Paratyphi : A, B ou C37) est celle d’une atteinte systémique avec bactériémie définissant la fièvre typhoïde menaçant le pronostic vital et pouvant persister dans le système lymphatique mésentérique, la moelle osseuse et la vésicule biliaire avec des rechutes ultérieures chez 5 à 10 % des patients (après 2 à 3 semaines typiquement). La seconde présentation est celle d’une diarrhée fébrile avec douleurs abdominales, 12 à 72 heures après l’infection, spontanément résolutive en 4 à 7 jours. En cas d’immunodépression (SIDA) ou d’altération de la phagocytose (drépanocytose37), certaines souches peuvent néanmoins présenter un passage systémique et atteindre d’autres organes. La coproculture peut rester longtemps positive (convalescence, porteur sain).27
Les formes les plus répandues dans les pays développés sont les gastro-entérites et les entérocolites survenant après intoxication alimentaire (TIAC). L’impact mondial sur la santé publique est important avec une incidence annuelle de 25 millions de cas, dont plus de 200’000 décès.
Les bactéries du genre Shigella spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies appartenant à la famille des Enterobacteriaceae49, immobiles, non encapsulés. Dotées d’un pouvoir invasif caractéristique au niveau recto-colique, leur seul hôte naturel est Homo sapiens.27 Adaptées aux humains, les espèces du genre Shigella spp peuvent être rarement retrouvées chez le chien et le primate. Au total, 4 groupes sérologiques sont décrits49 : Shigella dysenteriae (groupe A), Shigella flexneri (groupe B, touchant les pays en voie de développement), Shigella boydii (groupe C, retrouvée davantage en Inde), Shigella sonnei (groupe D, prédominant dans les pays développés). La similarité génétique et protéique des espèces du genre Shigella spp avec Escherichia coli rend leur identification délicate et fait préférer les critères biochimiques.
Associée au péril fécal, l’infection de fait par ingestion d’aliments ou d’eau contaminée avec une recrudescence estivale. La mouche commune (Musca domestica) peut constituer un vecteur.37 Une transmission interhumaine est possible (relation sexuelle oro-anale) ainsi que lors d’accidents de laboratoire.37 La dose infectieuse est en effet très faible : 10 à 100 organismes sont suffisants pour provoquer une infection.37, 49 Les Shigella spp peuvent survivre dans l’environnement et dans les aliments : 3 jours dans l’eau de mer et 30 jours dans le lait et le fromage.9
Associées au bas niveau d’hygiène, à la malnutrition et au manque d’accès aux soins (favorisés par les guerres, les déplacements de population et les cataclysmes naturels9), les épidémies de shigelloses sont responsables de fortes morbidité et mortalité chez la population pédiatrique des pays en voie de développement du tiers-monde. En effet, 165 millions de cas annuels sont estimés au niveau mondial dont plus d’un million d’évolution fatale. Les patients de moins de 5 ans représentent 60 % des cas de décès.49 Chez les populations affaiblies, malnutries et massivement contaminées, la mortalité peut atteindre 10 à 30 %9 lors d’infections à S. dysenteriae.
Les infections à Shigella spp entraînent des symptômes principalement digestifs21 (diarrhée aqueuse fébrile, crampes abdominales douloureuses, myalgies avec de possibles céphalées et raideur de nuque37). La durée d’incubation est variable : de quelques heures à 4 jours et jusqu’à 8 jours pour S. dysenteriae.9, 49 La phase d’état est caractérisée par la survenue d’une diarrhée glairo-sanglante en 2 à 3 jours avec altération de l’état général, résolutive le plu souvent en 5 à 7 jours. Il peut exister une bactériémie avec de possibles manifestations extra-intestinales : SHU (retrouvé dans 13 % des cas d’infection à S. dysenteriae37), arthrites réactionnelles (associées aux infections à S. flexneri37), syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter49). Dans de rares cas, une atteinte méningée, pulmonaire ou du tractus urinaire peuvent être présentes.37 Après un épisode non traité, des Shigella spp peuvent être retrouvées dans les selles jusqu’à 3 mois, voire pendant plusieurs années en cas de dénutrition.9
Les bactéries du genre Yersinia spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies appartenant à la famille des Enterobacteriaceae21, présentant une croissance préférentielle entre 25 et 32°C. Une culture sélective est possible sur milieu CIN (cefsulodin-irgasan-novobiocin), comme les Aeromonas spp. Il s’agit de bactéries environnementales avec un réservoir large (sol, eau, égout, végétaux) pouvant également être retrouvée chez les animaux (porcins, bovins, caprins, ovins, rongeurs, félins, canins).23, 37
Parmi les 18 espèces inclues dans le genre Yersinia spp, 4 sont pathogènes pour l’homme56 : Yersinia pestis, Yersinia wautersii, Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis. Cette dernière espèce présente une proximité génétique importante avec Yersinia pestis21 qui partage 90 % de ses gènes.23
