Identification des voies biologiques et des gènes potentiellement actionnables 

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HISTOLOGIE

Il existe une large variété histologique d’ostéosarcomes. Les ostéosarcomes primaires sont divisés en trois catégories en fonction de leur localisation; les ostéosarcomes centraux, développés à partir de la cavité médullaire de la métaphyse des os longs, les ostéosarcomes de surface, et les ostéosarcomes de siège intracortical. Les ostéosarcomes peuvent être de haut grade de malignité (ostéosarcomes conventionnels centraux), de grade intermédiaire de malignité (ostéosarcomes périostés) ou de bas grade de malignité (ostéosarcomes paraostéaux). Les ostéosarcomes conventionnels sont la forme histologique la plus représentée et sont eux-mêmes divisés en 3 sous-types en fonction de la matrice extracellulaire la plus représentée. On distingue ainsi les ostéosarcomes conventionnels de type fibroblastique, ostéoblastique et chondroblastique (Tableau 1). Il est à noter que cette distinction n’impacte pas les modalités de traitement, et que la survie pour ces 3 sous-types est comparable12,13.

TRAITEMENT

Le traitement des ostéosarcomes est multimodal et agressif. La principale révolution dans leur prise en charge a reposé sur l’avènement de la chimiothérapie adjuvante permettant de passer d’une survie globale de 20% à 70%14,15. La séquence thérapeutique comprend actuellement une chimiothérapie néoadjuvante, qui dans les formes pédiatriques, associe Methotrexate hautes doses, ifosfamide et VP16, suivie d’une chirurgie carcinologique puis d’une chimiothérapie adjuvante16. Le choix de la chimiothérapie adjuvante est guidé par le grading de Huvos. Les patients « bons répondeurs » reçoivent le même schéma thérapeutique que celui reçu en néoadjuvant, alors que les patients « mauvais répondeurs » reçoivent une association Methotrexate hautes doses, adriamycine et cisplatine (Figure 1). A l’issue de la chimiothérapie néoadjuvante la répartition est classiquement de moitié entre bons et mauvais répondeurs2.
Outre l’amélioration de la survie globale, la chimiothérapie néoadjuvante a permis de modifier les pratiques chirurgicales, permettant de passer d’une chirurgie radicale à une chirurgie conservatrice dans environ 80% des cas17,18. Cependant depuis les années 70, le traitement de l’ostéosarcome a été peu modifié avec échec de la plupart des essais cliniques.

