Soutenance mémoire
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Facteurs de pathogénicité
Les facteurs favorisant l‟IU sont généralement : les activités sexuelles, la distance entre l‟urètre et l‟anus très proche chez la femme, facilitant la colonisation par la flore intestinale. Il y a aussi les modifications de la flore vaginale dues à l‟utilisation d‟antibiotiques, des spermicides, des diaphragmes, au changement physiologique chez la femme ménopausée et l‟âge. Il faut noter aussi l‟anomalie de l‟arbre urinaire, le diabète, la grossesse et l‟utilisation des sondes.
Traitements d’une infection urinaire
Le choix de l‟antibiotique se fait en fonction de la gravité de l‟infection, du germe responsable et doit être adapté à l‟antibiogramme. Les plus utilisés sont ceux qui diffusent correctement dans le parenchyme rénal et/ou prostatique et qui s‟éliminent par voie urinaire (Faucher, Cudennec, 2003). Des traitements types ont été tirés des « Recommandations sur l‟usage des antibiotiques en première intention au cours des infections communautaires : Texte relu et mis à jour en avril 2014 (Les confrères de Mada) » Voir annexe 3.
Généralités sur la résistance aux antibiotiques
La résistance d‟une souche bactérienne à un antibiotique est la capacité pour cette souche de se multiplier en présence d‟une concentration d‟antibiotique supérieure à celle qui inhibe la majorité des souches appartenant à la même espèce (Guerin-Faublee, 2010), Les antibiotiques utilisables dans le traitement des maladies infectieuses sont ceux qui ont fait la preuve d‟une toxicité sélective envers la bactérie visée, tout en respectant l‟hôte humain ou animal (Figueiredo, 2012). Leur utilisation importante est due à leurs caractéristiques comme le large spectre d‟action, leur efficacité, leur faible toxicité et à leur faible coût pour de nombreuses molécules.
Les bêtalactamases à spectre étendu
Les bêtalactamases sont des enzymes capables d‟inhiber l‟action des antibiotiques de la famille des bêtalactamines. La première enzyme capable d‟inactiver la pénicilline est la pénicillinase décrite en 1940 par Abraham E. P. Depuis ce jour, plusieurs types de bêtalactamases ont été identifiés dans diverses espèces bactériennes. Ces enzymes peuvent être classées en fonction de leur spectre d‟activité enzymatique (Bush, Jacoby, 1995)(Jacoby, 2010)(Guerin-Faublee, 2010) ou de leur séquence en acides aminés (Ambler 1980). Selon la classification d‟Ambler proposée en 1980, les bêtalactamases sont groupés en quatre classes en fonction de leur homologie structurale (Ambler, 1980). La classification des bêtalactamases et bêtalactamases à spectre étendu (BLSE) est représentée sur la figure 4.
Milieu de gélose au sang
Ce milieu convient à l‟isolement des BGP. Il permet d‟apprécier l‟hémolyse qu‟effectuent certaines bactéries. Les BGP telles que les streptocoques des groupes A, C, G sont capables de détruire complètement les globules rouges (hémolyse bêta) et formeront des colonies entourées d’une zone claire facilement visible sur la gélose rouge. Les autres sptreptocoques, des staphycocoques, des entérocoques donnent une hémolyse partielle (hémolyse alpha) dont la zone d’hémolyse sera moins claire et verdâtre.
2.4.1.3 Milieu CHROMagar ESBL
Le milieu CHROMagar ESBL est un milieu chromogénique pour un isolement des BGN produisant une ou des bêtalactamases à spectre élargi (BLSE).
Isolement des souches bactériennes
Les souches de notre collection nécessaires pour l‟étude ont été ensemencées sur des milieux spécifiques. Les espèces BGN choisies ont été Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Kluyvera georgiana, Acinetobacter baumanii, Citrobacter koseri, Proteus mirabilis. Elles ont été ensemencées sur le milieu Drigalski. Les bactéries Streptococcus agalactiae (groupe B), Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus anginosus ont été cultivées sur de la gélose au sang. Par ailleurs, le milieu CHROMagar ESBL a été choisi pour cultiver les souches de collection hébergeant des BLSE qui serviront de témoins positifs pour la détection des gènes de résistance CTX-M du groupe 1.
