Imagerie grand champ en anatomopathologie

Présentation de la problématique scientifique

L’optique est la science qui s’intéresse à l’ensemble des phénomènes associés à l’émission, la transmission, la manipulation, la détection et l’utilisation de la lumière. La compréhension des phénomènes lumineux permet de développer des instruments qui contrôlent la propagation de la lumière. Il est alors possible de voir ce qui est invisible à l’œil humain, depuis l’infiniment lointain jusqu’à l’infiniment petit. En particulier, la microscopie optique s’est développée avec la volonté d’observer le vivant. Aujourd’hui, le microscope optique en champ clair est devenu la méthode de référence pour le diagnostic clinique in vitro. Cet outil permet d’observer en détail des échantillons biologiques après coloration, mais le champ d’observation est limité (ex. : champ d’observation ≈ 1mm avec un objectif ×20, Ouverture Numérique ON = 0, 75 , résolution spatiale ≈ 0, 3µm). Les échantillons observés en anatomopathologie (lames de tissu) ou en cytologie (étalement de cellules) ne peuvent donc pas être observés sur une seule image avec la technique de référence.

Une des priorités de la recherche biomédicale est d’améliorer la prise en charge anatomoclinique, notamment en apportant aux médecins des outils d’aide au diagnostic. Dans cette optique, ce projet de recherche démarre d’une problématique scientifique large : comment obtenir rapidement (< quelques minutes) des images grand champ (> 1cm2) et multi-échelles d’échantillons anatomocytopathologiques. Le but étant de développer une technique qui viendrait en complément de la méthode conventionnelle, à savoir la microscopie en champ clair sur échantillons colorés, et qui doit pouvoir s’insérer dans un contexte clinique. Afin de préciser les contraintes liées à un tel environnement, attardons-nous d’abord sur la discipline d’anatomocytopathologie.

Présentation du contexte : l’anatomocytopathologie

L’anatomocytopathologie est une spécialité médicale basée sur l’analyse macroscopique, et surtout microscopique d’une biopsie ou d’une pièce opératoire. Cet examen permet d’établir le diagnostic et d’orienter la prise en charge clinique du patient. Pour un prélèvement de liquide pathologique (cytologie), les cellules sont étalées sur une lame de microscope puis colorées. En ce qui concerne les prélèvements de tissus (anatomopathologie), on peut distinguer deux procédures :
— Pour un examen standard, la pièce opératoire est plongée dans un liquide fixatif pendant plusieurs heures. Après inclusion en paraffine, et coupe au microtome, l’échantillon est coloré et déposé sur une lame de microscope. La préparation de la lame de tissu nécessite au moins 48 heures, souvent plus si l’échantillon prélevé est volumineux.
— Lors d’un examen extemporané, le médecin anatomopathologiste doit préparer et examiner une biopsie pendant que le patient est en salle d’opération. Ce type d’examen est demandé par le chirurgien lorsqu’il/elle a besoin d’une analyse anatomopathologique pour décider de la suite d’une opération. Par exemple, le chirurgien veut savoir si une tumeur a été retirée avec suffisamment de marge. Le médecin anatomopathologiste dispose alors de moins de 30 minutes pour préparer et analyser les lames de tissu. Pour ce faire, la biopsie est congelée et découpée au cryotome, puis déposée sur une lame et colorée pour être examinée au microscope. Les lames obtenues après congélation sont souvent de moins bonne qualité que celles obtenues avec l’inclusion en paraffine, et l’examen extemporané doit toujours être complété par un examen anatomopathologique standard.

