Imagerie tridimensionnelle multiphotonique des tissus biologiques

Un façonneur programmable: la ligne 4f

   Les façonneurs programmables fournissent beaucoup plus de degrés de liberté que les compresseurs à réseaux et à prismes pour manipuler la formes des impulsions. On peut distinguer deux approches pour réaliser un tel dispositif. La plus ancienne et la plus répandue s’appelle ligne 4f ou « ligne à dispersion nulle ». C’est l’approche que nous employons et elle fait l’objet de cette section. L’autre approche repose sur une interaction acousto-optique longitudinale. Une onde acoustique de forme contrôlée interagit avec les impulsions et permet de manipuler à la fois leur phase et leur amplitude spectrales [39, 40]. Ces filtres dispersifs programmables acousto-optiques (acousto-optic  programmable dispersive filters en anglais ou AOPDF) ne sont néanmoins pas optimaux pour notre application. En effet, le temps de propagation relativement long de l’onde acoustique rend le dispositif peu efficace lorsqu’il est employé avec un oscillateur de grande largeur spectrale dont le taux de répétition est de l’ordre de la centaine de MHz [23]. Il est en revanche parfaitement adapté pour une utilisation avec des lasers dont les taux de répétition sont plus faibles [41], jusqu’à quelques centaines de kiloHertz, auquel cas chaque impulsion voit une nouvelle onde acoustique. Pour un véritable état de l’art des différentes techniques de façonnages programmables,on peut se reporter aux excellents articles de revue de Weiner [42] et Monmayrant et Chatel [43], au guide d’introduction au façonnage d’impulsions de Monmayrant et al. [28] ainsi qu’à la thèse de A. Monmayrant [44]. Les dispositifs de façonnage d’impulsions ultra-brèves sont des générateurs de fonctions à ultra-hautes fréquences, capables de produire des formes arbitraires d’impulsions, dont la durée peut ne compter que quelques oscillations du champ électrique. Comme il n’existe pas de composants électroniques disposant de la bande passante suffisante pour pouvoir manipuler le champ électrique directement dans le domaine temporel, nous sommes contraints d’effectuer le façonnage dans le domaine spectral, en manipulant la phase et / ou l’amplitude spectrale du champ complexe.

Effet des interstices

   Les interstices sont équivalents à des pixels quasi-régulièrement espacés dans le domaine spectral d’un pas ∆Ω, ce qui se traduit dans le domaine temporel par des répliques centrées sur le retard nul et distantes de 2π ∆Ω. Il est possible de s’en affranchir en programmant des impulsions de phases opposées sur le reste du masque de façon à interférer destructivement avec ces répliques [50]. En pratique, les interstices sont régulièrement espacés dans l’espace mais pas en fréquence, ce qui est à l’origine d’un étalement temporel de ces répliques.

Effet de bord

   Les SLM utilisés en pratique ont une excursion de phase qui n’est que légèrement supérieure à 2π. Pour appliquer une phase spectrale supérieure à 2π,on a donc recours au repliement de la phase dans l’intervalle [0, 2π], à l’instar d’une lentille de Fresnel. Cette approche fonctionnerait parfaitement si les bords des pixels étaient parfaitement abrupts, puisque la phase est effectivement définie dans cet intervalle. En pratique, cette approche comporte néanmoins des inconvénients. Considérons par exemple le cas d’un retard pur, associé à une phase spectrale ϕ(ω) = ωτ . La phase repliée dans l’intervalle [0, 2π] est donc une fonction en dents de scie, avec un saut de phase très abrupt lorsque la phase passe brutalement de 2π à 0. Si les bords des pixels du SLM ne sont pas parfaitement abrupts, la phase appliquée en réalité est alors ϕréelle(ω) = ωτ + ϕerreur(ω) où ϕerreur(ω) est l’erreur de phase introduite au niveau des sauts de phase. Cela signifie que ϕerreur(ω) est une fonction périodique de période 2πτ qui se traduira dans le domaine temporel par des répliques distantes de τ . Remarquons que l’importance de ce type de répliques est faible dans le cas d’un masque pixelisé dans la mesure où les transitions d’un pixel à l’autre sont relativement abruptes. L’utilisation d’un façonneur d’impulsions de type 4f avec un masque pixelisé implique donc l’apparition de répliques temporelles dont l’origine est double. La première est purement liée à la nature pixelisé du masque (présence d’interstices et échantillonnage de la phase) tandis que la seconde provient du repliement imparfait de la phase dans l’intervalle [0, 2π] [53]. Remarquons qu’un choix judicieux des optiques de la ligne 4f permet de minimiser l’importance de ces répliques [44], notamment en ajustant la taille de la fenêtre temporelle de façonnage.

