Soutenance mémoire
Dans le langage populaire, les mites représentent deux types d’insectes nuisibles, dont les teignes qui s’attaquent aux matières textiles et les pyrales qui s’attaquent aux denrées alimentaires. Les céréales constituent l’alimentation de base de la majorité des habitants de la planète. Cependant elles subissent des pertes énormes si les conditions de stockage ne sont pas suffisantes. Le risque d’infestation est plus grand durant la saison chaude (mai à septembre), au cours de deux périodes principales de reproduction. L’étude de la reproduction est donc fondamentale afin de diminuer les dégâts causés par ces déprédateurs. En effet, de nombreuses études réalisées sur divers ordres d’insectes ont démontré l’implication de l’hormone juvénile et de l’ecdysone (les deux hormones régissant la croissance et la métamorphose chez les insectes au niveau de deux mues successives nymphale et imaginale (Nijhout, 1994 ; Riddiford, 1994 et 1996), ils jouent un rôle majeur dans le développement et la reproduction des insectes (Bellés, 2005 ; Wang et al., 2004 ; Gade et hoffman, 2005). L’hormone juvénile (JH), un dérivé terpénoïde est le grand orchestrateur du développement et de la reproduction chez les insectes, elle est présente durant toute la vie larvaire et synthétisée par les corps allates sous la dépendance de neurohormones céphaliques (Stay et woodhed, 1993; koopmashap et al., 1991).. Sa présence à des niveaux élevés chez les insectes immatures empêche le déclenchement de la métamorphose au moment de la mue, assurant ainsi le maintien de caractères « juvéniles » jusqu’à la fin du développement larvaire. Chez l’adulte, la JH est essentielle à diverses activités reproductrices dont la maturation des gonades et la production de phéromones sexuelles (Stay et woodhed, 1993 ;Koopmashap et al.,1997).
L’ecdysone est une prohormone des ecdystèroide correspondant à la famille de stéroïdes polyhydroxylés, elle est gonadotropique produite par les glandes prothoraciques, libérée dans l’hémolymphe puis convertie en 20-hydroxy ecdysone (20 E), hormone active à l’ecdysone 20-monoxygénase (Smith, 1958; Koolman, 1990). Les ecdystéroides sont toujours présentes chez l’adulte grâce à sa synthèse par les ovaires des femelles (Hagerdorn, 1985), les testicules des mâles (Loeb et al., 1982, 1984) et encore les oenocytes , les sternites et l’épiderme (Delbecque et al., 1990 ; Spindler et al., 1991 ; Kelly et al., 1992 ; Asahina et al., 1994 ;; Soltani et al., 1997). Chez la femelle, l’ecdysone en concomitance avec l’hormone juvénile, régule le développement ovarien chez certaines espèces de papillons (Ramaswamy et al., 1997).
Matériel et méthodes
Modèle biologique
Présentation de l’insecte
Originaire de l’Inde, Ephestia kuehniella (Zeller) est un insecte lépidoptère holométabole qui existe dans les régions tempérées et méditerranéennes. Cet insecte a une nette préférence pour la farine d’ou « Pyrale de la farine », mais peut également s’attaquer aux grains de céréales, biscuits, pâtes alimentaires, chocolat, riz (Contact Webmaste ,2002). Il a des mœurs nocturnes, et se tient au repos contre les murs ou caché dans la farine (Balachowsky ,1972). Sa position systématique est la suivante :
Embranchement Arthropoda
Sous Embranchement Antennata
Super classe Trachéates
Classe Insecta
Sous Classe Ptérygota
Section Néoptéra-oligonéoptéra
Super Ordre Mécoptéroidae
Ordre Lépidoptéra
Sous Ordre Hétéroneures
Division Ditrysia
Sous Division Hétérocères
Super famille Phyraloidae
Famille Pyralidae
Sous famille Gallerinae
Genre Ephestia
Espèce kuehniella (Zeller)
Cycle biologique
Le cycle complet du développement est de 80 jours à une température de 27C° et une humidité de 80%. L’accouplement a lieu immédiatement après le début de la vie d’adulte, juste après, la femelle pond environ 100 à 200 œufs pendant une période de 3 jours formant un amas au fond et sur les parois des sacs de farine.