Les lames de tissu ou de cellules sont observées visuellement au microscope en champ clair, qui est la méthode de référence dans la discipline. L’examen au microscope consiste en une analyse multi-échelle. L’échantillon est d’abord observé à faible grossissement (ex : ×5) afin d’évaluer la structure et l’organisation du tissu en champ large. Le médecin repère alors les zones d’intérêt et utilise des objectifs à plus fort grossissement (e.g. ×20 ou ×40) pour regarder en détail les cellules et les noyaux. Cependant, le champ de vision est limité à quelques centaines de micromètres lorsque le médecin utilise un fort grossissement, ce qui nécessite de scanner manuellement l’échantillon si la zone pathologique est étalée. Des solutions commerciales ont été développées pour aider l’analyse visuelle du médecin. Ainsi, les scanners de lame permettent l’acquisition d’une image haute résolution de toute la lame de tissu, fournissant une image numérique multi-échelle [1]. Cette technologie a permis le développement de traitements numériques pour identifier et segmenter des zones d’intérêt dans l’image, aidant ainsi le médecin à repérer rapidement les zones pathologiques [2]. Par ailleurs, les images de lames numériques ont permis l’essor de la télépathologie. En effet, lorsque l’avis d’un confrère est nécessaire, les médecins anatomopathologistes peuvent s’échanger plus facilement et plus rapidement les images des lames plutôt que de s’envoyer les échantillons par courrier. En outre, la télépathologie peut se révéler particulièrement bénéfique pour la formation de médecins anatomopathologistes [3], pour la recherche, ou pour le diagnostic dans des zones géographiques manquant de médecins spécialisés [4]. Ainsi, la discipline s’oriente vers une transition numérique, mais les scanners de lame sont encore trop chers pour de nombreux laboratoires d’anatomopathologie.

La compréhension du protocole anatomoclinique nous aide à dresser un cahier des charges pour élaborer un outil d’imagerie d’aide au diagnostic anatomopathologique. Scherf et Huisken ont imaginé les propriétés du microscope du futur dédié à l’observation d’échantillons biologiques, qui serait « intelligent » et minimalement invasif [5]. Les nouvelles techniques de microscopie devraient ainsi résulter d’un compromis entre résolution spatiale, préservation de l’échantillon, Rapport Signal sur Bruit (RSB) et rapidité d’acquisition de l’image . Rajoutons à ces critères les paramètres suivants : champ d’observation, profondeur de champ, rendu des couleurs .

L’analyse anatomopathologique est principalement de nature morphologique, grâce à la coloration de la lame de tissu. Le rendu des couleurs joue donc un rôle important dans l’interprétation du spécimen. Cependant, cette étape de préparation de l’échantillon est fortement opérateur-dépendante, et la concentration en colorant varie selon les habitudes du médecin anatomopathologiste. En outre, certaines colorations spécifiques sont coûteuses. De plus, une fois l’échantillon marqué, on ne peut plus y appliquer des méthodes complémentaires d’analyse quantitative. Plusieurs techniques d’imagerie sont en développement afin d’observer un objet biologique sans marquage, le but étant d’affecter le moins possible l’échantillon. Pour un objet non coloré, l’information d’intérêt est contenue dans l’image de phase, qui peut fournir des informations quantitatives sur l’épaisseur et l’indice de réfraction de l’objet [6]. Il peut donc être intéressant de développer une méthode d’imagerie qui puisse observer à la fois des échantillons colorés, pour être compatible avec les protocoles standard de préparation des échantillons, et non colorés.

La profondeur de champ a peu d’importance pour les lames d’anatomocytopathologie. En cytologie, le médecin observe un étalement monocouche de cellules. Pour un examen standard en anatomopathologie, les coupes de tissu mesurent ≈ 4µm d’épaisseur et il y a donc peu de contraintes sur la profondeur de champ. Toutefois, les lames d’examen extemporané sont plus épaisses (≈ 15µm) car le tissu est plus difficile à couper, et l’analyse de la lame est plus compliquée. Il pourrait donc être intéressant de pouvoir observer des coupes plus épaisses, qui seraient plus faciles à préparer. Il faudrait alors prendre en compte la profondeur de champ de la méthode d’imagerie.