GENETIQUE

La plupart des ostéosarcomes sont sporadiques. Cependant certaines mutations germinales augmentent le risque d’ostéosarcome. Ainsi le syndrome de Li Fraumeni dû à une mutation germinale du gène TP53 entraîne une augmentation du risque de développer un ostéosarcome avec une incidence de 12%22. De même les mutations germinales du gène RB1 entraînent un doublement du risque de développer un ostéosarcome par rapport à la population générale23. Les autres syndromes génétiques à risque sont le syndrome de Rothmund Thomson, le syndrome de Bloom et le syndrome de Werner respectivement dus à des mutations des gènes RECQL4,RECQL2 et RECQL324.
L’étude des ostéosarcomes sur un plan génétique est rendue difficile par deux points essentiels, d’une part la rareté de ces tumeurs, d’autre part leur hétérogénéité intra et intertumorale25. Il est intéressant de noter que sur le plan mutationnel les ostéosarcomes pédiatriques ont plutôt tendance à se comporter comme des tumeurs de l’adulte et non des tumeurs de l’enfant. Les tumeurs pédiatriques présentent un taux moyen de mutations somatiques faible de 0,1 mutation par mégabase, avec quelques variations en fonction du type histologique, pouvant atteindre jusqu’à 0,5 mutation par mégabase dans le neuroblastome et le médulloblastome qui font partie des tumeurs pédiatriques génétiquement les plus remaniées26. A l’inverse les ostéosarcomes ont un taux moyen de mutations somatiques de 1,2 mutations par mégabase ce qui aurait tendance à les rapprocher par exemple du cancer du sein26,27. Ce phénomène contribue en partie à expliquer l’hétérogénéité de ces tumeurs.
Afin de mieux comprendre l’oncogenèse et de tenter de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, quelques équipes se sont intéressées au séquençage des ostéosarcomes. En 2014, Chen a réalisé le séquençage de 34 échantillons d’ostéosarcomes issus de population pédiatrique. Il s’agissait d’une analyse « whole genome » à partir à la fois de biopsies pré-thérapeutiques de la tumeur initiale mais également de métastases. Chen et son équipe ont mis en évidence des mutations récurrentes dans 4 gènes, TP53, RB1, ATRX et DLG2.
La même année, Perry et son équipe ont réalisé un séquençage « whole exome » à partir de 59 échantillons d’ostéosarcomes de patients adultes et pédiatriques dont la moitié était métastatique. Ils ont mis en évidence une moyenne de 1.2 mutations par mégabase et 230 réarrangements par tumeur. Presque 25% des patients présentaient une altération dans la voie PI3K/AKT/mTOR et un tiers présentaient une altération potentiellement « ciblable »27. En 2015, Kovac et son équipe ont réalisé un séquençage « whole exome » à partir de 123 échantillons d’ostéosarcomes de patients adultes et pédiatriques. Ils ont mis en évidence 14 gènes comme étant les principaux « drivers » dans cette pathologie. Dans 47% des cas des mutations de TP53 ou RB1 expliquaient le processus de sarcomatogenèse. Dans 40% des cas, ce processus était expliqué par une mutation dans l’un de ces 12 autres drivers : BRCA2, BAP1, RET, PTEN, MUTYH, ATM,WRN, RECQL4, ATRX, FANCA, NUMA1 et MDC128. Ces études de séquençage soulignent le rôle clé de l’implication de TP53 et RB1 dans la sarcomatogenèse, TP53 étant retrouvé muté ou inactivé via d’autres mécanismes (amplification de COPS3 ou de MDM2) dans 47 à 90% des cas. L’inactivation de RB1 est elle retrouvée dans 47 à 61% des cas. Plus récemment, Livingstone et son équipe ont réalisé un séquençage de mutations hotspots et une étude d’altérations du nombre de copies sur 64 échantillons de patients pédiatriques et adultes présentant des ostéosarcomes récurrents ou métastatiques. Les mutations les plus fréquemment mise en évidence concernaient TP53 avec seize mutations mises en évidence et RB1, avec onze mutations mises en évidence. Une altération génétique potentiellement actionnable était retrouvée chez un tiers de l’effectif29.
Il n’existe à l’heure actuelle aucune donnée de séquençage permettant de différencier dès le diagnostic les patients bons répondeurs (BR) des patients mauvais répondeurs (MR).

PROBLEMATIQUE

Depuis l’avènement de la chimiothérapie dans les ostéosarcomes il y a presque trente ans, le pronostic de cette pathologie n’a pas évolué. Avec une survie globale à 5 ans de 50% pour les mauvais répondeurs et un risque de rechute métastatique nettement plus élevé que les bons répondeurs, il semble essentiel de pouvoir identifier dès le diagnostic cette catégorie de patients. En effet les modifications de traitement en post-opératoire (par exemple, chimiothérapie intensive) n’ont pas permis d’améliorer la survie chez ces patients et il semblerait qu’agir en amont en leur proposant dès le diagnostic un traitement différentiel pourrait être intéressant20. D’autre part les études de séquençage pourraient permettre de mettre en évidence de possibles cibles récurrentes exploitables sur un plan thérapeutique.