Les infections à Yersinia spp. constituent la troisième cause de diarrhées bactériennes en Europe, dépendantes d’un mécanisme toxinique et invasif.27 L’infection se fait par transmission féco-orale suite à l’ingestion d’aliments contaminés, par contact avec des animaux domestiques porteurs de Yersinia spp ou par contact avec un sujet atteint ou convalescent d’une yersiniose.9 Ces transmissions sont facilitées par la capacité des bactéries du genre Yersinia spp à se multiplier à basse température.21 La survenue des cas est sporadique ou en faible nombre. L’incidence annuelle des infections à Yersinia spp est comprise entre 2 et 16 cas pour 100’000 habitants. Ces infections sont probablement sous-estimées en raison de la recherche inconstante de ces bactéries dans les selles diarrhéiques.
L’espèce principale en cause dans les infections à Yersinia spp est Y. enterocolitica, avec une recrudescence saisonnière discutée.21, 37 Après une incubation de 4 à 7 jours, la présentation clinique typique est celle d’une entérite aigüe fébrile, prédominant chez l’enfant de moins de 10 ans, éventuellement associée à une iléite terminale et une lymphadénite21 pouvant mimer une appendicite. Les symptômes sont souvent modérés et spontanément résolutifs en 1 à 3 semaines. Les infections à Y. pseudotuberculosis, responsables de moins de 2 % des yersinioses, prédominent en saison froide et entraînent majoritairement une adénite mésentérique mimant une appendicite.21, 37 La population à risque est le sujet âgé de plus de 60 ans chez qui l’évolution peut être péjorative avec des formes généralisées souvent mortelles (28 % à 100 % de décès pour les formes traitées et non traitées respectivement37). Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et les dysthyroïdies sont des facteurs de risques, de même que la surcharge en fer (hémochromatose, thalassémie ou traitement par deferoxamine).
Des séquelles immunologiques peuvent survenir à distance des yersinioses : érythème noueux dans 3 % des cas et arthrites réactionnelles dans 7 % des cas37 (de survenue dans les 3 semaines et plus fréquent chez l’immunodéprimé, une association avec le HLA-B27 a été décrite21, 37). Des syndromes de Fiessinger-Leroy-Reiter, cardites, glomérulonéphrites et thyroïdites ont été décrits occasionnellement.4 Une persistance de Y. enterocolitica dans les selles peut être observée plusieurs semaines, voire plusieurs mois, après la guérison.9, 23 A l’inverse, Y. pseudotuberculosis n’est plus retrouvé dans les selles une fois les ganglions mésentériques envahis.
Les bactéries du genre Campylobacter spp sont des bacilles à Gram négatif microaérophiles (croissance idéale dans une atmosphère comprenant, entre autres, 5 % de dioxygène9), parfois thermotolérantes3, spiralées ou incurvées (du grec campylo : incurvé), mobiles par un flagelle polaire.56 L’environnement aquatique constitue un réservoir38 ainsi que les animaux domestiques : volailles, bovins, porcins, petits ruminants, animaux de compagnie (chats, chiens) et animaux sauvages (oiseaux, rongeurs). Les Campylobacter spp appartiennent à la classe des Epsilonproteobacteria regroupant 4 genres : Campylobacter spp, Arcobacter spp, Helicobacter spp et Wolinella spp. Parmi les 17 espèces du genre Campylobacter spp, les principales sont Campylobacter jejuni, Campylobacter coli et Campylobacter fetus.23
Adaptées à la vie dans le tractus digestif de l’homme et des animaux3, 5 d’élevages et domestiques37, les espèces du genre Campylobacter spp sont retrouvées chez les oiseaux et les mammifères.23 Le poulet en particulier peut être considéré comme le principal réservoir naturel de C. jejuni avec une concentration de 10⁶ UFC par gramme de matières fécales au niveau du cloaque. Selon les études, 40 à 80 % des carcasses de poulet de grande distribution sont contaminées à Campylobacter spp (la viande étant inoculée lors de l’abattage de l’animal par dissémination à partir du tractus digestif).23, 37 Par ailleurs, l’emballage des aliments sous vide favorise la microaérophilie et la croissance des Campylobacter spp.4
L’infection, zoonose de recrudescence estivale, se fait par ingestion de viande peu cuite ou par contamination croisée (consommation crus d’aliments souillés). Pouvant toucher tous les âges, les personnes à risque sont les nourrissons, les jeunes enfants3, 11 et les jeunes adultes.29 Il s’agit campylobactérioses.3
de la première cause d’infection intestinale bactérienne dans les pays développés16, 23 (sous-estimée en raison d’une sous-déclaration27, 29, 37) mais la prévalence est également importante dans les pays en voie de développement.11 Il existe une augmentation importante du nombre de cas d’infections à Campylobacter spp, non explicable par l’amélioration des systèmes de détection. Lors de grandes épidémies (TIAC), l’eau et le lait cru furent les principales sources de contamination. Pour les cas sporadiques (plus fréquents37), un lien de causalité fort a été retrouvé avec la consommation de viande de poulet pour C. jejuni3, 5, 11 et la viande de porc pour C. coli.29