Façonnage en phase spectrale

   Nous allons montrer expérimentalement que cette approche permet de faire du façonnage purement en phase sans connaitre précisément la loi de calibration en phase du SLM. Nous utilisons donc une même loi de calibration pour toutes les composantes spectrales. Cette loi est la moyenne des lois de calibration obtenues avec la méthode interférométrique décrite précédemment. Nous caractérisons la phase introduite par le dispositif par interférométrie spectrale par l’intermédiaire de l’interféromètre de Michelson représenté Fig: 1.24. Un diaphragme permet de sélectionner le faisceau diffracté. Nous avons utilisé un spectromètre Acton (Princeton Instruments, USA) avec un temps d’intégration de ∼6 ms. La Fig. 1.30 présente un ensemble de phases spectrales produites avec des masques diffractifs avec une amplitude de diffraction maximale (α(ω) = 1). La Fig. 1.30(a) montre qu’en une itération le SLM compense parfaitement la phase initiale du façonneur, avec une précision qui atteint le bruit de la mesure.

Impact sur une expérience de microscopie non-linéaire

   Effet du façonnage en amplitude Comme nous l’avons décrit à la section 1.4.5,le façonnage en amplitude peut se traduire par une dispersion angulaire entre les différentes composantes spectrales. Après focalisation, cette dispersion se traduit par un décalage des volumes focaux qui ne se superposent plus parfaitement au niveau du foyer de l’objectif de microscope. Cet effet est en réalité totalement négligeable lorsque la transmission varie lentement, c’est-à-dire sur quelques pixels. Seules les composantes spectrales au voisinage des discontinuités sont vraiment impactées: elles sont atténuées et sont focalisés, dans le pire des cas, à un waist du volume focal principal. Décalage des faisceaux Les objectifs de microscope sont conçus pour se rapprocher autant que possible d’une lentille parfaite. En d’autres termes des rayons parallèles, même loin de l’axe de la lentille, se focalisent au foyer. Cette propriété a pour conséquence que les faisceaux parallèles mais décalées en provenance de la ligne 4f, se focalisent tous au niveau du foyer. On peut aussi prendre le point du vue de l’optique de Fourier. En effet, le champ au niveau du plan focal après l’objectif de microscope est la transformée de Fourier du champ du plan focal avec l’objectif et dans la mesure où les champs sont tous colinéaires (il n’ont pas de composante linéaire dans leur phase spatiale), alors, par transformée de Fourier, les taches focales sont toutes centrée en kx = 0. Cependant, cet effet implique que chaque composante spectrale ne surcouvre pas la pupille arrière du microscope de façon à ce qu’elles soient toutes transmises malgré leur décalage relatif. Or il est indispensable de surcouvrir la pupille arrière d’un objectif de microscope pour exploiter pleinement son ouverture numérique. Cet effet réduit donc a priori de façon significative la résolution spatiale d’un microscope multiphoton. Défocalisation La courbure locale de la phase spectrale est à l’origine d’une distance de propagation différente selon la composante spectrale considérée. On note L(ω) l’écart entre les waists des composantes spectrales (Eq. 1.67). Il est donc pertinent d’estimer la distance entre les différents waists, après focalisation

