Identification des souches de Streptococcus pneumoniae avec MALDI-TOF

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La spectrométrie de masse MALDI-TOF

Principe

Le spectromètre de masse MALDI-TOF est un spectromètre utilisant une source d’ionisation laser assistée par une matrice (MALDI = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) et un analyseur à temps de vol (TOF = Time-Of-Flight) [32]. La séparation des molécules par cette technique est plus douce qu’avec les autres méthodes. Elle permet d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et sensibles à la chaleur sans les dégrader [33]. La méthode MALDI-TOF s’applique aux biomolécules plus fragiles comme les peptides, les protéines, les glycoprotéines et les oligonucléotides [34].
L’échantillon est mélangé à la matrice puis placé sur une lame. Le dépôt (ou spot) formé est appelé cible. Une source laser est dirigée sur la cible afin d’ioniser les molécules de l’échantillon. Les ions ainsi obtenus sont ensuite détectés en mesurant le temps que mettent les différentes particules à atteindre le détecteur. La vitesse de chaque particule dépend du rapport masse/charge. Les molécules plus grandes mettraient plus de temps à atteindre le détecteur, tandis que les molécules plus petites vont arriver plus vite. Une fois l’ion arrivé au détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les données et donne les résultats sous forme de spectre [31].

La matrice

La matrice est constituée de molécules cristallisées dont les plus utilisées sont l’acide 2,5 dihydroxybenzoïque (DHB), l’acide sinapinique et l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA). Ces molécules sont ajoutées à un solvant (acétonitrile, éthanol ou acide trifluoroacétique) [32]. Le DHB convient pour l’analyse des échantillons organiques hydrophobes ou des polymères aromatiques, tandis que l’acide sinapinique et l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique sont destinés pour l’analyse des protéines [35].
Un solvant composé d’eau et d’acétonitrile est ajouté à la matrice afin de permettre aux substances de l’échantillon de se dissoudre dans le mélange : les substances hydrophobes de l’échantillon auront une affinité pour l’acétonitrile alors que les substances hydrophiles auront une affinité pour l’eau [32].
Après avoir mélangé la matrice à l’échantillon, le spot obtenu est séché à l’air pour permettre au solvant de s’évaporer et il ne restera que l’analyte dans la matrice cristallisée. Les composants de la matrice doivent avoir plusieurs caractéristiques [32,36]:
– pouvoir se mélanger avec les solvants organiques et l’eau
– être assez grands afin de ne pas s’évaporer lors de la préparation de l’échantillon ou lorsque celui-ci est introduit dans le spectromètre
– être assez petits afin d’avoir une bonne volatilité et se vaporiser sous l’action du rayon laser
– être acides afin de transmettre des protons à l’analyte et ainsi l’ioniser
– pouvoir absorber fortement et rapidement les rayons ultra-violets du laser

Désorption-Ionisation

Un laser UV (de longueur d’onde égale à 337 nm) d’azote (N2) est pulvérisé en direction de la cible. La matrice ayant une grande réactivité pour l’absorption de la lumière UV absorbe l’énergie du laser protégeant ainsi les molécules protéiniques de la dégradation. L’énergie du laser produit deux phénomènes : tout d’abord, la matrice se vaporise libérant les peptides (désorption), ensuite, elle transfert ses protons à l’analyte qui s’ionise [36].
Selon leur nature, les ions peuvent être chargés positivement ou négativement. Les protéines et peptides ont des groupements accepteurs de protons et sont ionisés positivement. Les oligonucléotides et les saccharides ont des groupements qui perdent un proton et sont ionisés négativement [34].
Peptides : R-NH2 + H+ → R-NH3 + (ionisation positive)
Saccharides : Acides carboxyliques R-CO2H → R-CO2 – (ionisation négative)
Fonction alcoolique R-OH → R-O – (ionisation négative)

La spectrométrie à temps de vol (TOF)

La spectrométrie à temps de vol est une technique séparant les substances ionisées en fonction de leur charge et de leur poids moléculaire. La séparation se fait entre une anode et une cathode dirigeant ainsi les molécules ionisées vers l’électrode portant la charge inverse des ions à analyser [36]. Les ions passent ensuite à travers un champ électrique de force connue accélérant leur progression [31]. Le spectromètre mesure le temps que mettent les différents ions à atteindre le détecteur. Les grosses molécules mettent plus de temps à atteindre le détecteur que les petites molécules. Elles sont ainsi séparées en fonction de leur rapport masse/charge [36].
Le détecteur envoie ensuite les informations enregistrées à l’analyseur qui va traiter les données et les présenter sous forme de spectre.

