Imagerie par resonance des plasmons de surface pour l’analyse simultanee de multiples interactions biomoleculaires en temps reel

Les progrès enregistrés dans la connaissance du génome humain au cours des deux décennies écoulées ont rendu possible, parmi de nombreuses autres retombées, l’analyse d’un nombre toujours croissant de gènes responsables de maladies. Parallèlement, depuis que le génome humain a été décodé, le domaine de la protéomique, qui est l’étude de l’ensemble des protéines fabriquées par les gènes, a émergé. Les protéines sont les acteurs essentiels des mécanismes cellulaires, et leur dysfonctionnement entraîne de nombreuses maladies. Compte tenu du grand nombre de fonctionnalités qui vont devoir être criblées, le défi technologique à relever est considérable, puisqu’il s’agit de substituer à des techniques manuelles telles les analyses ELISA, et donc coûteuses, des méthodes efficaces permettant le criblage à grande échelle des variations individuelles. Le développement de systèmes ad hoc automatisés à forte capacité et haut débit, tels que les puces immunologiques, constituées par une multitude de protéines ancrées sur un support approprié, les puces à ADN ou même les puces à oligosaccharides s’impose comme une priorité.

De par l’aspect multiparamétrique de ces biopuces, ces techniques constituent un apport important à la biologie moléculaire. En revanche, souvent, il reste nécessaire de marquer les molécules cibles par fluorescence ou radioactivité afin de pouvoir les détecter, ce qui ajoute une étape au procédé et ne permet pas, de manière immédiate, le suivi de la réaction en temps réel. Le système optique que nous développons apporte des améliorations très sensibles par rapport aux systèmes classiques. En effet, il permet d’acquérir, en parallèle, sur chaque plot, la réponse cinétique des interactions biologiques mesurées et, de surcroît, sans avoir recours à des marqueurs. En d’autres termes, l’évolution des multiples interactions peut être suivie en temps réel et permet donc de mesurer les constantes d’association, de dissociation et d’affinité des espèces biomoléculaires et donc de caractériser leur fonctionnalité. Bien sûr, la réalisation de tels biocapteurs, de plus en plus perfectionnés et possédant des fonctionnalités multiples, nécessite la contribution d’acteurs d’origines différentes, conférant au projet un caractère pluridisciplinaire à travers les nombreuses collaborations développées avec d’autres équipes de recherche. Les différentes disciplines complémentaires mises en jeu sont, entre autres : chimie, biochimie, biologie, informatique, électronique, mécanique et optique.

Dans le système que nous avons développé, nous utilisons la résonance des plasmons de surface. De par sa mise en œuvre simple et sa sensibilité, le phénomène des plasmons de surface a été appliqué, dès le début des années quatre-vingt, à la reconnaissance d’interactions biologiques. Les années quatre-vingt dix ont vu naître un grand nombre de capteurs biochimiques alliant la résonance des plasmons de surface à une chimie préparant la couche réceptrice biosensible. Certains capteurs, plus spécifiques, se sont restreints à la reconnaissance de macromolécules comme les protéines, pour déboucher sur une instrumentation commercialisée notamment par Biacore sous le nom de BIAcore et BIAcore 3000. Cette société a réalisé des monocapteurs performants mais qui, malheureusement, ne permettent de réaliser qu’une à trois mesures à la fois (plus une mesure de référence).

PRINCIPALES METHODES DE MESURE 

Le nombre important de techniques utilisées dans le contexte des analyses biomoléculaires nous contraint à ne décrire que les méthodes les plus couramment utilisées : guides d’ondes, interféromètres Mach-Zehnder intégrés, miroirs résonants, microbalances à quartz, tests ELISA et microscopie de fluorescence. Premièrement, nous allons décrire les dispositifs basés sur les ondes évanescentes dont font partie les biocapteurs SPR qui seront décrits par la suite.

Méthodes optiques évanescentes directes 

Une onde évanescente est obtenue lorsque l’onde incidente, issue du milieu le plus réfringent (prisme, réseau ou structure guidante), arrive sur l’interface sous un angle d’incidence supérieur à l’angle de réfraction limite . L’amplitude de l’onde évanescente décroît exponentiellement en fonction de sa distance à l’interface et a donc la propriété intéressante d’être confinée au voisinage de l’interface (sur une profondeur ∆Zc, définie comme la distance à laquelle l’intensité tombe à 1/e du maximum, dans la Figure 2), siège des interactions biomoléculaires et donc de ne pas être sensible aux perturbations situées hors de cette limite. L’utilisation des champs évanescents permet donc de sonder en temps réel les changements d’indice de réfraction, d’épaisseur de couche, d’adsorption et de fluorescence causés par des réactions se produisant à une distance d’au plus quelques centaines de nanomètres de la surface. L’adsorption de molécules sur l’interface va perturber la propagation de l’onde évanescente, entraînant des variations de phase et d’amplitude du faisceau réfléchi. Aucun marqueur n’est nécessaire pour effectuer ces mesures, ce qui classe ces capteurs dans la catégorie des biocapteurs directs. De plus, ces mesures ne perturbent pas l’interaction et ne nécessitent pas d’étape supplémentaire : les interactions peuvent donc être suivies en temps réel.