Le développement chez Ephestia kuehniella passe par 4 phases (Figure 2), dans un ordre bien déterminé, œuf, larve ou chenille, nymphe ou chrysalide, adulte ou papillon (Balachowsky, 1972 ; Bendjeddou, 1993 ; Hami, 2004).
*l’œuf : Il est de couleur blanchâtre et de forme ovoïde, d’une longueur de 440 µm, et une largeur de 250 µm.
*La larve : À son premier stade, la larve blanche tirant sur le rosé, mesure 1 à 1,5 mm, après six mues, elle atteint 10 à 13 mm au stade final. La larve mâle se différencie de celle de la femelle par la présence de deux taches noires sur la face dorsale de l’abdomen, correspondant aux testicules (Figure 3).
*La chrysalide : les larves du dernier stade commencent à se nymphoser en tissant une enveloppe de soie « cocon » contenant des substances nutritives dans laquelle elle évoluera pendant 8 à 12 jours donnant un stade immobile. Elle est de couleur brune et mesure environ 8 à 9 mm de long.
*L’adulte : Il est de couleur grise et mesure 10 à 12 mm d’envergure. Il est formé par deux paires d’ailes, deux ailes antérieures grisâtres avec des points noires et deux ailes postérieures blanchâtres finement frangées. Sa longévité est de 14 jours.
La finalité de la vie adulte est la reproduction, les mâles meurent en général quelques jours après l’accouplement ; les femelles après la ponte.
Technique d’élevage
L’élevage est réalisé au laboratoire à une température de 25°C et une humidité relative de 80% (Payne, 1966). Les individus d’Ephestia kuehniella sont déposés dans des jarres en verre contenant de la farine et recouvertes par un morceau de tulle maintenu par un élastique. Les larves du dernier stade récoltées à la surface du tulle, sont séparées en fonction de leur sexe. Les mâles sont déposées dans des boites en plastique contenant de la farine et du papier plissé pour qu’elles puissent se nymphoser. L’élevage est suivi quotidiennement et les chrysalides nouvellement exuviées (0 jours) sont utilisées pour l’expérimentation.
Application des insecticides
présentation des insecticides
Nous avons testé l’effet de deux mimétiques de l’hormone de mue, le méthoxyfénozide (RH-2485) et le tébufénozide (RH-5992) sur les taux des métabolites testiculaires (glucides, lipides et protéines) et les Acides nucléiques ( ADN et ARN) chez Ephestia kuehniella (Zeller).
Le RH-2485 ou méthoxyfénozide est le nom commun du N-tert-Bentyl-N’-(3- méthoxy-o-tolwoyl)-3.5-xylohydrazide. Sa formule empirique est : C22H28N2O3 et son poids moléculaire est de 368.47g. Il appartient à la catégorie des insecticides du groupe des bisacylhydrazines qui sont des agonistes de deuxième génération de l’ecdysone. Il agit principalement par ingestion chez les larves de lépidoptère. Son effet a été observé in vivo sur le développement et la reproduction, il perturbe également la croissance des ovocytes et la production d’ecdystéroides (Dhadialle et al., 2005).
Le tébufénozide RH-5992, c’est le nom commun du N-tert-butyl-N’ (4ethylhydrazine3-5-dimethyl-benzohylhydrazine), sa formule empirique est : C22H28O2 et son poids moléculaire est de 352,48. Il interfère avec l’expression de certains gènes de la sécrétion cuticulaire (Retnakaran et al., 1995 ; Dhadialla et al.,1998). Il est particulièrement active contre les lépidoptéres (Chandler et al., 1992 ; Smagghe et degheel, 1994 ; Retnakaran et al.,1995) (Figure4).