Table des matières

Remerciements
Introduction
1 Façonnage et caractérisation d’impulsions ultra-brèves 
1.1 Introduction 
1.2 Représentation d’une impulsion ultra-brève
1.2.1 Notations
1.2.2 Fonction de transfert
1.3 Les façonneurs historiques 
1.3.1 Matériaux dispersifs (lentille, lame à faces parallèles etc.)
1.3.2 Compresseurs à réseaux et à prismes
1.4 Un façonneur programmable: la ligne 4f 
1.4.1 Principe
1.4.2 Montage expérimental
1.4.3 Les SLM à cristaux liquides
1.4.4 Façonner en amplitude et en phase avec un SLM 2D
1.4.5 Les couplages spatio-temporels
1.4.6 Conclusion
2 Impulsions façonnées et microscopie non-linéaire 
2.1 Introduction
2.2 La microscopie de fluorescence excitée à deux photons
2.2.1 L’absorption à deux photons
2.2.2 Intérêt pour la microscopie
2.3 Excitation sélective et microscopie 2PEF
2.3.1 Intérêt pour l’imagerie biologique
2.3.2 Le signal de fluorescence
2.3.3 Contrôler l’absorption à deux photons
2.3.4 Forme d’impulsion optimale
2.3.5 Conclusion
2.4 Les méthodes de mesure au foyer d’un objectif 
2.4.1 Choix des techniques de caractérisation
2.4.2 Mesure de la durée des impulsions
2.4.3 Balayer la dérive de fréquence
2.4.4 FROG interférométrique
2.4.5 Mesure du spectre à deux photons
2.4.6 Conclusion
2.5 Microscopie d’un échantillon biologique dynamique avec des impulsions façonnées 
2.5.1 Microscopie 2PEF avec impulsions façonnées: état de l’art
2.5.2 Façonnage d’impulsions et commutation rapide
2.5.3 Résultats et discussions
2.5.4 Conclusion sur l’expérience
2.6 Façonnage d’impulsions avec des prismes pour la microscopie à deux photons multiplexée 
2.6.1 Façonner avec des éléments dispersifs
2.6.2 Multiplexage temporel des impulsions
2.6.3 Spectres à deux photons
2.6.4 Microscopie à deux photons sélective d’un embryon en développement
2.7 Microscopie à deux photon multiplexée de trois fluorophores
2.7.1 Imager plus de fluorophores
2.7.2 Multiplexage temporel
2.7.3 Choix des bandes spectrales de détection
2.7.4 Formes des spectres à deux photons
2.7.5 Microscopie d’un échantillon biologique avec trois fluorophores
2.7.6 Conclusion sur l’expérience et perspectives
2.8 Conclusion
3 Mesures optimales 
3.1 Problématique
3.2 Approche classique
3.2.1 Mesurer les fluctuations d’un paramètre du champ électrique
3.2.2 La détection homodyne
3.3 Une mesure optimale 
3.3.1 La borne de Cramér-Rao
3.3.2 La détection homodyne: une mesure optimale
3.3.3 Interprétation
3.4 Quelles mesures envisager ?
3.4.1 Une mesure optimale de distance dans le vide
3.4.2 Plusieurs mesures optimales indépendantes dans un milieu dispersif
3.4.3 Synthèse des modes de mesure
3.4.4 Critère de fidélité
3.5 Comment façonner les modes de mesure ? 
3.5.1 Pourquoi nous n’allons pas utiliser un façonneur 4f
3.5.2 Façonner avec des milieux biréfringents
3.6 Simulations numériques 
3.6.1 Hypothèses et paramètres
3.6.2 Un unique compensateur de Babinet-Soleil-Bravais en Quartz
3.6.3 Deux BSB: l’un en Quartz et l’autre en KDP
3.6.4 Un versus deux BSB
3.6.5 Conclusion
3.7 Mise en œuvre expérimentale
3.7.1 Problématique
3.7.2 Comment mesurer la fonction de transfert d’un BSB ?
3.7.3 Composants optiques et source laser
3.7.4 Résultats
3.7.5 Conclusion
3.8 Conclusion 
Conclusion
Références bibliographiques

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