Après une phase d’invasion de durée variable (probablement liée à la dose infectante9 : au minimum 3 jours et pouvant aller jusqu’à 10 jours11, 23, 29, 37), la présentation clinique de l’infection à Campylobacter spp est une entérite aiguë fébrile avec diarrhée, crampes abdominales et adénite mésentérique.11 L’atteinte gastrique est rare. L’épisode est spontanément résolutif en 7 jours, mais la bactérie peut persister plusieurs semaines dans les selles3, 9, 29, voire plusieurs mois.23 Dans certains pays en voie de développement, près de 40 % des enfants de moins de 2 ans excrètent Campylobacter jejuni dans leurs selles.9 Dans 5 à 25 % des cas, une rechute est observée.9, 23 L’espèce dominante en pathologie humaine est C. jejuni, représentant 80 % à 90 % des cas de Les infections à C. fetus (responsable de 4 % des cas de campylobactérioses29) peuvent être bactériémiques avec des localisations secondaires et une atteinte endovasculaire (endocardites ou anévrysmes de l’aorte), surtout en cas de pathologie sous-jacente (VIH, pathologie maligne ou hépatique37). Les infections à Campylobacter spp (surtout C. jejuni) peuvent entraîner des syndromes post – infectieux immunologiques (par mimétisme entre les antigènes bactériens et certains composants des gaines de myéline)3 : arthrite réactionnelle dans 2 à 4 % des cas (atteinte des genoux préférentielle37, pouvant survenir dans les 3 à 40 jours après la diarrhée), érythème noueux, syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter9, urticaire ou syndrome de Guillain-Barré dans 1 à 3 cas pour 1000 (pouvant survenir dans les 2 à 21 jours après la diarrhée37).3, 11 L’hospitalisation est requise dans 5 à 10 % des cas et la mortalité est de 5 pour 10’000 cas.
Sous l’influence d’une basse température, des formes viables non cultivables (VNC) de Campylobacter spp ont été décrites3, 16, 19, 38, 42, 65, conservant leur pouvoir infectant5 mais non retrouvables en culture. Néanmoins, la conservation à +4°C semble meilleure qu’à température ambiante.46, 64 Ne se multipliant pas dans les aliments (à la différence des salmonelles), il a été montré dans des études agro-alimentaires que la quantité de C. jejuni dans les aliments décroissait avec le temps, quelque que soit la température, l’atmosphère et le pH.3 Néanmoins, leur survie est possible dans l’eau et le lait pendant plusieurs semaines à des températures proches de +4°C.9, 23.
Les bactéries du genre Aeromonas spp sont des bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies mobiles, à oxydase positive. Une culture sélective est possible sur milieu CIN (cefsulodine-irgasan-novobiocine), comme les Yersinia spp.23 Plus de 26 espèces différentes d’Aeromonas spp ont été décrites, mais la grande majorité n’ont qu’une importance clinique limitée, les 3 espèces principales en pathologie humaine étant Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae et Aeromonas CO2.9, 23
veronii sp sobria.23, 27, 37 Les bactéries du genre Aeromonas spp sont ubiquitaires. Retrouvées en surface des sites aquatiques souillés et stagnants, des pics de concentration estivaux sont visibles lors des hausses de températures. Les bactéries du genre Aeromonas spp peuvent persister plusieurs mois à années dans l’eau et le sol ainsi que dans des amibes. De nombreuses souches peuvent se multiplier et synthétiser leurs facteurs de virulence lors d’une réfrigération à +4°C.
Les sources potentielles d’infections sont la consommation d’eau contaminée ou de viande de bœuf, de porc, de volaille, d’agneau ou de veau ainsi que des coquillages ou poissons infectés. Des eaux contaminées peuvent également infecter l’homme au niveau cutané par exposition de plaies ou brûlures ainsi qu’au niveau pulmonaire lors de noyades.23 La présentation clinique des infections digestives à Aeromonas spp varie de la diarrhée aqueuse à sanglante. Très rarement, elle peut mimer une diarrhée aqueuse profonde semblable à celle du choléra. Des SHU sont également possibles. Des complications secondaires peuvent survenir, incluant colites ou MICI. En cas de comorbidités (chimiothérapies anticancéreuses27), une translocation bactérienne d’origine digestive peut survenir avec une bactériémie d’évolution péjorative (32 % à 45 % de mortalité). D’autres agents peuvent être impliqués dans des diarrhées aigües bactériennes : Bacillus cereus, Clostridium perfringens et Staphylococcus aureus. Ces pathogènes ne sont pas recherchés en routine : les symptômes courts qu’ils entraînent ne donnent que rarement lieu à une consultation médicale.37