Traitement
Le RH-2485 et le RH-5992 ont été utilisés par application topique respectivement aux doses de 0.01 µg et 0,005 µg, pour une inhibition de 50 (DL50). Ces deux insecticides ont été dilués dans l’acétone et 2 µl ont été déposés sur la face ventrale de l’abdomen des chrysalides mâles nouvellement exuvies.
Détermination du potentiel reproducteur
Après traitement avec la DL 50 du méthoxyfénozide RH-2485 et le tébufénozide RH5992 sur des chrysalides mâles nouvellement exuvies on mesure plusieurs paramètres du potentiel reproducteur, à savoir :
¬ La période de préoviposition : déterminée par le nombre de jours séparant l’émergence et le début de la ponte.
¬ La période d’oviposition : déterminée par la durée (en jour) de la ponte.
¬La fécondité des femelles : c’est le nombre d’œufs total pondus par une femelle durant la période d’oviposition.
¬La viabilité des œufs : c’est le nombre d’œufs éclos parmi la totalité des œufs pondus par une femelle.
¬La durée du développement embryonnaire : déterminée par la durée (en jour) entre la ponte et l’éclosion de l’œuf.
Dissection et Prélèvement des testicules
Dés leur émergence (0 jour), les adultes traités et témoins sont disséqués sous une loupe binoculaire, fixé sur le ventre par une aiguille sur une boite de paraffine. Les pattes et les ailes sont coupées à l’aide de microciseaux, l’abdomen est coupé et les testicules sont prélevés avec une pince et déposés dans des tubes éppendorf contenant 500 µl d’acide trichloracétique (TCA) à 20% pour l’extraction des métabolites, et 500µl d’eau distillée additionnée de 2µl phénylméthylsilfonyfluoride (PMSF: 45mg/ml d’éthanol) pour l’extraction des Acides , puis stockés au congélateur jusqu’au jour du dosage.
Analyses biochimiques
Extraction des métabolites
L’extraction des métabolites à été réalisée selon la méthode de shibko et al., (1966) sur les testicules des séries témoins et traitées.
Les testicules sont broyés dans 500 µl de TCA (20%) à l’aide d’un homogéneiseur à ultrasons et centrifugés à 5000trs/min pendant 10min, le premier surnageant est récupéré et servira au dosage des glucides totaux, le culot I additionné de 500 µI d’un mélange éther/ chloroforme (v/v, l/1) a subi une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions que précédemment afin de récupérer le surnageant ІІ, qui sera utilisé pour l’analyse quantitative des lipides, le culot ІІ dissout dans 500 µl de soude (0.1N), permettra la quantification des protéines (figure 5).
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Table des matières
1 Introduction
2 Matériel et Méthodes
2.1 Modèle biologique
2.1.1 Présentation de l’insecte
2.1.2 Cycle Biologique
2.2 Technique d’élevage
2.3 Application des insecticides
2.3.1 Présentation des insecticides
2.3.2 Traitement
2.4 Détermination du potentiel reproducteur
2.5 Dissection et prélèvement des testicules
2.6 Analyse Biochimique
2.6.1 Extraction des Métabolites
2.6.2 Dosage des Métabolites
2.6.2.1 Dosage des glucides totaux
2.6.2.2 Dosage des lipides totaux
2.6.2.3 Dosage des protéines totales
2.6.3 Extraction des Acides nucléiques
2.6.4 Dosage des Acides nucléiques
2.6.4.1 Dosage de l’ARN
2.6.4.2 Dosage de l’ADN
3 Analyse Statistique
4 Résultats
4.1 Effets du RH-2485 et RH-5992 sur le potentiel reproducteur
4.2 Effets du RH-2485 et RH-5992 sur la biochimie des testicules
4.2.1 Effets sur le taux des glucides testiculaires
4.2.2 Effets sur le taux des lipides testiculaires
4.2.3 Effets sur le taux des protéines testiculaires
4.2.4 Effets sur le taux d’ARN testiculaires
4.2.5 Effets sur le taux d’ADN testiculaires
5 Discussion
6 Conclusion