OBJECTIFS

Les études de séquençage actuelles ont été jusqu’ici réalisées dans des populations très hétérogènes (pédiatrique et adulte / non métastatique et métastatique) et non corrélées aux données cliniques. Il semblait ainsi utile et innovant de réaliser une étude de séquençage dans une population homogène pour laquelle nous disposions des données cliniques et notamment du statut BR ou MR à la chimiothérapie néoadjuvante. La population sélectionnée est donc exclusivement une population pédiatrique non métastatique au diagnostic prise en charge au CHU de la Timone à Marseille ou au CHU de Toulouse. Les gènes d’intérêt ont été sélectionnés à partir de la publication de Kovac et al. correspondant aux gènes retrouvés mutés à partir d’une analyse « whole exome » de 31 ostéosarcomes28 (Annexe 1). Les objectifs de ce travail ont été de réaliser un séquençage de 523 gènes d’intérêt à partir des biopsies congelées pré-thérapeutiques, et de corréler les données obtenues à la réponse à la chimiothérapie néoadjuvante afin de déterminer s’il existe des mutations ou des gènes récurrents permettant de distinguer dès le diagnostic les bons répondeurs des mauvais répondeurs. L’objectif secondaire est de déterminer les cibles thérapeutiques exploitables dans cette pathologie.

POPULATION D’ETUDE

La population d’étude correspond à une population pédiatrique non métastatique au diagnostic pour laquelle un fragment biopsique a été conservé et congelé au moment de la prise en charge. Les prélèvements ont été examinés et contrôlés par un cytopathologiste. Tous les patients ont bénéficié du même régime de chimiothérapie néoadjuvante par Methotrexate, VP16, Ifosfamide. Tous les patients ou leurs représentants légaux ont signé un formulaire de consentement pour une analyse génétique tumorale et constitutionnelle.

EXTRACTION DE L’ADN

Vingt biopsies congelées ont été déstockées auprès de la tumorothèque de l’hôpital de la Timone, et quatre prélèvements provenaient de la tumorothèque de Toulouse. L’extraction a été réalisée grâce au kit Allprep DNA/RNA kit® de la marque QIAGEN. Dans un premier temps le fragment de biopsie contenu dans un tube Eppendorf 1,5 ml a été placé dans un mortier contenant de l’azote liquide et broyé avec un pilon. Une fois le matériel réduit en fine poudre, 350 à 600μl de tampon Buffer RLT-plus et 3,5 μl de β mercapthoéthanol ont été ajoutés. Des étapes de lavage sur colonne puis une étape finale d’élution avec du Buffer EB, selon le protocole du fournisseur, permettait l’extraction de l’ADN. L’ensemble des échantillons ont bénéficié d’une étape de « clean up » afin d’améliorer les rapports d’absorbance 260/230 et 260/280. L’ADN était quantifié initialement par Nanodrop®, ce qui permettait également d’estimer la pureté de nos échantillons. Dans un deuxième temps, une quantification Qubit®, permettant de doser spécifiquement l’ADN double brin, était réalisée avant de débuter la préparation des banques.
Pour vingt et un de ces échantillons, des blocs de paraffine obtenus après chimiothérapie néoadjuvante à partir de la pièce opératoire ont pu être récupérés. Pour chacun de ces blocs une lecture anatomopathologique a permis de repérer les zones de tissus sains à récupérer afin de procéder à l’extraction de l’ADN de tissu normal. Cette extraction a été réalisée grâce au kit QIAamp DNA mini de la marque QIAGEN. Pour ce faire, nous récupérions de fins copeaux de tissus à l’aide d’un scalpel dans les zones préalablement cerclés avant d’ajouter 360μl de tampon ATL permettant une lyse tissulaire. Les protéines étaient ensuite digérées grâce à l’adjonction de 40μl de protéinase K. Des étapes de lavage sur colonne étaient ensuite réalisées avant de procéder à l’élution avec de l’eau permettant l’extraction de l’ADN. De même que pour l’ADN tumoral, l’ADN extrait du tissu normal était dosé à la fois par Nanodrop® et par Qubit®. Malheureusement l’extraction d’ADN du tissu sain à partir des blocs de paraffine n’a pas permis de récupérer suffisamment de matériel pour quatorze échantillons, et ce malgré des tentatives de concentration, probablement en raison d’une trop grande dégradation de la molécule d’ADN. Nous disposions d’ADN en quantité suffisante pour 7 échantillons pour lesquels nous avons pu passer aux étapes ultérieures de préparation des banques.

