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La bioluminescence : une technique lumineuse
La bioluminescence ou « lumière du vivant » est l’émission de lumière visible par des organismes vivants. Cette étonnante propriété a intrigué divers auteurs, cela depuis l’antiquité avec Aristote et Pline l’Ancien, dont les écrits rapportent le phénomène. Il s’est ainsi accumulé d’importantes observations, les cas de bioluminescence étant très abondants. Chez les animaux de très nombreuses classes d’invertébrés présentent le phénomène de bioluminescence, par contre, chez les vertébrés seuls certains poissons possèdent cette particularité. De plus, la bioluminescence est majoritairement représentée en milieu marin où, en profondeur, elle prend un caractère banalement commun puisque 95% des espèces se situant à 4000 mètres de profondeur possèdent cette capacité.
La lumière émise résulte de réactions chimiques qui activent une molécule susceptible d’émettre un photon. La découverte du premier système photochimique par Raphaël Dubois en 1887, laissait supposer l’universalité du processus. Depuis, les recherches ont fait apparaître la grande diversité des structures chimiques. Aujourd’hui plus d’une trentaine de systèmes différents ont été identifiés et décrits.
Biologie de la bioluminescence
Au cours de l’évolution la bioluminescence a indépendamment évolué de nombreuses fois ; ainsi les gènes responsables de la bioluminescence sont très différents d’un organisme à un autre. Chimiquement toutes les réactions de bioluminescence sont exergoniques, se réalisent en présence de dioxygène, les substrats (luciférines) et les enzymes (luciférases) sont très variés. La conséquence de ces réactions est l’émission de photons de lumière visible (énergie d’environ 50kcal). Outre l’organisation structurale de la luciférine, de nombreux facteurs semblent influencer la couleur de la lumière émise comme l’enchaînement des acides aminés de la luciférase ou la présence de protéines accessoires (comme la GFP). Cette dernière est aujourd’hui utilisée dans les modèles de bioluminescence comme gène rapporteur en co-expression avec la luciférase. De même des facteurs comme la cinétique ou la modalité (flashs, lumière continue…) d’émission de la lumière peuvent varier d’un système à l’autre.
Réaction chimique conduisant à l’émission de photons
La biologie cellulaire et la régulation de la bioluminescence varient selon les différents groupes. Tandis que les bactéries et quelques autres systèmes émettent de la lumière en continu, la plupart émettent la lumière en flashs dont la durée varie de 0,1 à 1 seconde. Cette rapidité réactionnelle nécessite un recyclage enzymatique rapide avec des réactifs mobilisés et isolés instantanément, ce qui implique une localisation de la réaction biochimique, au niveau du réticulum endoplasmique ainsi que des péroxysomes . Chaque fois qu’un photon de lumière visible est émis à la température de la pièce, par un organisme vivant, la réaction responsable du passage par un état excité, suivi de l’émission d’un photon, est un processus très exergonique. En effet, si l’on prend l’exemple, d’un photon dans la lumière verte (≈500nm) l’énergie associée correspond à 60kcal par mole. La réaction chimique que subit la luciférine est une réaction d’oxydation, ainsi elle conduit à l’obtention d’un produit : l’oxyluciférine. Cette réaction se déroule en plusieurs étapes et est caractérisée par un état de transition excité électroniquement généralement noté P*. Il est défini par l’énergie qu’il porte et sa durée de vie qui est extrêmement courte. Cette dernière n’est que de quelques nanosecondes et ne peut être différenciée du simple état d’excitation .
Dans une réaction in vitro luciférase / luciférine, les événements cinétiques se produisent sur une échelle de temps extrêmement brève. Ainsi pour étudier le phénomène il est commode d’utiliser le système chimique adapté à la bioluminescence le plus simple possible : la décomposition des dioxétanones (bioluminescence de l’aéquorine, isolée de certaines méduses) (Figure 01 B). Cette réaction passe par des composés péroxydiques riches en énergie et se poursuit pour former du CO2 et un composé carbonylique excité, libérant à son tour une grande énergie. Bien que cette cascade de réactions chimiques n’ait été prouvée que dans le cas de certains modèles, aujourd’hui elle reste l’hypothèse d’explication de la réaction de bioluminescence, y compris dans les cas de bioluminescence par les lucioles, les cnidaires, ou encore les bactéries, qui n’impliquent pas d’intermédiaire réactionnel de type dioxétanone .