Ce projet de recherche s’intéresse donc au développement d’une nouvelle technique complémentaire de la microscopie en champ clair, qui est le standard de référence en anatomopathologie. Elle fournit au médecin une résolution suffisante pour observer les noyaux des cellules, mais un champ d’observation trop faible pour pouvoir analyser l’échantillon en une seule fois (voir Tableau 1.1). Nous visons donc à développer une méthode d’imagerie :
• grand champ (cm2),
• multi-échelle afin de pouvoir observer les cellules et leurs noyaux (≈ µm − cm),
• simple,
• rapide pour pouvoir être utilisée lors d’un examen extemporané,
• à moindre coût pour être accessible au plus grand nombre de laboratoires,
• compatible avec les techniques de préparation standard des lames d’anatomopathologies, ou alors doit pouvoir fonctionner sur des échantillons plus simples et/ou plus rapides à préparer (ex : ne nécessite pas de coloration, fonctionne avec des coupes épaisses faciles à couper).

Table des matières

1 Introduction
1.1 Présentation de la problématique scientifique
1.2 Présentation du contexte : l’anatomocytopathologie
1.3 Observation d’échantillons biologiques
1.3.1 Imagerie d’échantillons marqués
1.3.2 Imagerie d’échantillons non marqués
1.3.3 Systèmes hybrides : co-conception optique et traitements d’images
1.4 Présentation des travaux de thèse
2 Imagerie sans lentille d’échantillons denses
2.1 Principes de l’imagerie sans lentille
2.1.1 Introduction
2.1.2 Formation de l’hologramme
2.1.3 Reconstruction holographique
Cas idéal : la phase au niveau du capteur est connue
Cas réel : la phase au niveau du capteur n’est pas connue
Cas des objets denses
2.2 Reconstruction holographique d’objets denses
2.2.1 Description de l’algorithme
2.2.2 Convergence
2.2.3 Interprétation de l’algorithme
2.2.4 Résultats de simulations
2.3 Discussion
3 Mise en œuvre expérimentale
3.1 Acquisition des hologrammes
3.1.1 Description du banc expérimental
3.1.2 Chaîne d’acquisition
3.1.3 Correction de l’inclinaison et balayage XY
3.2 Performances globales
3.2.1 Caractérisation avec des mires USAF
3.2.2 Imagerie cohérente et caractérisation avec une mire Siemens
3.2.3 Définition d’un critère de performance
3.3 Influence des paramètres expérimentaux
3.3.1 Capteur
3.3.1.1 Taille de pixel
3.3.1.2 Défauts et bruits dans l’acquisition d’image
3.3.1.3 Capteur couleur
3.3.2 Source
3.3.2.1 Cohérence temporelle
3.3.2.2 Cohérence spatiale
3.3.3 Distance objet – capteur
3.3.4 Récapitulatif des paramètres physiques ayant une influence sur la résolution spatiale
Système limité par la cohérence temporelle
Système limité par la cohérence spatiale
Système limité par la taille de pixel
Bilan
3.3.5 Modèle de propagation numérique
Spectre angulaire de propagation (Rayleigh-Sommerfeld)
Diffraction de Fresnel
Diffraction de Fraunhofer
3.3.6 Choix des longueurs d’onde
3.3.7 Nombre d’itérations
3.4 Conclusion
4 Imagerie des tissus colorés
4.1 Introduction
4.2 Méthodes
4.2.1 Préparation des échantillons
4.2.2 Modalités d’imagerie
4.3 Résultats
4.3.1 Imagerie sans lentille d’échantillons denses absorbants
4.3.2 Imagerie sans lentille multi-échelle
4.4 Conclusion
5 Imagerie sans lentille de lames de tissus non colorés
5.1 Introduction
5.2 Méthode
5.2.1 Préparation des échantillons
5.2.2 Tissu optiquement translucide
5.2.3 Méthodes d’imagerie
5.3 Résultats
5.3.1 Imagerie sans lentille multi-échelle d’échantillons transparents
5.3.2 Identification des images « lensfree » en aveugle
5.3.3 Limites de la méthode
5.3.4 Traitement d’image
5.4 Conclusion
6 Conclusion

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