Pathogènes respiratoires

La flore oropharyngée est constituée de bactéries commensales pouvant être impliquées dans des infections respiratoires bactériennes : S. pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis,1 certaines espèces du genre Corynebacterium et Staphylococcus ainsi que des bactéries anaérobies.23 Les patients atteints de BPCO peuvent présenter une flore contenant des entérobactéries, et des souches de Pseudomonas aeruginosa peuvent être retrouvées avec des résistances acquises par sélection au cours d’antibiothérapies. Lors du recueil d’expectorations, des conditions strictes doivent donc être observées pour minimiser le risque de contamination par la flore salivaire. A l’inverse, certaines bactéries d’origine orale ne doivent pas être prises en compte dans la recherche d’étiologie de processus infectieux : streptocoques oraux, Staphylococcus non aureus, Neisseria spp, Haemophilus non influenzae.18
S. pneumoniae (pneumocoque) est un cocci à Gram positif, organisé en diplocoque, lancéolé et encapsulé, essentiellement humain.4 Fragile, cette bactérie doit arriver rapidement au laboratoire où sa culture nécessite des facteurs de croissance et une atmosphère enrichie en De distribution mondiale, S. pneumoniae est responsable de multiples pathologies humaines et représente une des principales causes de mortalité et de morbidité en infectiologie9, 31 avec une incidence annuelle en Europe de 800 infections/100’000 habitants dont 20 décès/100’000 habitants.4 Il s’agit en effet de la première cause de pneumonies communautaires bactériologiquement documentées27 (50 % des cas4). Souvent isolé de flores commensales des voies respiratoires de populations saines, la colonisation s’observe à un stade précoce au cours de la vie avec un taux de colonisation de 40 à 60 % chez l’enfant, qui diminue à 6 % chez l’adulte sans enfant.4, 9
H. influenzae est un bacille à Gram négatif de petite taille, immobile, aéro-anaérobie facultatif. Exigente, sa croissance est favorisée par une atmosphère enrichie en CO2 après un acheminement rapide23 sur gélose au sang (haemo : sang et philo : amour en grec), cuit de préférence, et associé à des facteurs de croissance.59 Un passage des bactéries en forme VNC est possible.42 Comme les autres espèces du genre Haemophilus spp (à l’exception d’Haemophilus aegyptius et Haemophilus ducreyi),4 il fait partie de la flore normale des voies aériennes supérieures et de la cavité buccale chez 50 à 80 % de la population, mais peut aussi être présent au niveau génital voire digestif.9, 27
M. catarrhalis est un cocco-bacille à Gram négatif23 exclusivement humain,27 normalement présent dans le tractus respiratoire supérieur de 5 % de la population adulte et 66 à 100 % de la population pédiatrique.27 Il peut également être retrouvé dans des prélèvements d’origine génitale ou conjonctivale. Fragile, son transport doit être rapide et sa culture est favorisée par une atmosphère enrichie en CO2.
S. aureus est un cocci à Gram positif, organisé en tétrades voire en amas, à coagulase positive. Bactérie commensale de la peau et des muqueuses de l’homme dès la naissance, le portage chez l’adulte est fréquent en particulier au niveau nasopharyngé (20 à 40 % de la population) et vaginal (10 % de la population).9, 23 S. aureus est l’agent infectieux responsable de la plus grande variété de pathologies chez l’homme,27 dont des infections pulmonaires (rares et graves, pouvant compliquer la grippe4, 27), et son pouvoir pathogène est majoré par de nombreuses toxines et enzymes.59 Résistant dans l’environnement, aucune précaution particulière lors du transport n’est requise23 mais des formes VNC ont cependant été décrites.42
P. aeruginosa est un bacille à Gram négatif non fermentant, aérobie strict, mobile, ubiquitaire. Présent à l’état naturel dans l’environnement (eaux douces et eaux de mer, sol, végétaux), il se multiplie dans les endroits humides et présente peu d’exigences nutritives mais des formes VNC ont été décrites.42 Pathogène opportuniste, il est fréquemment retrouvé dans le tractus respiratoire des patients atteints de maladies pulmonaires chroniques (BPCO, mucoviscidose), ainsi qu’au niveau du tube digestif, de la gorge, du nez, de la peau et du tractus urinaire.27 Deux autres espèces peuvent être retrouvées dans des prélèvements d’origine humaine : Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas putida. Contaminants fréquents des prélèvements, leur croissance possible à +4°C favorise leur isolement.23