Différentes hypothèses ont alors été émises pour expliquer cette réaction dont celle du passage de l’état d’excitation à un autre fluorophore conduisant à l’émission des photons avec une énergie plus grande (Figure 01 C). Cependant cette hypothèse ne peut être considérée comme satisfaisante, car la production de photons trouve son origine dans un produit ou un composé intermédiaire directement lié à l’enzyme. La luciférase peut elle-même influer sur le spectre d’émission en modifiant l’environnement du chromophore et donc ses états d’excitation. Chez la luciole, la substitution de certains acides aminés de la luciférase conduit à un décalage important dans le spectre d’émission. Chez les bactéries et les cnidaires, les chromophores de protéines accessoires associées aux luciférases peuvent servir d’émetteurs alternatifs .
Importante diversité des systèmes luminescents
Dans la nature on peut trouver de très nombreux systèmes luminescents (luciférase et luciférine) fonctionnant de façon complètement différente .
Cas des bactéries bioluminescentes
La bioluminescence bactérienne est un parfait exemple de réaction biochimique n’impliquant pas d’intermédiaire de type dioxétanone. La luciférase catalyse l’oxydation d’un aldéhyde à longue chaîne carbonée et d’une flavine mono nucléotidique réduite, FMNH2 (Figure 02 A). La première étape de la réaction catalytique est la formation d’un complexe hydropéroxyde de flavine-luciférine . Lors d’une seconde étape, l’aldéhyde réagit avec ce complexe pour former un intermédiaire dont la durée de vie détermine la cinétique de la réaction. L’émetteur identifié grâce à son spectre d’émission est le complexe enzyme-(4a-hydroxyflavine). Les luciférases de toutes les bactéries bioluminescentes connues sont des hétérodimères. Elles sont codées par les gènes lux A et lux B, adjacents, dans un opéron lux . Cet opéron contient également les gènes lux C, lux D et lux E qui codent pour des protéines qui interviennent dans la synthèse de l’aldéhyde. Lux A et lux B ont été clonés et exprimés en système hétérologue afin d’être utilisés comme gènes rapporteurs. La caractérisation de ce système a permis de mettre en évidence un mode de communication intercellulaire. Les bactéries sécrètent une molécule diffusible, appelée auto-inducteur, qui agit comme une phéromone. Lorsque la concentration en auto inducteur est telle qu’elle induit l’expression des gènes de l’opéron lux, les bactéries deviennent bioluminescentes . Ainsi en détectant le niveau d’auto inducteur, les cellules sont capables d’estimer leur densité et d’initier les processus comme l’expression de la luciférase et de ses partenaires, seulement lorsqu’elles sont suffisamment nombreuses pour être vues.
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Table des matières
RESUME
ABSTRACT
ABREVIATIONS
TABLE DES FIGURES
REVUE DE LA LITTERATURE
I – LA BIOLUMINESCENCE : UNE TECHNIQUE LUMINEUSE
A – BIOLOGIE DE LA BIOLUMINESCENCE
1 – Réaction chimique conduisant à l’émission de photons
2 – Importante diversité des systèmes luminescents
a – Cas des bactéries bioluminescentes
b – Cas des cnidaires bioluminescents
c – Cas des dinoflagellés bioluminescents
d – Cas des insectes bioluminescents
B – LA LUCIFERINE SUBSTRAT DE LA REACTION ENZYMATIQUE
1 – Bio distribution de la luciférine et cinétique du signal lumineux in vivo
2 – Les dérivés de la luciférine
3 – L’oxyluciférine, produit de la réaction luciférase – luciférine, peut être régénérée en luciférine par voie enzymatique
C – LA LUCIFERASE, ENZYME DE LA REACTION
1 – Analyse nucléotidique et protéique de la luciférase de Photinus pyralis
2 – Origine et évolution moléculaire de la luciférase
3 – Le Coenzyme A : effecteur de la luciférase
4 – Analyse cristallographique de la luciférase
a – Structure générale de la luciférase
b – Site actif de la luciférase
D – UTILISATION PRATIQUE DE LA BIOLUMINESCENCE
1 – Les origines structurales de la couleur dans la bioluminescence
2 – Applications de la bioluminescence dans les biotechnologies et la recherche biomédicale
3 – Interférence du rayonnement cosmique avec le signal de bioluminescence
a – Les sources du rayonnement cosmique
b – La nature des rayonnements cosmiques
c – Détection des rayonnements cosmiques
4 – Dispositif technique de mesure de la bioluminescence : du photon à l’électron
a – Principe de fonctionnement
b – Mouvement des charges et lecture du signal
c – Le cumul des charges ou « binning »
(i) Le binning de lignes
(ii) Le binning de pixels
d – Signal de sortie et sensibilité spectrale
e – Les perturbations du signal : le bruit de fond
(i) Bruit de motif (Fixed Pattern Noise FPN).
