Soutenance mémoire
Système immunitaire
L’immunologie consiste à étudier les mécanismes physiologiques qui permettent à l’homme de se défendre contre toutes sortes d’agents infectieux présents dans son environnement. Les mécanismes de l’immunité innée sont les premiers à se déclencher donnant une réponse rapide mais ne sont pas capables d’éliminer tous les pathogènes. En cas d’échec, le système immunitaire adaptatif, plus sévère et efficace dans l’élimination du pathogène, s’enclenche après avoir reconnu des antigènes spécifiques et permet de neutraliser l’infection (Janeway and Medzhitov, 2002). L’ensemble des réponses immunitaires innées et adaptatives confère à l’organisme un système de défense d’une excellente efficacité. Ce système repose sur différents types de cellules qui appartiennent principalement à la famille des leucocytes (globules blancs) et sont originaires de la moelle osseuse où elles se développent (Gordon and Taylor, 2005). Certaines d’entre elles vont migrer et circuler à travers le système sanguin pour rejoindre le système lymphatique alors que d’autres vont résider dans les tissus périphériques pour les protéger contre les pathogènes. Toutes ces cellules proviennent d’un précurseur pluripotent commun dans la moelle osseuse appelée cellule souche hématopoïétique (figure 1.1). À potentiel de différentiation plus limité, il apparait d’autres précurseurs dont le précurseur myéloïde qui est à l’origine des macrophages et des cellules dendritiques (Gordon and Taylor, 2005). Dans le cadre de cette introduction les macrophages qui sont des cellules effectrices de l’immunité innée ainsi que les récepteurs impliqués dans la mise en place de leurs fonctions destructrices seront décris. Un type particulier de phagocytose, celle induite par les récepteurs FcγR sera par la suite abordée. Enfin nous présenterons une revue bibliographique des études des paramètres qui régissent ce type de phagocytose.
Immunité innée et cellules phagocytaires
Notre environnement est peuplé par des micro-organismes comme les virus et les bactéries qui peuvent entrer dans l’organisme et engendrer des pathologies. Lorsqu’un micro-organisme parvient à traverser les barrières de défense naturelles comme la peau ou les muqueuses, il établit un site d’infection qui perpétue sa transmission. Une réponse immune est requise pour contrer la diffusion du pathogène. Dans la plupart des cas, ces pathogènes sont éliminés par des cellules du système de l’immunité innée, dites effectrices, spécialisées dans l’ingestion et la destruction des micro-organismes, les phagocytes. Ces cellules phagocytaires appelées aussi « phagocytes professionnels » comprennent les neutrophiles présents dans le sang et les macrophages qui résident dans les tissus. Ces cellules portent à leurs surfaces des récepteurs qui leur permettent de distinguer les motifs du « non soi », qui sont des structures moléculaires exprimés à la surface des pathogènes, des motifs du « soi » (Adams and Hamilton, 1984). Le processus biologique par lequel les phagocytes peuvent ingérer et éliminer des micro organismes est appelé phagocytose. L’internalisation s’effectue par l’intermédiaire de récepteurs et conduit à la formation d’un compartiment intracellulaire « le phagosome ». Le processus de phagocytose joue un rôle important dans la réponse immunitaire et représente la première ligne de défense de l’organisme contre les pathogènes. Le macrophage est la cellule phagocytaire par excellence. Ces cellules présentent une large gamme de récepteurs qui vont leur permettre de reconnaître les pathogènes et les éliminer. Dans cette première partie du chapitre nous allons présenter ces cellules et décrire les principaux récepteurs impliqués dans l’activation du processus de phagocytose.
Les Macrophages
Les macrophages sont issus de la différenciation des monocytes qui quittent le flux sanguin et migrent vers les divers tissus sous forme de macrophages matures (Aderem and Underhill, 1999; Taylor et al., 2005). Ce sont des cellules phagocytaires qui ont une durée de vie très longue pouvant aller jusqu’à plusieurs mois (Murphy et al., 2008), contrairement aux neutrophiles qui sont présents dans les foyers d’infection et ne vivent que quelques jours (Pillay et al., 2010). Les macrophages jouent un rôle important dans le maintien de l’homéostasie cellulaire, l’élimination des cellules sénescentes et la réparation des tissus après l’inflammation (Adams and Hamilton, 1984; Gordon and Taylor, 2005; Pollard, 2009). Selon leur tissu de résidence, les macrophages se spécialisent et possèdent un phénotype différent. On distingue par exemple les ostéoclastes présents dans les tissus osseux, les macrophages alvéolaires dans les poumons, les cellules de Kupffer qu’on retrouve le long de certains vaisseaux sanguins du foie ou encore les microglies qui résident dans le cerveau et la moelle épinière (Pollard, 2009). Généralement les macrophages sont les premières cellules phagocytaires qui rencontrent les micro organismes pathogènes dans les tissus, viennent ensuite les neutrophiles en renfort. Grâce à des récepteurs portés à leurs surfaces, les macrophages reconnaissent l’agent infectieux pour entrainer sa destruction par un processus actif : la phagocytose (cf. Figure 1.2).