Le spectre

Les données enregistrées sont calculées afin de transposer les résultats en un spectre où chaque pic correspond à un type de molécule. L’axe des ordonnées représente l’intensité relative du signal et l’axe des abscisses indique la taille de la molécule en Daltons.
L’appareil intègre les différents pics enregistrés et recherche dans la base de données l’identification du germe correspondant.

Avantages et inconvénients du MALDI-TOF

 Avantages :
– Rapidité de l’identification : le MALDI-TOF est la technique d’identification la plus rapide. Alors qu’il faut entre 4 et 18 heures sur les galeries de tests biochimiques, avec le MALDI-TOF, une demi-heure suffit pour lire une lame contenant 24 échantillons.
– Simplicité de l’analyse : la préparation de l’échantillon est simple à réaliser. Contrairement ou aux galeries, il n’y a pas besoin de faire de suspension du germe à analyser ou de plaque de pureté.
– Petit volume d’échantillon nécessaire : il faut très peu de matériel pour effectuer le dépôt. En général, une colonie bien isolée suffit, parfois plusieurs si elles sont très petites. Avec les galeries, il faut assez de colonies pour effectuer un Mac Farland de 0.5, voire plus pour certains germes ayant du mal à pousser.
– Coûts : moins cher par rapport aux autres méthodes
– Découverte de nouvelles espèces bactériennes
 Inconvénients :
– Le MALDI-TOF ne convient pas à identifier certaines espèces qui ne sont pas dans la base de données du Vitek MS, notamment les Actinomyces et les Legionella autre que pneumophila. En revanche, la liste de la base de données est exhaustive est peut être mise à jour afin d’élargir le panel des espèces pouvant être identifiées par le MALDI-TOF.
– Germes difficiles à prélevés ou trop muqueux : Les bactéries trop muqueuses (Klebsiella, pneumocoque, etc.) ne sont pas bien identifiées par le MALDI-TOF. Ce problème n’est pas dû à l’appareil, mais à la qualité de l’étalement. L’échantillon doit être bien étalé sur le puits et mélangé à la matrice de façon homogène. Si ce n’est pas le cas, le MALDI-TOF ne peut pas identifier le germe. La qualité de l’étalement est un point important à respecter pour l’identification correcte des germes.

Prise en charge d’un prélèvement bactériologique au laboratoire

La prise en charge des prélèvements bactériologiques au laboratoire comporte classiquement 5 étapes [22,2] :
– le prélèvement : il doit être adapté et acheminé dans un délai court au laboratoire pour être techniqué.
– les milieux de culture (solides ou liquides) sont choisis en fonction du micro-organisme que l’on cherche à mettre en évidence de l’origine du prélèvement, en fonction de la clinique, de la nature du prélèvement (seringue, écouvillons etc.), mais également des exigences métaboliques et nutritionnelles des micro-organismes potentiellement impliqués.
– les conditions culturales : les milieux sont ensuite incubés, selon les exigences de la bactérie recherchée, dans des étuves d’environ 35°C à 37°C, sous atmosphère aérobie, anaérobie ou sous atmosphère microphilie.
– l’identification : l’orientation de l’identification de la bactérie repose sur les caractères morphologiques (Gram positif ou négatif), culturaux (exigence en facteurs de croissance, atmosphère d’incubation etc.), caractères biochimiques (oxydase, catalase, etc.) et éventuellement des caractères antigéniques.
– l’étude de la sensibilité aux antibiotiques : elle est réalisée en milieu liquide ou solide. Elle consiste à tester la capacité de croissance de la bactérie cultivable en présence de différentes molécules antibiotiques, afin de prédire la probabilité de leur échec ou de leur succès thérapeutique.

Les infections respiratoires aiguës

Les infections bactériennes sont très fréquentes en pathologies humaines. Elles peuvent être communautaires ou nosocomiales.
Leur gravité peut être très variable, de la simple infection locale à celle gravissime telle que la bactériémie voire le choc septique, engageant le pronostic vital.
Les infections respiratoires aiguës regroupent les infections des voies respiratoires hautes (les angines aiguës, les épiglottites, les otites, les sinusites) et les infections des voies respiratoires basses (trachéites, bronchites aiguës, bronchiolites du nourrisson et pneumopathies).
Les infections respiratoires aiguës (IRA) sont une des causes de décès les plus importantes chez les jeunes enfants dans les pays en voie de développement. Selon des données récentes de l’OMS, les IRA sont à elles seules responsables de 18,1% des décès chez l’enfant, dans le monde [18].
Les IRA sont à 80% d’origine virale et sont souvent prédisposées à des complications bactériennes [12].
L’étiologie bactérienne de ces infections est dominée par Haemophilus influenzae, et Streptococcus pneumoniae qui sont responsables des pathologies bactériennes respiratoires majeures.