Les guides d’ondes, les interféromètres intégrés Mach-Zehnder, les miroirs résonants et la SPR sont les techniques optiques évanescentes les plus courantes dans le domaine des biocapteurs.

Autres méthodes

Les biocapteurs ne sont pas tous basés sur les ondes évanescentes. D’autres procédés sont aussi très développés comme les microbalances à quartz, mais surtout, les tests immunologiques basés sur les enzymes (ELISA), très populaires depuis les années 80 et la microscopie de fluorescence qui reste le biocapteur de référence.

Microbalance à quartz (QCM) 

La microbalance utilise une lame de quartz extrêmement fine sur laquelle est fixée une électrode de platine ou d’or de chaque coté. Le quartz est un cristal piézoélectrique, c’est-àdire qu’une pression appliquée sur ce cristal induit une différence de potentiel électrique entre ses faces.

En appliquant une différence de potentiel sinusoïdale à une certaine fréquence, nous allons créer une onde acoustique qui se propage à l’intérieur du cristal avec une amplitude parallèle à la surface du cristal. Nous allons donc induire un mouvement des 2 faces portant les électrodes à cette même fréquence, dite fréquence de résonance. Or, cette fréquence de résonance dépend de l’épaisseur du support, de sa structure chimique, de sa forme ainsi que de sa masse. C’est pourquoi le cristal doit être coupé selon une direction précise par rapport aux axes cristallographiques.

Microscopie de fluorescence

Les biocapteurs basés sur la fluorescence sont non seulement très répandus mais aussi très divers. Nous ne prétendrons pas en faire une description exhaustive dans cette sous-partie mais nous contenterons de détailler de manière générale les dispositifs en champ lointain, commerciaux, en omettant ceux en champ proche (spectroscopie de corrélation de fluorescence [30], fluorescence excitée par plasmons de surface [31],…).

La microscopie de fluorescence en champ lointain est basée sur l’utilisation d’une biopuce, c’est-à-dire un substrat fonctionnalisé avec de nombreuses sondes différentes. Comme pour les tests ELISA, la procédure d’utilisations comprend deux principales étapes : l’interaction puis la lecture. L’interaction consiste en l’injection sur la biopuce de la solution test contenant les cibles marquées par un fluorophore, suivie de l’élimination des cibles non liées par une solution de rinçage. Le nombre de molécules ayant réagi est ensuite déduit de la mesure de l’intensité de fluorescence. Ce principe de base connaît de nombreuses variantes. Par exemple, le marquage peut se faire sur une molécule secondaire   qui va reconnaître les cibles qui se sont fixées ou alors, plusieurs fluorophores différents peuvent être utilisés. Cette méthode, dont le principe est très simple, permet une automatisation et une mise en parallèle des mesures très poussées : Affymetrix [32], leader dans le domaine des biopuces, propose des matrices de 500 000 plots inclus dans une surface de 1,28cm² , soit un plot tous les 16 µm. De nos jours, la fluorescence reste la méthode de référence pour la mesure d’interactions biomoléculaires, de par sa sensibilité ainsi que sa capacité d’analyses simultanées d’un très grand nombre de données, malgré la nécessité du marquage des cibles.

Entre les méthodes directes analysant une interaction biomoléculaire en temps réel et les méthodes indirectes analysant le résultat de nombreuses interactions biomoléculaires, nous comprenons tout l’intérêt que pourrait susciter un nouveau système couplant les avantages des deux méthodes, c’est-à-dire capable d’analyser en temps réel de nombreuses interactions. Nous allons maintenant détailler la résonance des plasmons de surface qui permet d’apporter cette solution.