PREPARATION DES BANQUES

Les banques d’ADN ont été préparées à l’aide d’un kit « Haloplex HS Target enrichment system » (Agilent) pour un séquençage sur le NextSeq 500 d’Illumina.
Chaque échantillon a été préalablement dilué à une concentration finale de 1,8 ng/μl, concentration requise avant de débuter les banques. Pour chaque échantillon une quantité minimale de 50 ng d’ADN était nécessaire. Les différentes étapes de préparation des banques selon le protocole du fournisseur sont les suivantes (Figure 2) :
1) Digestion enzymatique de l’ADN par 8 couples d’enzymes.
2) Hybridation avec les sondes d’intérêt.
3) Ligation des fragments d’ADN hybridés avec les sondes.
4) Capture des fragments d’ADN d’intérêt grâce à des billes streptavidine.
5) Amplification par PCR.
6) Purification.
7) Analyse de la qualité des banques sur puce Bioanalyzer.
La première étape de préparation des banques (Etape 1 Figure 2) a consisté en une fragmentation enzymatique des échantillons par 8 couples d’enzymes indépendants, puis une dénaturation permettant de générer de multiples fragments d’ADN simple brin. Un ADN contrôle permettait de valider l’efficacité de la digestion enzymatique (analyse sur puce Bioanalyzer). Au cours de la deuxième étape une hybridation était réalisée (Etape 2 Figure 2) entre les sondes d’intérêt et les fragments d’ADN. Les sondes étaient constituées des éléments suivant : à chacune de leurs extrémités se trouvaient une séquence complémentaire aux extrémités des fragments contenant une région cible permettant l’hybridation, immédiatement après ces séquences complémentaires se trouvaient des amorces de séquençage. Entre les amorces de séquençage, un index, spécifique à chaque échantillon,

Amplification par PCR « en pont » et génération de clusters

Chaque banque d’ADN est chargée sur une puce dédiée appelée « flow cell », où chaque fragment s’hybride grâce à des adaptateurs complémentaires présents sur la « flow cell » (Figure 3A(1)). Une fois fixé, une copie du brin d’ADN est réalisée par PCR à partir du brin matrice, puis la molécule d’ADN est dénaturée et le brin matrice éliminé. Le brin restant vient alors se fixer en « pont » sur les amorces complémentaires situées à proximité et un brin complémentaire est de nouveau synthétisé par PCR. Des étapes successives de dénaturation/hybridation en pont/PCR sont réalisées permettant l’amplification rapide et dans les deux sens d’un même fragment d’ADN sur un espace réduit constituant un « cluster » (Figure 3A(2)).

Séquençage par synthèse

Avant l’étape de séquençage par synthèse, le brin antisens est éliminé et seul le brin sens est conservé dans un premier temps (Figure 3A(3)). Une amorce de séquence vient s’hybrider sur chaque fragment, et le processus de séquençage proprement dit peut alors commencer. Chaque nucléotide, A, T, C ou G utilisé au cours de l’étape de séquençage est associé à un fluorophore spécifique. Dès qu’un nucléotide est incorporé par complémentarité avec le fragment matrice, un signal lumineux est émis et acquis, permettant son identification (Figure 3B). La succession des acquisitions permet de reconstituer la séquence. Des millions de fragments d’ADN sont ainsi séquencés en même temps sur une seule et même puce.
En cas de lecture « paired-end », le même processus est effectué mais à partir du brin antisens cette fois ci (Figure 3C). Dans le cadre de notre projet, une lecture « paired-end » en 2 fois 150 paires de bases était réalisée.