Les pathogènes responsables d’IRA

Streptococcus pneumoniae

Taxonomie et nomenclature [11,8]

S. pneumoniae appartient à la famille des Streptococcaceae regroupant plus de 80 espèces bactériennes classées en plusieurs genres :
– Streptococcus et Enterococcus
– Aerococcus, Gemella, Leuconostoc – Lactococcus et Pediococcus

Caractères bactériologiques [23]

Caractères morphologiques

Ce sont des cocci à Gram positif, capsulés (souches virulentes), lancéolée disposés en mode diplocoques ou parfois en courtes chaînettes.
La culture de S. pneumoniae nécessite des facteurs de croissance. Les milieux les plus couramment utilisés sont la gélose trypticase soja ou la gélose Columbia enrichies en sang de mouton ou de cheval à 5%.
L’addition de gentamicine à la concentration de 6 μg/ml rend le milieu sélectif au pneumocoque.
Une atmosphère enrichie en CO2 (5 à 10%) avec une température optimale de 35°C à 37°C favorise la croissance du pneumocoque et l’expression de l’hémolyse au bout de 24 heures. Les pneumocoques se présentent sous forme de petites colonies transparentes, rondes de 0,5 à 1,5 mm de diamètre avec une hémolyse de type alpha. Les pneumocoques en culture sont sujets à une autolyse spontanée.

Habitat

Le pneumocoque est une bactérie commensale des voies aériennes supérieures. Il colonise le rhinopharynx très précocement où il est en portage chez 50% des enfants âgés de 2 ans [17,10].

Identification formelle de l’espèce

L’identification formelle du pneumocoque repose sur trois critères :
– La sensibilité à l’optochine (test d’orientation) pour la majorité des souches
– La lyse par la bile
– La mise en évidence d’une capsule.

Sensibilité à l’optochine

L’optochine est l’éthylhydrocupréine dérivé proche de la quinine.
Un disque de 6 mm de diamètre chargé de 5 μg d’optochine provoque sur une culture de pneumocoque sur gélose au sang une zone d’inhibition dont le diamètre est compris entre 12 et 35 mm.
Les autres streptocoques sont résistants à l’optochine. Cependant, 0,5 à 5% des pneumocoques sont résistants à l’optochine et quelques streptocoques viridans sont sensibles à l’optochine.
Il est donc nécessaire de pratiquer des tests complémentaires.

La lyse par la bile

Les pneumocoques provenant d’une culture sur gélose sont lysés par une solution de désoxycholate de sodium de 2 à 10%. La lyse se traduit par un éclaircissement du milieu en quelques minutes. Selon les auteurs 86 à 100% des pneumocoques sont lysés par la bile.

Mise en évidence de l’antigène capsulaire [4,1]

Elle s’effectue à l’aide d’un sérum anti-pneumococcique polyvalent, dirigé contre tous les types d’antigènes capsulaires. La réaction peut s’effectuer soit à partir des cultures, soit à partir des produits pathologiques. Il existe plusieurs méthodes :
– Réaction du « gonflement capsulaire » ou réaction de Neufeld (méthode de référence)
– Réactions d’agglutination,
– Procédé des particules de latex sensibilisés,
– Procédé de co-agglutination (COA) avec des staphylocoques tués,
– La contre immunoélectrophorèse (CIE).

Facteurs de virulence et pouvoir pathogène

Facteurs de virulence [11]

La capsule

La majorité des souches de S. pneumoniae possèdent des capsules recouvrant la paroi cellulaire. Jusqu’ici, 84 sérotypes de S. pneumoniae ont été différenciés grâce aux polyosides capsulaires immunologiquement distincts.
La capsule constitue chez les pneumocoques le facteur essentiel de virulence. Elle empêche l’opsonisation et l’ingestion du germe par les cellules phagocytaires, en masquant les récepteurs pariétaux où se fixent les fragments C3b du complément.