Table des matières

INTRODUCTION
I. ETAT DE L’ART
I.1. PRINCIPALES METHODES DE MESURE
I.1.1. Méthodes optiques évanescentes directes
I.1.1.1. Guide d’onde
I.1.1.2. Interféromètre Mach-Zehnder intégré
I.1.1.3. Miroir résonant
I.1.2. Autres méthodes
I.1.2.1. Microbalance à quartz (QCM)
I.1.2.2. ELISA
I.1.2.3. Microscopie de fluorescence
I.2. RESONANCE DES PLASMONS DE SURFACE (SPR)
I.2.1. Historique
I.2.2. Théorie
I.2.2.1. Interface métal/diélectrique
I.2.2.2. Couplage de l’onde incidente
I.2.2.3. Description qualitative de la résonance des plasmons de surface
I.2.2.4. Amplification des variations de réflectivité
I.2.3. Monocapteurs
I.2.3.1. Interrogation angulaire
I.2.3.2. Interrogation spectrale
I.2.4. Imagerie et multicapteurs
I.2.4.1. Protocole expérimental type
I.2.5. Sensibilité théorique
I.2.5.1. Couplage par prisme
I.2.5.2. Couplage par réseau
I.2.6. Amélioration de la sensibilité de détection
I.2.6.1. Evolution de la phase de l’onde réfléchie
I.2.6.2. Méthode sandwich
I.2.6.3. Spectrométrie de masse
I.3. COMPARAISON DES DIFFERENTES METHODES
I.3.1. Avantages et inconvénients des méthodes optiques directes
I.3.1.1. Absence de marquage
I.3.1.2. Mesure en temps réel
I.3.1.3. Détection en parallèle
I.3.1.4. Sensibilité
I.3.2. Performances des différents biocapteurs
II. DEVELOPPEMENT D’UN BIOCAPTEUR PAR IMAGERIE SPR
II.1. PREPARATION DE L’INTERFACE
II.1.1. Composition du transducteur
II.1.1.1. Critères de sélection du métal
II.1.1.2. Résonance des plasmons de surface sur Ag, Au, Cu et Al
II.1.2. Fonctionnalisation du capteur
II.1.2.1. Auto-assemblage moléculaire
II.1.2.2. Pyrrole
II.1.2.2.1. Electrocopolymérisation
II.1.2.2.2. Couplage
II.1.2.2.3. Structuration en plots
II.1.2.2.4. Avantages
II.2. OPTIMISATION ET CHOIX DES ELEMENTS DU BANC
II.2.1. Source de lumière
II.2.1.1. Longueur d’onde
II.2.1.2. Largeur spectrale, cohérence temporelle et divergence
II.2.2. Balayage angulaire
II.2.3. Fluidique
II.2.3.1. Pompe
II.2.3.2. Injection des échantillons
II.2.3.3. Cellule d’interactions
II.2.4. Prisme
II.2.4.1. Critères de sélection
II.2.4.1.1. Simplicité du système optique
II.2.4.1.2. Minimalisation des aberrations
II.2.4.2. Simulation des différentes configurations
II.2.4.2.1. Limitations technologiques
II.2.4.2.2. Choix de la configuration
II.2.5. Imagerie et caméra
II.2.6. Récapitulatif
II.3. AUTOMATISATION ET TRAITEMENT DES DONNEES
II.3.1. Caractérisation des lames
II.3.1.1. Conversion des niveaux de gris en variation de réflectivité
II.3.1.2. Ajustement des courbes de réflectivité en fonction de l’incidence
II.3.2. Quantification des prises
II.3.2.1. Conversion de ∆R en taux de recouvrement surfacique Γ
II.3.3. Etude des cinétiques
II.3.3.1. Modèle théorique monovalent
II.3.3.2. Ajustement des mesures en temps réel
II.3.3.3. Détermination des constantes d’affinité
II.3.3.4. Limitations du modèle
II.3.4. Automatisation
II.3.4.1. Reconnaissance des plots
II.3.4.2. Mesure de la réflectivité en fonction de l’angle d’incidence
II.3.4.3. Mesure des cinétiques
II.3.4.4. Analyse des résultats
II.4. CONCLUSION
III. APPLICATIONS DE L’IMAGERIE SPR
III.1. ACIDES DESOXYRIBONUCLEIQUES
III.1.1. Généralités
III.1.1.1. Structure de l’ADN
III.1.1.2. Hybridation et dénaturation
III.1.1.3. Intérêt biomédical des puces à ADN
III.1.2. Interactions ADN/ADN liées au gène κ-ras
III.1.2.1. Description du matériel utilisé
III.1.2.2. But de l’expérience
III.1.2.3. Résultats
III.1.2.3.1. Spécificité
III.1.2.3.2. Détection de mutations ponctuelles
III.1.2.3.3. Vers un outil de diagnostique
III.1.2.3.4. Dénaturation et réutilisation
III.1.2.4. Récapitulatif
III.2. PROTEINES
III.2.1. Contexte
III.2.1.1. De l’ADN à la protéine : l’expression génétique
III.2.1.2. Le système immunitaire
III.2.1.2.1. Structure des immunoglobulines
III.2.1.2.2. Exemple de reconnaissance immune : les tests de grossesse
III.2.1.3. Cancer et contrôle du cycle cellulaire
III.2.2. Interactions anticorps/antigène liées à l’hormone de grossesse
III.2.2.1. Matériel et méthodes
III.2.2.2. Résultats
III.2.2.2.1. Détection d’antigènes humains et de lapins
III.2.2.2.2. Détection de l’hormone de grossesse
III.2.2.3. Récapitulatif
III.2.3. Activité de liaison à l’ADN double-brin de la p53
III.2.3.1. Description du matériel utilisé
III.2.3.2. Puce à ADN universelle
III.2.3.3. But des expériences
III.2.3.4. Protocole expérimental
III.2.3.5. Résultats
III.2.3.5.1. Hybridation des séquences zip-codes
III.2.3.5.2. Reconnaissance des ADN cibles doubles-brins par la p53
III.2.3.5.3. Calcul des affinités entre la p53 et les ADN cibles
III.2.3.6. Récapitulatif
CONCLUSION

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