Traitement bio-informatique des données

Différentes étapes sont réalisées au cours de l’analyse bio-informatique :
• Base calling : les données brutes au format BCL issues du séquenceur sont converties en fichier de séquence exploitable appelé fichier FASTQ.
• Alignement : les séquences générées sont ensuite comparées puis alignées sur le génome de référence Hg19 via le logiciel BWA, permettant l’obtention d’un fichier BAM.
• Variant calling : les variants, c’est-à-dire toute base, à une position donnée, différente du génome de référence sont détectés grâce au logiciel GATK. A la fois les SNV et les petites insertions ou délétions vont être détectés au cours de cette étape.
• Annotation : l’annotation permet suite au recoupement d’informations disponibles dans différentes bases de données de déterminer le type de variant (par exemple mutation de type synonyme, faux sens ou non sens), et son impact potentiel fonctionnel estimé par différents logiciels de prédiction in silico.
Le fichier VCF obtenu à la suite de l’annotation est ensuite exploitable sur le logiciel VarAFT®. VarAFT® est un logiciel en ligne (http://varaft.eu) qui permet d’aider à filtrer et annoter les variants identifiés au cours de l’étape de séquençage, en interrogeant directement différentes bases de données et logiciels de prédiction en ligne.

SELECTION DES VARIANTS

Sélection des variants sans contribution du normal

L’ADN constitutionnel des patients n’étant pas disponible pour 17 de nos échantillons, il n’a pas été possible de distinguer, parmi l’ensemble des variants retrouvés après séquençage des échantillons tumoraux, les variants exclusivement somatiques.
Pour filtrer et catégoriser les variants, l’outil VarAFT® a permis, dans un premier temps, d’écarter les variants non exoniques (5’UTR, 3’UTR, introns en dehors des sites d’épissage). Le second paramètre de tri s’est fait sur la fréquence retrouvée des variants en population générale. L’outil VarAFT® permet en effet de sélectionner les variants ayant une fréquence inférieure à 1% en population générale, permettant de s’affranchir des polymorphismes les plus fréquents (seuil communément utilisé). Ainsi les variants retrouvés à une fréquence supérieure ou égale à 1% dans les bases de données 1000Genomes, KAVIAR et ExAC n’ont pas été conservés pour la suite de l’analyse. Les variants synonymes ont également été exclus de l’analyse.
Chaque variant a été ensuite analysé de façon individuelle et noté de 0 à 3 en fonction de sa probabilité de pathogénicité et d’action dans la tumorigenèse. Le premier filtre s’est fait à partir de score de prédiction in silico sur l’impact fonctionnel supposé du variant. Cinq outils ont été utilisés ; mutation taster, mutation assessor, SIFT, UMD-Predictor et Polyphen2. Parallèlement les bases de données OMIM, GeneCards et MalaCards étaient consultées pour chaque gène. Ces bases de données fournissent des informations sur l’implication des gènes dans les pathologies humaines, leur rôle dans les voies de signalisation biologique, l’expression tissulaire du gène et éventuellement des données sur les modèles animaux existants. Les variants étaient ensuite classés comme ci-après (Figure 4) :
Score 0 :
– Variants prédits comme polymorphes ou neutres par au moins 4 des 5 outils de prédiction.
Score 1 :.
– Variants prédits comme polymorphes ou neutres par 3 des 5 outils de prédiction.
Score 2 :
– Variants pour lesquels aucune ou une seule donnée de prédiction est disponible et ce quel que soit le résultat.
– Variant de type STOP (non-sens)/ SPLICE (dans les sites canoniques d’épissage) /FRAMESHIFT (décalage du cadre de lecture).
– Variants prédits comme pathogènes par au moins 4 des 5 outils de prédiction.
Score 3 :
– Variants non polymorphes (cf score 2) dans des gènes déjà identifiés par séquençage dans les ostéosarcomes (données bibliographiques).
Les variants de catégorie 2 et 3 étaient considérés comme les variants les plus probablement d’origine somatique exclusive, et donc les meilleurs candidats pour expliquer la tumorigénèse des ostéosarcomes.