Conditions préanalytiques et numérations d’éléments

Numérations des éléments urinaires

Les ECBU sont les examens de microbiologie les plus réalisés (code 5201 de la NABM) avec plus de 9 millions d’actes en France en 2015, soit environ 2 % des actes de biologie médicale.10 Les conditions préanalytiques sont critiques. En effet, le délai avant l’analyse et la présence de conservateur peuvent affecter la concentration urinaire en bactérie et en cellules (hématies et leucocytes). La numération bactérienne est importante pour conclure à une infection ou à une contamination par la flore périnéale. De même, la conservation des leucocytes et des hématies est essentielle afin de ne pas méconnaitre une leucocyturie et/ou hématurie significatives, définies par une concentration supérieure ou égale à 10 éléments/mm³ (ou 10’000/mL). La prise en charge d’urines sans conservateur doit être réalisée dans les 2 heures afin d’éviter la prolifération bactérienne et la dégradation des éléments. Au-delà, une réfrigération à +4°C permet de conserver les bactéries jusqu’à 24 heures mais n’assure pas la conservation des leucocytes.23 L’adjonction d’acide borique, agent bactériostatique, permet la conservation à température ambiante des urines sans modification de la concentration bactérienne. Néanmoins, il semble raisonnable que chaque laboratoire effectue sa propre évaluation du risque de dégradation des leucocytes en fonction des récipients utilisés et du délai maximal entre le prélèvement et l’analyse.56 En effet, les résultats contradictoires sur les effets cytologiques des conservateurs imposent la prudence au-delà de 8 heures de contact.30 Plus précisément, la stabilité des hématies et des leucocytes est dépendant de l’osmolalité et du pH : un pH supérieur à 7,5 et une osmolalité inférieure à 300 mosm/kg peuvent entraîner une dégradation rapide des cellules urinaires.22, 34, 61

Numérations des liquides de ponctions

Normalement stériles, les liquides corporels contenus dans les séreuses (liquide pleural, liquides articulaires et liquide d’ascite) peuvent s’infecter et faire l’objet d’explorations microbiologiques. Avec les analyses du LCS (cf infra), ces analyses représentaient plus de 95’000 actes en France en 2015 (code 5231 de la NABM)10. Ce sont des urgences médicales et leur prise en charge est immédiate après réception au laboratoire. Idéalement, leur analyse devrait être réalisée dans la demi-heure suivant le prélèvement33 et dans tous les cas avant 2 heures de conservation à température ambiante.56 Néanmoins, les délais préanalytiques peuvent être allongés en cas d’échantillons prélevés dans des établissements éloignés.
Parmi les échantillons envoyés au laboratoire pour explorations, l’utilisation de tubes BD vacutainer avec EDTA K2 est fréquente. Adaptés à la conservation du sang, la stabilité des numérations de liquides de ponctions sur tube EDTA K2 n’est cependant pas garantie par le fournisseur. L’utilisation d’un anticoagulant est néanmoins judicieuse pour éviter la formation de caillot rendant la numération impossible et la formule approximative. La numération leucocytaire des liquides d’ascite est en effet indispensable au diagnostic et au suivi des infections de liquide d’ascite, définies par une concentration supérieure à 250 polynucléaires /mm³ dans le liquide d’ascite.33 La numération et la formule des liquides articulaires sont des arguments importants dans le diagnostic des arthrites septiques (un liquide mécanique ou inflammatoire étant défini par une concentration en leucocytes inférieure à 1000/mm3 ou supérieure à 2000/mm3, respectivement)33 et l’étude des liquides pleuraux permet d’orienter le diagnostic étiologique d’un épanchement liquidien (les seuils de concentration en leucocytes étant fixés à 1000 et 10’000/mm3).33 Ces échantillons précieux ne sont pour la plupart pas reprélevables et la présence d’un coagulum dans l’échantillon risque de perturber de façon irréversible le diagnostic en rendant la numération impossible.33 La validation de la stabilité des numérations leucocytaires et érythrocytaires sur ces contenants est donc primordiale.

Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux

Les méningites sont des urgences médicales absolues susceptibles de menacer le pronostic vital à court terme. L’analyse microbiologique du LCS est cruciale pour le diagnostic biologique des méningites, définies par une concentration rachidienne de leucocytes supérieure ou égale à 5 éléments/mm3. Le cas échéant, un examen direct en microscopie optique d’un frottis coloré par la coloration de Gram est précieux. En cas de présence de Neisseria meningitidis (diplocoque « en grain de café » à Gram négatif), il existe un bénéfice individuel évident mais également collectif par la mise en place de mesures d’isolement renforcées et par le traitement prophylactique de cas contacts. Ainsi, le CDC recommande un délai maximal de transport de 1 heure de l’échantillon au laboratoire. Les recommandations britanniques préconisent un délai idéal inférieur à 10 minutes et dans tous les cas inférieur à 2 heures. La SFM recommande que l’examen direct du LCS soit disponible dans l’heure qui suit sa réception au laboratoire.30 Les recommandations de la SFBC mentionnent des délais maximaux de 1 heure pour la numération et de 4 heures pour l’examen direct.63
Plusieurs indicateurs peuvent être utilisés pour évaluer les délais de réponse (« turnaround time », ou TAT). Pour les laboratoires avec de grandes marges d’améliorations, la moyenne de délai de rendu est pertinente ainsi que la médiane. Pour les laboratoires avec de bonnes performances, ces marqueurs ne sont pas adaptés car ils sont peu impactés par les exceptions des distributions. Pour cette deuxième catégorie de laboratoires, le 90e percentile et le pourcentage de test acceptables (PAT) sont plus pertinents.62 Il est donc recommandé d’utiliser au moins deux de ces indicateurs pour suivre les performances de TAT : la moyenne ou la médiane de délais de réponse (permettant d’évaluer les performances globales) associée au 90e percentile ou au PAT (pour les exceptions).

Objectifs de l’étude

L’application de la norme ISO 15189 demande à chaque laboratoire de définir ses exigences préanalytiques, en particulier les instructions relatives aux modalités de recueil et de transport ainsi que de conservation des échantillons avant analyse. Ceci est particulièrement important en cas de regroupement de plusieurs laboratoires monosites en des entités multisites composées de sites de prélèvements périphériques et de plateaux techniques. En effet, il y a un risque d’allongement de la phase préanalytique : cela requiert l’existence de navettes permettant d’acheminer les échantillons entre les sites de prélèvements et les sites d’analyse.
Le CHU de Rouen est un établissement composé de plusieurs sites dont certains sont distants de quelques kilomètres du site principal où se trouve le laboratoire de bactériologie. Des navettes assurent le ramassage des prélèvements en différents points de collecte, plusieurs fois par jour. En dehors de ces passages, il peut donc y avoir un délai plus ou moins prolongé avant l’analyse des échantillons prélevés, en plus du délai lié à l’acheminement.
L’objectif principal de notre étude était d’établir un délai acceptable avant analyse pour la détection et la numération des bactéries retrouvées lors d’examens microbiologiques de selles et de prélèvements respiratoires en l’absence de milieu de transport. Ce délai permettra de s’affranchir d’un milieu de transport systématique pour ces prélèvements sans risque de perte de viabilité des germes et sans impact sur le résultat.
Le deuxième objectif de cette étude était d’établir un délai avant analyse acceptable pour la stabilité des numérations leucocytaires et érythrocytaires des urines conservées sur tubes boratés à température ambiante et des liquides de ponctions conservés sur tube EDTA K2.
Enfin, le troisième objectif de cette étude était d’évaluer les délais d’acheminement et de réalisation des numérations et examens directs de LCS réalisés au CHU de Rouen et de confronter ces résultats aux recommandations. En cas d’anomalie, nous proposerons des axes d’amélioration.