La pneumolysine

La pneumolysine appartient à la famille des thiols-activables. Apparentée à la streptolysine O de Streptococcus pyogenes, sa pathogénicité est multifonctionnelle.
Elle est liée d’une part à son activité cytotoxique directe vis-à-vis des cellules respiratoires par activation du complément et une baisse des battements ciliaires des cellules épithéliales permettant l’envahissement de l’arbre respiratoire et d’autre part à un effet pro-inflammatoire. Ce dernier effet est dû à sa capacité de liaison au fragment Fc des immunoglobulines et de fixation au fragment C1q du complément.
La localisation de cette pneumolysine nécessite sa libération dans le milieu extérieur par l’action d’une autolysine.
Elle est responsable de l’hémolyse alpha observée sur gélose au sang.

La protéine A de surface

La protéine A est présente sur la plupart des souches de S. pneumoniae, elle assure l’adhésion aux cellules ciliées de l’arbre bronchique.

Pouvoir pathogène naturel [17]

Des infections très sévères sont décrites à tous les âges, mais avec une extrême gravité chez les enfants âgés moins de deux ans et les adultes plus de soixante ans. Les mécanismes expliquant d’une part la translocation bactérienne et d’autre part le développement des lésions tissulaires sont multiples et pourraient varier en fonction des différents sérotypes capsulaires de pneumocoque.
Le pneumocoque est l’agent pathogène le plus fréquent des pneumonies communautaires bactériennes ; c’est également l’une des bactéries les plus impliquées dans les otites moyennes aiguës de l’enfant (moins de 2 ans), les mastoïdites ; les sinusites et les conjonctivites.
Il est responsable aussi d’infections invasives telles que les méningites où il est le principal agent causal chez les personnes âgées. Chez l’enfant de moins de 5 ans, en dehors de la période néonatale dans laquelle S. agalactiae est l’agent dominant et depuis l’introduction de la vaccination anti-Haemophilus b, sa fréquence est similaire à celle de Neisseria meningitidis.
Certains facteurs prédisposent aux pneumonies à pneumocoques:
• les atteintes des voies respiratoires (infections virales, obstructions, etc.) ;
• l’alcoolisme ;
• les dysfonctions cardio-circulatoires, rénales ;
• l’anémie à hématies falciformes ;
• l’âge (enfants, personnes d’âge supérieur à 65 ans) ;
• la splénectomie, les dysfonctions spléniques ;
• la résistance aux pénicillines, aux tétracyclines et aux macrolides est en constante propagation.

Vaccination [14]

Des vaccins contenant les sérotypes les plus fréquemment associés aux infections invasives à pneumocoque sont disponibles; le vaccin polysaccharidique contenant 23 sérotypes est disponible et peut être administré à partir de 2 ans (PNEUMO 23®).

Haemophilus influenzae

Taxonomie et nomenclature [8,5]

Le genre Haemophilus appartient à la famille des Pasteurellaceae, avec les genres Pasteurella et Actinobacillus. Le genre Haemophilus comprend seize espèces d’origine animale et humaine, dont quelques unes sont pathogènes pour l’homme Haemophilus influenzae est l’espèce type.
H. influenzae a été décrite à tort par Pfeiffer en 1892 comme étant l’agent causal de la grippe sur les bases de données épidémiologiques. En fait, cette bactérie était tout simplement isolée de façon plus fréquente chez les patients atteints de grippe, quelquefois comme agent de surinfection. La taxonomie des bactéries du genre Haemophilus a été souvent remaniée. Le Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology répertorie 16 espèces dans le genre Haemophilus en fonction des exigences en facteurs X et V.

Facteurs de virulence et pouvoir pathogène

Facteurs de virulence [24]

La capsule

Les souches d’ H. influenzae avec colonies lisses ou muqueuses sont capsulées et peuvent être caractérisées par agglutination ou par précipitation d’une substance soluble spécifique. Six variétés antigéniques (a, b, c, d, e, f) ont été décrites par Pittman, en fonction de la structure antigénique de la capsule du germe. La spécificité de type dépend de la composition en polysaccharides de la capsule.
Seul le polysaccharide de type b est constitué de polyribosyl ribitol phosphate (PRP) est antigénique. La grande majorité des pathologies invasives chez l’enfant (méningites, épiglottites, arthrites, septicémies) est due aux souches capsulées de type b en raison du rôle majeur du PRP comme facteur de virulence. Le type b présente une plus grande résistance à l’activité bactéricide du complément permettant une survie prolongée et une multiplication des germes dans le sang.