Les boîtes ont été incubées à 37°C pendant 18 à 24 heures. La pureté des colonies isolées a été vérifiée par la technique de spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Identification des espèces bactériennes par spectrométrie de masse type MALDI-TOF
MALDI-TOF ou Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight est une technologie apparue en 1988 basée sur l‟ionisation des échantillons. Elle permet de séparer et d‟identifier des protéines bactériennes selon leur masse et leur charge. L‟échantillon à identifier doit être déposé et bien étalé, finement sur une plaque métallique appelé « cible » et séché à l‟air libre. Puis il est couvert d‟une matrice ionisante qui est constituée de molécules cristallisées d‟acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) et d‟un solvant (Acétonitrile 50%, eau 47, 5% et acide trifluoroacétique 2, 5%). Le cible est séché à l‟air libre afin de laisser le solvant s‟évaporer ne laissant ainsi que les molécules cristallisées de CHCA et l‟échantillon. Ensuite, la cible est bombardée par un laser (Figure 8).
Extraction d’ADN par ébullition
L‟extraction d‟ADN par ébullition consiste à éclater les cellules bactériennes après un choc thermique. Il s‟agit de soumettre l‟échantillon une ébullition à 100°C pendant 10 minutes et ensuite de le transférer dans la glace conduisant à un éclatement de la paroi bactérienne et la libération de l‟ADN. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 13 000rpm pendant 5 minutes et les ADN présents dans le surnageant sont conservés à -20°C et des aliquotes sont utilisées pour les réactions LAMP et PCR.(Meugnier et al, 2007)(Brown, Amyes, 2006) Le protocole d‟extraction d‟ADN par ébullition est décrit dans l‟annexe 8.
Extraction par Tris EDTA (TE 1X)
Le TE 1X est une solution stérile préparée à partir des réactifs hautement purifiées et exempts d’activité de DNase pour le stockage et la purification de l’ADN. C‟est un agent tampon pour maintenir une solution à un pH défini. Dans cette étude, le Tris a été utilisé pour tamponner la solution urinaire afin d‟éviter l‟inhibition de la réaction PCR due à l‟interaction de la Taq polymérase avec l‟acidité de l‟urine. De plus, l‟urine contient des facteurs comme l‟urée qui pourrait également inhiber la réaction PCR en interagissant avec la Taq polymérase (Behzadbehbahani, Vallely, 1997). Avant de passer à l‟amplification par PCR, une étape d‟extraction a été effectuée. Pour ce faire, 200μl d‟urine ont été centrifugées à vitesse maximale afin de concentrer les cellules bactériennes qui ont été reprises dans 20μl de TE1X afin de diluer au maximum les facteurs inhibiteurs de la PCR de l‟urine restant dans le culot. Le produit a été porté à l‟ébullition pendant 5min pour pouvoir libérer l‟ADN intracellulaire. L‟extrait d‟ADN urinaire a été récupéré après une deuxième centrifugation à vitesse maximale durant 5min. Le produit est ainsi prêt pour l‟amplification par PCR. L‟annexe 9 décrit le détail du protocole de cette extraction par TE 1X.
Echantillon de suspension bactérienne
A partir d‟une culture jeune et pure, prendre 2 à 3 colonies et en faire une suspension bactérienne de densité 0.5McF (ce qui correspond à environ 108UFC/ml). Ces suspensions bactériennes ont été utilisées pour les différents tests LAMP et PCR.
Echantillon d’urine inoculé
Avant de valider la technique LAMP sur des échantillons cliniques (urine), plusieurs essais sur des urines stériles inoculées ont été faits, dans les mêmes conditions. Pour ce faire, l‟urine stérile a été inoculée par quelques colonies bactériennes. Cette urine inoculée mesurée par le densitomètre qui est un appareil de mesure de la turbidité d‟un échantillon.
Dosage de l’ADN
L‟appareil utilisé pour ce dosage est le Thermo ScientificNanoDrop2000c Spectrophotomètre (figure 10). Cet appareil est relié avec un ordinateur capable de déterminer la concentration des nucléotides (ADN, ARN) ainsi que des protéines dans une solution.