Matériel et méthodes

Matériel

 Selles

Au cours d’un recueil exhaustif réalisé de façon prospective, les selles ayant présenté une culture positive à Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter spp, Yersinia spp et Aeromonas spp ont été retenues pour l’étude du délai de conservation.
Afin d’augmenter l’effectif de l’étude et de s’affranchir de la rareté de certains genres bactériens (Shigella spp en particulier), des selles négatives furent artificiellement inoculées avec des entéropathogènes d’origine digestive obtenus à partir du souchier du laboratoire. Ces souches congelées avaient été conservées à -80°C. Un repiquage initial a été effectué sur gélose adaptée, puis 1 mL d’une selle liquide fraiche négative en culture fut enrichie avec 0,1 mL d’une solution de NaCl 0,85 % chargée à 0,5 ± 0,1 mcFarland de la bactérie pathogène. Pour les Shigella spp., 1 mL d’une selle liquide fraiche négative en culture fut enrichie avec 0,5 mL d’une solution de NaCl 0,85 % chargée à 4 ± 1 mcFarland. Dès l’inoculation, un contrôle de la positivité de la selle ainsi enrichie était réalisé par ensemencement en quadrant sur gélose adaptée spécifique.
Des courbes de survie ont été établies pour chaque pathogène en fonction du délai de réensemencement afin de déterminer un délai maximal garantissant la survie des germes.

Prélèvements respiratoires

Les prélèvements respiratoires étudiés étaient des expectorations, aspirations bronchiques, aspirations pharyngées, PBDP, brosse, lavage broncho-alvéolaire, recueillis de façon prospective en fonction du résultat de leur culture.
Les prélèvements négatifs ont été éliminés. Les prélèvements présentant une culture positive à au moins un pathogène possible (Acinetobacter spp, Achromobacter spp, Enterococcus spp, Enterobacteriaceae, H. influenzae, M. catarrhalis, P. aeruginosa, S. aureus, Stenotrophomonas maltophilia, S. pneumoniae) ont été retenus pour un réensemencement après conservation à +4°C.

Urines sur tube boraté

Seules les urines dont la numération initiale avait été effectuée par l’automate de routine UF-1000 (Sysmex) étaient incluables. Étaient donc exclues les urines sur sonde, les urines troubles ou en faible volume (numération initiale effectuée manuellement ou non effectuée).
Pour l’évaluation de la stabilité de la leucocyturie sur tube BD vacutainer boraté, les urines ayant présenté une numération leucocytaire initiale proche du seuil décisionnel de 10 leucocytes /mm3 (soit entre 10 et 50 leucocytes/mm3) ont été sélectionnées de façon préférentielle. D’autres urines présentant des niveaux de concentrations variables ont néanmoins été inclues afin de représenter une large gamme de leucocyturie.
Pour l’évaluation de la stabilité de l’hématurie sur tube boraté BD vacutainer et pour l’évaluation des tubes Sarstedt, aucune sélection particulière n’a été réalisée. Les urines prélevées sur tube BD furent inclues de façon prospective sur une durée de 15 jours pour l’analyse des leucocytes et sur une durée de 10 jours pour l’analyse des hématies.
Les urines prélevées sur tubes Sarstedt furent inclues de façon prospective et exhaustive sur une durée de 3 semaines. Elles étaient communes à l’analyse de la stabilité des hématies et des leucocytes. Avant recompte, toutes les urines furent conservées à température ambiante, à l’abri de la lumière.

Liquides de ponctions sur tube EDTA K2

Seuls les liquides de ponctions prélevés sur tube BD EDTA K2 ayant été numérés initialement étaient incluables. Étaient donc exclus les prélèvements coagulés, les prélèvements purulents ou les prélèvements en quantité insuffisante. Les liquides de ponctions ont été inclus de façon prospective et exhaustive sur 3 semaines. Ils étaient communs à l’analyse de la stabilité des hématies et des leucocytes. Avant recompte, tous les liquides de ponctions furent conservés à +4°C.