Sélection des variants pour les échantillons couples normal/tumoral

Pour les échantillons couples, la sélection des variants a été plus facile, puisque la contribution du normal permettait de soustraire parmi les variants retrouvés dans le tumoral tous les variants constituant des polymorphismes rares propres à chaque patient. Pour chaque fichier VCF normal et tumoral les variants non exoniques (5’UTR, 3’UTR, introns en dehors des sites d’épissage) ont été retirés de l’analyse, ainsi que les variants synonymes et les variants supérieurs à 1% en population générale (base de données 1000genomes, KAVIAR, ExAC). A partir de ce tri, chaque variant communément partagé entre le normal et le tumoral était retiré de l’analyse car considéré comme un polymorphisme rare à l’exception de TP53 et RB1 qui pouvait constituer des mutations germinales. La visualisation physique des reads sur IGV des couples normal et tumoral permettait également de retirer des variants communément partagés et qui n’avaient pas été « appelés » par VarAFT®. Les variants restant au niveau tumoral étaient alors considérés comme des variants d’origine somatique sans préjuger de leur caractère driver ou passenger.

IDENTIFICATION DES VOIES BIOLOGIQUES ET DES GENES POTENTIELLEMENT « ACTIONNABLES »

Les voies biologiques d’intérêt ont été identifiées grâce à l’outil bio-informatique PathScore. Cet outil s’appuie sur des algorithmes mathématiques pour déterminer à partir des gènes mutés l’enrichissement de voies biologiques30. L’identification des mutations pouvant bénéficier d’une thérapeutique de type thérapie ciblée a été réalisée grâce au logiciel Cancer Genome Interpreter (https://www.cancergenomeinterpreter.org/home). L’identification de cible potentielle est rendue possible grâce à la base de données dédiée « Cancer Biomarkers database » (https://www.cancergenomeinterpreter.org/biomarkers), permettant d’identifier la mutation comme étant une mutation de sensibilité ou de résistance à une drogue tout en indiquant le niveau de preuve scientifique. Ce niveau de preuve s’échelonne de « case report » à recommandations d’experts en passant par phase pré-clinique, essai clinique de phase précoce (phase I-II) et essai clinique de phase avancée (phase III).

POPULATION D’ETUDE

La population d’étude concerne exclusivement des sujets pédiatriques non métastatiques au diagnostic et traités selon les protocoles pédiatriques. Les patients ont été pris en charge sur l’hôpital de la Timone entre 2000 et 2016 et sur l’hôpital de Toulouse entre 2012 et 2014. L’âge médian au diagnostic était de 13,5 ans. Le suivi médian a été de 60,5 mois. La population comprenait 10 mauvais répondeurs et 14 bons répondeurs. A la date d’analyse, 25% de l’effectif était décédé. Le tableau 2 résume les caractéristiques des patients inclus.

ANALYSE DES MUTATIONS

Les échantillons tumoraux ont été séquencés avec une profondeur moyenne de 1212X (824-2184). En moyenne, 98,7% [94,5-99,29] des gènes cibles ont été lus avec une profondeur supérieure à 20X et 97,6% [89,4-98,9] des gènes cibles ont été lus avec une profondeur supérieure à 50X. Pour les 7 échantillons de tissu non tumoral la profondeur moyenne était de 278X (156-390). En moyenne, 75,7% [65-86] des gènes cibles ont été lus avec une profondeur supérieure à 20X et 65,5% [52-76,8] des gènes cibles ont été lus avec une profondeur supérieure à 50X.
Après séquençage des 17 échantillons tumoraux sans contribution du normal, 10556 variants retrouvés en région exonique/épissage/jonction ont été identifiés. Parmi ceux-ci, les variants retrouvés dans moins de 1% de la population générale se comptent à 518. L’exclusion des variants synonymes ramène ce chiffre à 356. L’application de la méthode de classement (cf matériel et méthodes, paragraphe 2.5), permet de retenir 193 variants en catégories 2 et 3 (meilleurs candidats pour expliquer la tumorigénèse des ostéosarcomes). Les 167 variants restant après filtre avec le logiciel HSF et les bases de données GnomAD et ClinVar, sont réduits à 113 après analyse sur le logiciel IGV (Figure 4). Pour l’analyse des résultats, ces 113 variants sont considérés comme des variants pathogènes, appelés par la suite mutations.
Pour les couples normal/tumoral, après soustraction des variants de fréquence supérieure à 1% en population générale et soustraction des variants synonymes, on obtenait 122 variants. Le contrôle de ces variants sur IGV a permis de retenir 39 variants tumoraux.
Parmi le panel des 523 gènes analysés, 109 gènes présentaient une ou plusieurs mutations (Annexe 2). Le nombre moyen de mutations par échantillon était de 6 chez les bons répondeurs [2 ; 11] et de 7 chez les mauvais répondeurs [4 ; 14]. Les mutations les plus représentées étaient les mutations de type faux-sens. Le gène retrouvé le plus fréquemment muté était TP53 avec 7 mutations dont 6 mutations faux-sens et une mutation non-sens. Les autres gènes les plus mutés étaient PCDH15 (4 mutations dont 2 dans un même échantillon), TET2 (4 mutations), PPP1R3A (3 mutations), ATAD2 (3 mutations), TSC2 (3 mutations), ATRX (3 mutations), CYP2D6 (3 mutations) (Annexe 3).