La capture des pathogènes nécessite des interactions moléculaires spécifiques entre les bactéries et la surface du macrophage et se fait de deux manières :
• Sans opsonisation : Il s’agit là d’une interaction directe entre paroi microbienne et surface du macrophage. La reconnaissance se fait grâce aux récepteurs PRRs (Pattern Recognition Receptors) membranaires qui reconnaissent les PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns). Exemple : les récepteurs de mannose (MR).
• Avec opsonisation : dans ce cas, l’interaction nécessite une molécule intermédiaire appelée opsonine qui se fixe sur la bactérie et est reconnue par des récepteurs membranaires du macrophage (Owen et al., 2013). Les opsonines sont de deux types : les opsonines spécifiques qui désignent les anticorps et se lient à la cible en reconnaissant des antigènes spécifiques présents à sa surface, et les opsonines non spécifiques constituées d’une fraction de complément (ex. le facteur C3b du complément) qui va directement se fixer sur des structures microbiennes (cf. Figure 1.2).
Le terme PRR a été introduit par l’immunologiste C.Janeway en 1989 et désigne les récepteurs de l’immunité innée qui reconnaissent des motifs antigéniques microbiens PAMPs absents des cellules du soi. Ces motifs incluent les mannanes de la paroi des levures, les lipopolysaccharides LPS des bactéries à Gram négatif, l’acide lipotéichoïque LTA de la membrane des bactéries à Gram positif et les peptides formylés des bactéries (Janeway and Medzhitov, 2002; Jr, 1992). Ils sont exprimés par toutes les cellules de l’immunité innée et peuvent être membranaires, cytoplasmiques ou secrétés suivant leur localisation. Les macrophages sont des cellules effectrices de l’immunité innée mais jouent aussi un rôle plus complexe en participant à l’activation et à la régulation de l’immunité adaptative. Comme les cellules dendritiques, ce sont des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) qui permettent l’instauration de l’immunité acquise ou adaptative (Miyata and van Eeden, 2011). Les macrophages contribuent donc à l’efficacité du système immunitaire. L’activation de ces cellules et la mise en place de leurs différentes fonctions se fait suite à la perception de signaux extracellulaires via un éventail de récepteurs. Nous allons maintenant nous intéresser aux principales catégories de récepteurs qui sont impliqués dans le processus de phagocytose.
Immunoglobulines G (IgG)
La superfamille des immunoglobulines (Ig) est constituée de glycoprotéines présentes à la surface des cellules qui jouent un rôle important dans la reconnaissance et la liaison aux antigènes ou l’adhésion des cellules (Owen et al., 2013). On distingue cinq types d’immunoglobulines ou anticorps : IgA, IgD, IgE, IgG et IgM synthétisées par les plasmocytes (différenciation des lymphocyte B). L’immunoglobuline « typique » et la plus abondante dans le sérum, est l’IgG. Toutes les immunoglobulines possèdent une structure de base sous forme de Y qui comporte quatre chaines polypeptidiques groupées en deux paires. Deux chaines légères L (Light) et deux chaines lourdes H (Heavy) qui sont reliées par des ponts disulfure (S-S). Les immunoglobulines les plus abondantes sont les IgGs qui représentent 75 à 80% du contenu en immunoglobulines du sérum humain. Ces anticorps ont une masse molaire d’environ 150 kDa (Edelman, 1969). Dans une molécule d’immunoglobuline donnée, les deux chaînes lourdes et deux chaînes légères sont identiques, ce qui donne une molécule d’anticorps comportant deux sites de liaison identiques aux antigènes, et donc la capacité à se lier simultanément à deux structures identiques (Janeway et al., 2001). Chaque chaîne est constituée de séquences d’environ 110 acides aminés environ. La chaîne légère est constituée de deux de ces domaines (220 acides aminés) tandis que la chaine lourde en possède quatre (440 acides aminés). Chacune de ces deux chaines est constituée d’une région constante et d’une région variable :
– la chaine légère possède : un domaine variable (VL) un domaine constant (CL)
– la chaine lourde possède : un domaine variable (VH) un domaine constant (CH1, CH2, CH3)
L’association des domaines VL, VH, CL et CH1 constitue le fragment Fab qui permet la fixation de l’antigène (Figure 1.4). Ces molécules sont donc bi-fonctionnelles et présentent d’une part deux sites de fixation à l’antigène identiques et d’autre part, une partie constante formée des deux chaînes lourdes associées (CH2, CH3) qui constituent le fragment Fc (Fragment cristallisable) reconnu comme étant le support des propriétés biologiques de l’immunoglobuline. L’action d’enzymes spécifiques permet d’isoler différents fragments dont le fragment cristallisable Fc qui permet à la molécule d’IgG de se fixer à un récepteur cellulaire approprié et à activer le complément.