Méthodes

Impact des délais sur les cultures de selles

Après conservation à +4°C, seules des selles fraîches ou artificiellement inoculées, sans milieu de transport, ne présentant pas de signes macroscopiques de dessication furent réensemencées sur milieu adapté à intervalles réguliers (tous les 1 à 3 jours) après détection de la bactérie pathogène. Pour les selles liquides, un anse calibrée de 10 μL de selle fut déchargée sur des géloses sélectives : Hektoen (Biomérieux) incubée en aérobiose à 37°C, Campylosel (Biomérieux) incubée en atmosphère microaérophilie à 37°C (GasPak EZ Campy Pouch System, BD) et CIN (Thermoscientific) incubée en aérobiose à 30°C. La présence ou l’absence de bactérie était établie après une durée de culture de 1 à 4 jours. L’identification était réalisée par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Brucker) ou carte Vitek 2 GN.
Pour les selles non liquides, un volume équivalent à celui d’un petit pois fut déchargé dans 1 mL de sérum physiologique. Après agitation mécanique de type vortex, une anse de 10 μL fut déchargée sur les géloses sélectives.
Lors des repiquages effectués dans cette étude, seule la gélose permettant l’isolement du (ou des) germe(s) d’intérêt fut utilisée : Hektoen (Biomérieux) pour les Salmonella spp et les Shigella spp, Campylosel (Biomérieux) pour les Campylobacter spp et CIN (Thermoscientific) pour les Aeromonas spp et Yersinia spp.
La date de prélèvement, la date d’enregistrement et les dates de réensemencement ont été enregistrées. Le délai d’acheminement a été défini comme la période de temps comprise entre la date de prélèvement et la date d’enregistrement. Le délai avant réensemencement (délai de conservation) a été défini comme la période de temps comprise entre la date d’enregistrement et la date maximale de réensemencement (dernier repiquage positif pour les souches ayant résisté à la conservation, ou premier repiquage négatif pour les souches ayant disparu au cours de la conservation).

Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires

Après conservation à +4°C, les prélèvements respiratoires présentant une culture positive à au moins un pathogène ont été réensemencés. Le réensemencement a été réalisé après identification de la (ou des) espèce(s) pathogène(s) identifiée(s), soit un délai compris entre 1 et 3 jours après l’ensemencement initial, voire 5 jours en cas de week-end.
Pour l’ensemencement des expectorations, aspirations bronchiques et aspirations pharyngées, le prélèvement était mélangé à un réactif fluidifiant à base de dithiothréitol (Digest-EUR®, Eurobio) dans un ratio 1/1 conformément au protocole standard proposé par la notice fournisseur (protocole par ailleurs ancien24, 54). Cent microlitres d’une dilution au 10’000e (deux dilutions successives de 100 μL dans 10 mL de sérum physiologique) du mélange obtenu furent ensemencés au râteau sur gélose au sang (COH, Biomérieux) et/ou gélose chocolat PolyViteX (PVX, Biomérieux) et/ou gélose chromogène (CPS, Biomérieux). L’identification des bactéries après 24 à 48 heures de culture aérobie à 35°C (en atmosphère éventuellement enrichie en CO2) était établie par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Brucker), et sensibilité à l’optochine pour les S. pneumoniae. Le seuil de détection pour ces analyses était de 105 UFC/mL. Le dénombrement des espèces bactériennes est donné par le Tableau 3.

Table des matières

 Introduction 
1 Les coprocultures
2 Les prélèvements respiratoires
2.1 Prélèvements respiratoires non protégés
2.2 Prélèvements respiratoires protégés
3 Principaux pathogènes étudiés au sein des prélèvements
3.1 Pathogènes entériques
3.2 Pathogènes respiratoires
4 Conditions préanalytiques et numérations d’éléments
4.1 Numérations des éléments urinaires
4.2 Numérations des liquides de ponctions
4.3 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux
5 Objectifs de l’étude
Matériel et méthodes 
1 Matériel
1.1 Selles
1.2 Prélèvements respiratoires
1.3 Urines sur tube boraté
1.4 Liquides de ponctions sur tube EDTA K2
2 Méthodes
2.1 Impact des délais sur les cultures de selles
2.2 Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires
2.3 Impact des délais sur les numérations d’éléments
2.4 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux 
Résultats 
1 Impact des délais avant ensemencement sur les cultures de selles
2 Impact des délais sur les cultures de prélèvements respiratoires
2.1 Prélèvements respiratoires non protégés
2.2 Prélèvements respiratoires protégés
3 Impact des délais de recompte sur les numérations des éléments urinaires
3.1 Leucocytes
3.2 Hématies
4 Impact des délais de recompte sur les numérations de liquides de ponctions
4.1 Leucocytes
4.2 Hématies
5 Délais de prise en charge des liquides cérébro-spinaux
Discussion 
Conclusion 
Bibliographie 

Télécharger le rapport complet