ANALYSE DES VOIES BIOLOGIQUES

L’identification des voies d’intérêt s’est faite à partir de l’outil bio-informatique PathScore. Cet outil s’appuie sur des algorithmes mathématiques pour déterminer à partir des gènes mutés l’enrichissement de voies biologiques30. Le dendrogramme présenté en annexe 4 représente l’ensemble des voies retrouvées de manière significatives dans les ostéosarcomes séquencés. Si l’on ne considère que les voies ayant une p-value ajustée (p*) significative, les voies de régulation des ostéosarcomes étudiés sont les suivantes :
– P53 signaling pathway qui correspond à 37.5% des échantillons (p*= 2,6.10-6).
– PI3K events in ERBB2 signaling qui correspond à 37.5% des échantillons (p*=6.10-7).
– PI3K events in ERBB4 signaling qui correspond à 33.3% des échantillons (p*=2,5.10-6).
– PI3K AKT activation qui correspond à 29.2% des échantillons (p*=1,3.10-4).
– GAB1 signalosome qui correspond à 29.2% des échantillons (p*=1,1.10⁻4).
– mTOR pathway qui correspond à 25% des échantillons (p*= 2.10-4).
– HCMV pathway qui correspond à 20,8% des échantillons (p*=0,0016).
Par ailleurs, toutes les voies du dendrogramme à branchement vert ont également une p-value ajustée significative compte tenu du poids de TP53 dans toutes ces voies.
Lorsque l’on considère les bons répondeurs de façon exclusive, les voies avec une p-value ajustée significative sont les suivantes :
– Telomerase pathway qui correspond à 50% de l’échantillon (p*=5,1.10-8).
– LKB1 pathway qui correspond à 42,9% de l’échantillon (p*= 6,5.10-5).
– PI3K events in ERBB2 signaling qui correspond à 35,7% de l’échantillon (p*=0,0029).
– PI3K events in ERBB4 signaling qui correspond à 35,7% de l’échantillon (p*= 8,2.10-4).
Par ailleurs, toutes les voies du dendrogramme à branchement rouge ont également une p-value ajustée significative compte tenu du poids de TP53 dans ces voies (Figure 5).

Table des matières

1. INTRODUCTION 
1.1. Epidémiologie
1.2. Clinique
1.3. Histologie
1.4. Traitement
1.5. Génétique
1.6. Problématique
1.7. Objectifs
2. MATERIEL ET METHODES 
2.1. Population d’étude
2.2. Extraction de l’ADN
2.3. Préparation des banques
2.4. Séquençage
2.5. Sélection des variants
2.6. Identification des voies biologiques et des gènes potentiellement actionnables
3. RESULTATS 
3.1. Population d’étude
3.2. Analyse des mutations
3.3. Analyse des voies biologiques
3.4. Analyse des cibles potentielles
4. DISCUSSION 
4.1. Les limites techniques
4.2. Les différents aspects de la résistance tumorale
4.3. Validité des cibles identifiées ?
4.4. Les différentes voies biologiques et les gènes impliqués
5. CONCLUSION 
6. ANNEXES 
7. BIBLIOGRAPHIE

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