Les lipopolysaccharides (LPS)

Comme tous les bacilles à Gram négatif, H. influenzae possède une membrane externe constituée de protéines, de porines, de phospholipides, et de lipopolysaccharides. Les LPS sont libérés au cours de la lyse des bactéries et exercent une activité endotoxinique sur de nombreuses cellules de l’organisme.
C’est une endotoxine constituée de lipide A, de 2 céto-3 désoxyoctonate et d’oligosaccharides; c’est la lyse des LPS avec libération de lipide A qui est à l’origine du choc septique à H. influenzae.

Pili

Les pili, visibles en microscopie électronique, sont des appendices filamenteux, longs, fins; ils sont capables d’hémagglutination.
La présence de pili chez H. influenzae, confère à la bactérie des propriétés d’adhésion à la muqueuse nasopharyngée. Leur rôle n’apparaît pas obligatoire dans la colonisation de la muqueuse, ni dans la phase d’invasion ultérieure qui, chez l’animal, s’accompagne de la perte des pili. L’adhésion est de faible affinité et la persistance de la colonisation serait liée à la présence de fibrilles, ayant une structure différente de celle des pili.
En raison de leur localisation en surface et de leurs propriétés antigéniques, les pili sont des antigènes qui peuvent être utilisés dans un futur vaccin.

Immunoglobulines A protéases

H. influenzae produit une enzyme qui a la propriété de cliver les immunoglobines humaines de type A. C’est une protéase extracellulaire, constitutive, d’origine chromosomique spécifique des IgA humaines de la sous classe des IgA1. Elles n’ont aucune action sur les IgA2. Par hydrolyse, elles libèrent les fragments Fab et Fc. Ainsi, H. influenzae peut se protéger de la présence locale des IgA sécrétoires spécifiques.

Pouvoir pathogène [3]

Haemophilus influenzae est une bactérie commensale des voies respiratoires supérieures. Environ 50% des enfants sont porteurs d’ H. influenzae dans le nasopharynx; où elle peut entrainer une infection à partir de cette porte d’entrée.
– Les souches invasives : développent la plus grande pathogénicité grâce à la présence d’une capsule (sérotypes: b, le plus fréquent; a et c-f, moins fréquents).
Elles sont généralement responsables de:
• Méningites
• Epiglottites (enfants inférieure à 6 ans), septicémies
• Infections (souvent surinfections) des voies respiratoires basses (pneumonies, bronchites); ces infections sont aussi provoquées par des souches non capsulées.
– Les souches non invasives : ne sont pas encapsulées, mais leur pathogénicité potentielle est associée à certains biotypes. Elles sont généralement responsables de sinusites, d’otites, de conjonctivites.

Vaccination [19]

Depuis 1990, il existe des vaccins constitués d’extraits polysaccharidiques capsulaires conjugués à des protéines (protéine de la membrane externe de N. meningitidis, toxines diphtérique ou tétanique). Ils sont recommandés aux nourrissons à partir de l’âge de 2 mois.
Depuis l’introduction du vaccin contre H. influenzae b, il y a une forte baisse des cas de méningites bactériennes à H. influenzae b.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
I. La spectrométrie de masse
II. La spectrométrie de masse MALDI-TOF
II.1. Principe
II.2. La matrice
II.3. Désorption-Ionisation
II.4. La spectrométrie à temps de vol (TOF)
II.5. Le spectre
II.6. Avantages et inconvénients du MALDI-TOF
III. Prise en charge d’un prélèvement bactériologique au laboratoire
IV. Les infections respiratoires aiguës
V. Les pathogènes responsables d’IRA
V.1. Streptococcus pneumoniae
V. 1.1. Taxonomie et nomenclature [11,8]
V.1 .2. Caractères bactériologiques [23]
V.1.3. Habitat
V.1.4. Identification formelle de l’espèce
V.1.5. Facteurs de virulence et pouvoir pathogène
V.1.6. Vaccination [14]
V.2. Haemophilus influenzae
V.2.1. Taxonomie et nomenclature [8,5]
V.2.2. Caractères bactériologiques [16]
V.2.3. Habitat
V.2.4. Facteurs de virulence et pouvoir pathogène
V.2.5. Vaccination [19]
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. Cadre de l’étude
II. Population d’étude
III. Matériels et méthode
III.1. Matériel
III.2. Spectrométre de masse : Vitek MS
III.3. Méthodes
III.3.1. Méthodes d’identification classiques
III.3.2. Méthodes d’utilisation du MALDI-TOF
IV. Résultats
IV.1. Identification des souches d’Haemophilus influenzae par MALDI –TOF
IV.2. Identification des souches de Streptococcus pneumoniae avec MALDI-TOF
V. Discussion
Conclusion
BIBLIOGRAPHIE

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