Le principe de ce dosage est basé sur la réalisation des spectres d‟absorbance en utilisant des petits volumes d‟échantillons. Il permet de prendre des mesures, sur une grande gamme de longueur d‟onde pour l‟analyse des spectres dans le visible et l‟UV. Les acides nucléiques comme les ARN, les ADN absorbent la lumière à 260nm. Leur mesure à cette longueur d‟onde permet de calculer leur concentration. Le rapport de l‟absorbance à 260nm et 280nm est aussi utilisé pour évaluer la pureté de l‟ADN et de l‟ARN. Les rapports d‟environ 1,8 et 2 confirment la pureté de l‟ADN et de l‟ARN respectivement. Si le rapport est faible, cela peut indiquer la présence des contaminants comme des protéines, phénol… (www.nanodrop.com).
Le dosage de l‟ADN consiste à déposer 1μl d‟extrait d‟ADN (pour l‟ADN) sur le piédestal (socle) inférieur du densitomètre. Ensuite, la machine effectue automatiquement la lecture et le résultat donnant la valeur estimative de la concentration d‟ADN apparaît sur l‟écran. L‟ADN en question sera utilisé dans l‟amplification LAMP et PCR.
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Table des matières
INTRODUCTION
Partie 1 : GENERALITES
1.1 Généralités sur Escherichia coli
1.1.1 Caractères morphologiques
1.1.2 Caractères biochimiques
1.1.3 Caractères antigéniques
1.1.4 Caractères pathologiques
1.2 Généralités sur l‟infection urinaire
1.2.1 Définition
1.2.2 Facteurs de pathogénicité
1.2.3 Traitements d‟une infection urinaire
1.3 Généralités sur la résistance aux antibiotiques
1.3.1 Définition
1.3.2 Les bêtalactamases à spectre étendu
1.3.3 Les gènes CTX-M
1.4 Généralités sur LAMP
1.4.1 Historique
1.4.2 Principe de base de la technique LAMP
Partie 2 : MATERIELS ET METHODES
2.1 Principe d‟étude
2.2 Cadre d‟étude
2.3 Population d‟étude
2.4 Etudes bactériologiques
2.4.1 Choix du milieu d‟isolement
2.4.1.1 Milieu Drigalski
2.4.1.2 Milieu de gélose au sang
2.4.1.3 Milieu CHROMagar ESBL
2.4.2 Isolement des souches bactériennes
2.4.3 Identification des espèces bactériennes par spectrométrie de masse type MALDI-TOF
2.5 Etudes moléculaire
2.5.1 Préparation de l‟échantillon pour l‟amplification
2.5.1.1 Extraction d’ADN par ébullition
2.5.1.2 Extraction par Tris EDTA (TE 1X)
2.5.1.3 Echantillon de suspension bactérienne
2.5.1.4 Echantillon d‟urine inoculé
2.5.2 Dosage de l‟ADN
2.5.3 Amplification par PCR
2.5.3.1 Principe d‟amplification
2.5.3.2 Détection du produit PCR
2.5.4 Amplification par LAMP
2.5.4.1 Conception des amorces LAMP
a) Amorces LAMP sur Escherichia coli
b) Amorces LAMP sur CTX-M du groupe 1
2.5.4.2 Etape d‟ amplification
2.5.4.3 Test de spécificité
a) Test de spécificité LAMP Escherichia coli
b) Test de spécificité LAMP CTX-M du groupe 1 in vitro
2.5.4.4 Test de sensibilité LAMP in vitro
2.5.4.5 Répétabilité
2.5.5 Validation de la technique LAMP sur des échantillons biologiques
2.5.5.1 Traitement des prélèvements
2.5.5.2 Amplification par LAMP et par PCR
Partie 3 : RESULTATS
3.1 Mise au point de la technique LAMP
3.1.1 Test de spécificité
3.1.1.1 Test de spécificité de LAMP sur E. coli
3.1.1.2 Test de spécificité de LAMP sur CTX-M du groupe 1
3.1.2 Test de sensibilité des amorces dessinées pour E. coli et pour les gènes CTX-M du groupe 1
3.1.3 Test de répétabilité
3.2 Validation sur échantillons cliniques (urines)
Partie 4 : DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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