|
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : MECANISME DE LA PHAGOCYTOSE
I. Système immunitaire
I.1. Immunité innée et cellules phagocytaires
I.2. Les Macrophages
I.3. Récepteurs de surface, mécanisme de reconnaissance
I.4. Elimination des cellules apoptotiques et homéostasie cellulaire
II. Mécanismes de la phagocytose
II.1. Mécanisme d’entrée des particules à internaliser
II.2. Rôle de la réorganisation du cytosquelette d’actine dans la phagocytose
II.3. Maturation du phagosome
II.4. La phagocytose et la présentation antigénique
III. Historique des études du mécanisme de la phagocytose
III.1. Particules modèles utilisées dans les études de phagocytose in-vitro
III.2. Effet de la taille des particules sur la phagocytose
III.3. Effet de la physico-chimie de surface de la cible sur la phagocytose
III.4. Influence de la forme des particules
III.5. Effet des propriétés mécaniques des particules
III.6. Influence de la densité d’immunoglobulines à la surface
IV. Influence de la mobilité des récepteurs à la membrane du macrophage
Bilan de l’étude du mécanisme de phagocytose
CHAPITRE 2 : EMULSIONS
I. Description générale
II. Agents tensioactifs
II.1. Généralités
II.2. Classes de tensioactifs
II.3. La HLB : Hydrophilic-Lipophilic Balance
III. Modes de déformation des gouttes et interfaces
IV. Techniques d’émulsification
V. Applications des émulsions en pharmacologie
V.1. Administration de principes actifs
V.2. Circulation des émulsions et optimisation de leur durée de vie
V.3. Vectorisation et administration ciblée de principes actifs
VI. Applications des émulsions en biophysique
VII. Gouttes d’émulsions pour l’étude de la phagocytose
Objectifs du travail de doctorat : Vers de nouveaux matériaux
CHAPITRE 3 : SYNTHESE ET CARACTERISATION DES MATERIAUX
I. Choix de la stratégie de fonctionnalisation
II. Matériaux utilisés
III. Réalisation d’émulsions
III.1. Réalisation d’émulsions polydisperses par cisaillement dans un mortier
III.2. Réalisation d’une émulsion monodisperse en utilisant la “Cellule de Couette ”
III.3. Vieillissement de l’émulsion
IV. Fonctionnalisation de la surface
IV.1. Estimation de la quantité de biotine à l’interface des gouttes
IV.2. Visualisation de la présence d’IgGs par microscopie de fluorescence
IV.3. Estimation du temps caractéristique d’attachement des IgGs fluorescents
V. Caractérisation des gouttes fonctionnalisées
V.1. Méthode de détermination de la taille et de la concentration des gouttes
V.2. Quantification de la densité d’IgGs de surface par cytométrie de flux
V.3. Spécificité de l’adsorption des IgGs à la surface des gouttes
V.4. Contrôle de la densité de fonctionnalisation
V.5. Diffusion latérale des IgGs à la surface des gouttes
V.6. Mesure de la tension interfaciale des gouttes
V.7. Mesure du potentiel zêta des gouttes
VI. Fonctionnalisation des billes de polystyrène
VI.1. Fonctionnalisation des billes par des IgGs anti-biotines
VI.2. Saturation de la surface des billes avec des IgGs Lapin anti Chèvre FITC
Conclusion sur les matériaux fonctionnels étudiés
CHAPITRE 4 : PHAGOCYTOSE DES GOUTTES D’EMULSIONS
I. Construction de la chambre d’observation et conditions expérimentales
II. Processus d’internalisation des gouttes d’émulsions
III. Analyse quantitative du processus de phagocytose
III.1. Choix d’une méthode de quantification de l’internalisation
III.2. Cinétique de l’internalisation
III.3. Qu’en est-il des macrophages qui ne phagocytent pas ?
III.4. Spécificité de l’internalisation des gouttes d’émulsions fonctionnalisées
III.5. La spécificité dépend de la taille des objets à internaliser
III.6. La phagocytose dépend de la densité d’immunoglobulines à la surface des gouttes
IV. Rôle de la mobilité latérale des IgGs dans le processus de phagocytose
IV.1. Étude de la phagocytose de billes de polystyrène fonctionnalisées
IV.2. Dynamique des Immunoglobulines à l’interface goutte-cellule
V. Autres observations pendant et après l’internalisation
V.1. Disparition de la fluorescence des gouttes au cours de l’internalisation
V.2. Déformation des gouttes pendant le processus de phagocytose
Conclusion sur la phagocytose des gouttes d’émulsions fonctionnalisées
CONCLUSION