(ii) Bruit de grenaille (Shot Noise SN) ou bruit quantique.
(iii) Bruit de grenaille du courant d’obscurité (Dark Shot Noise DSN).
(iv) Bruit de lecture (Readout Noise RN).
II – LE RITUXIMAB : UN ANTICORPS ANTI-CD20 DANS LES LYMPHOPROLIFERATIONS B.
A – UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX RECOMBINANTS EN CANCEROLOGIE
B – LES DIFFERENTES GENERATIONS D’ANTICORPS
C – APPROCHE THERAPEUTIQUE DES CANCERS PAR IMMUNOTHERAPIE
1 – Utilisation d’anticorps nus : immunothérapie classique
2 – Utilisation d’anticorps couplés à un élément radioactif ou à une toxine
D – LE CD20 : UNE CIBLE ANTIGENIQUE DE CHOIX DANS LES LYMPHOMES NON HODGKINIENS
1 – Qualités d’une bonne cible antigénique en immunothérapie passive
2 – Structure, fonction et signalisation du CD20
3 – Modulation d’expression du CD20 : enjeux et conséquences
a – Densité antigénique naturelle et cytotoxicité des anticorps
b – Modulation de l’expression par les cytokines
4 – Le rituximab : anticorps monoclonal anti-CD20
a – Lymphome folliculaire non hodgkinien
b – Lymphome non hodgkinien agressif diffus à grandes cellules B
E – MODE D’ACTION DU RITUXIMAB SUR LES CELLULES CANCEREUSES
1 – Effets biologiques après la liaison à l’antigène
a – Translocation du CD20 dans les radeaux lipidiques
b – « Shaving » du CD20 par les effecteurs FcγRI+
2 – La liaison du rituximab sur le CD20 induit la voie de l’apoptose
3 – Fonctions effectrices liées à la portion Fc du rituximab
a – CDC : la voie d’activation du Complément
b – Recrutement d’effecteurs cellulaires
F – PHARMACOCINETIQUE DU RITUXIMAB ET FACTEURS DE VARIABILITE DANS LA REPONSE CLINIQUE AU TRAITEMENT
1 – Pharmacocinétique du rituximab
2 – Facteurs influençant la pharmacocinétique du rituximab
a – Influence du niveau de l’expression en CD20 par les cellules tumorales
b – Influence de la masse tumorale sur la réponse clinique
c – Influence des polymorphismes génétiques sur la pharmaco-cinétique du rituximab
G – LE FCRN, OU RECEPTEUR NEONATAL AU FRAGMENT FC, RESPONSABLE DE LA DEMIE VIE DU RITUXIMAB
1 – Les rôles biologiques du FcRn
a – Le rôle de récepteur néonatal du FcRn
b – Le rôle dans l’homéostasie des IgG
2 – La protéine FcRn et le gène FCGRT
3 – Site de liaison entre le FcRn et les IgG
4 – Dépendance conformationnelle du site d’interaction entre FcRn et IgG
5 – Rapport entre les sites d’interaction Fc/FcγRs et Fc/FcRn
III – CONCLUSION
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