Soutenance mémoire
Origine biogénétique des polyphénols dans Vitis vinifera
Les polyphénols sont des métabolites secondaires largement distribués dans le règne végétal, où ils existent sous forme libre ou glycosylée. Leur caractère ubiquiste fait qu’on les retrouve déjà chez les végétaux inférieurs (Bryophytes). Chez les Fougères et les Gymnospermes, ils sont présents mais peu variés structuralement, par contre ils sont très largement représentés chez les Angiospermes où leur diversité structurale est maximale 16 Il est maintenant bien établi que les voies acétate et shikimate convergent pour donner naissance à des dérivés en C6-C3-C6 (flavonoïdes) 17 et des dérivés en C6-C2-C6 (stilbènes) . D’après le mécanisme des réactions catalysées par la chalcone synthase et la stilbène (resvératrol) synthase 19 il apparaît que, dans le cas des flavonoïdes, le cycle A dérive de la voie des acétates (malonates) alors que le cycle B et les trois carbones de l’hétérocycle C proviennent du pcoumaryl-CoA (voie des shikimates). En ce qui concerne les stilbènes, les carbones 2, 3, 4, 5 et 6 du cycle A dérivent de la voie des acétates, alors que le cycle B ainsi que les carbones 1, 7 et 8 ont pour origine la voie shikimate. La voie de biosynthèse des flavonoïdes fait intervenir de nombreuses étapes, dont certaines sont encore mal connues. Par exemple, l’anthocyanidine synthase conduisant à la formation des anthocyanes n’a pas été isolée et son mécanisme réactionnel demeure indéterminé. La formation de l’épicatéchine, qui possède une configuration 2,3-cis, demeure une grande inconnue. Pourtant la stéréochimie cis est dominante dans les tannins condensés des baies de raisin 20 Selon 21 l’hypothèse la plus vraisemblable serait l’intervention d’une épimérase au niveau du 2,3-trans-dihydroquercétol.
Effets cardiovasculaires des polyphénols
Les accidents cardiovasculaires sont engendrés par deux phénomènes essentiels :
– l’oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDL) qui est considérée comme un élément clé dans le processus d’athérosclérose, engendrant la formation de plaque d’athérome au niveau de la paroi vasculaire 51,52. Ce processus se déroule sur de nombreuses années. Mais dans la majorité des accidents cardiovasculaires, la sténose des artères, due à la formation de la plaque d’athérome, est trop faible pour avoir des répercussions sur le plan hémodynamique. En effet, il intervient en général une rupture de la plaque d’athérome due à l’action vasomotrice des LDL oxydées qui inhibent la voie NO-GMPc 53
– l’agrégation des plaquettes sanguines qui conduit à la formation d’un thrombus et à l’obstruction relativement rapide du vaisseau 54 Les plaquettes sont activées par la mise à nu de l’espace sousendothélial, ce qui les met en présence des fibres de collagène ; elles adhèrent à la paroi du vaisseau, là où l’endothélium est endommagé par la plaque d’athérome . Tous les systèmes biphasiques utilisés seront issus de la gamme Arizona.97 Pour séparée un produit donné, on doit se trouver avec un coefficient de partage proche de 1 pour une élution isocratique. Pour le tester, on mélange un même volume de phase aqueuse et de phase organique de départ. Une quantité de l’extrait MTBE a ensuite été dissoute dans le mélange des deux phases. Après agitation et décantation, on prélève un même volume des 2 phases obtenues et on les compare par spectrométrie ou chromatographie. On procédera dans des petits piluliers avec seulement 4 ml de solvant au total. L’étude de l’évaluation du coefficient de partage du soluté dans les deux phases a alors été réalisé en effectuant les analyses par HPLC nous a permis de conclure que les systèmes K et M ont été les meilleurs systèmes de solvant qui convient pour une meilleure séparation des stilbénes dans l’extrait MTBE. Nous travaillons donc avec un système quaternaire biphasique (Heptane/AcOEt/MeOH/eau) et en mode élution. Dans le mode par élution, la phase mobile est pompée au travers de la phase stationnaire jusqu’à atteindre un équilibre stable entre les volumes de la phase stationnaire (Vstat ) et de la phase mobile (Vmob ) .Les phénomènes de partages sont les uniques responsables de la séparation des solutés et ces derniers émergent de l’appareil après un volume de rétention Vr donné par la relation fondamentale en chromatographie sans support solide : Vr = Vmob + KD Vstas . KD étant la constante de distribution du soluté dans ce système de solvant .C’est ce mode qui sera utilisé pour la purification de stilbénes.
ROESY
L’expérience ROSY (Rotational Overhauser Enhancement SpectroscopY ) repose sur le phénomène de relaxation dipolaire de spins nucléaires et met en évidence le couplage dans l’espace, entre protons distants de moins de 4.5Ả dans les meilleurs conditions La séquence d’impulsions est la suivante : La pulse “spin-lok“ est choisie de manière à ce que le maximum d’échange et d’effet r.O.e ait lieu .Elle varier entre 100 et 700 ms (350 ms pour un poids des taches de corrélation est inversement proportionnelle à r6, r étant la distance entre les deux noyaux interactifs.
CONCLUSION
Suites aux travaux antérieurs réalisés au laboratoire et la mise en évidence par chromatographie centrifuge de partage et chromatographie liquide haute performance de stilbénes dans la vigne, le travail qui nous à confié concerne « purification de quelques stilbénes dans la « vitis- vineféra chardonnay » Dans la première partie de ce mémoire et après bref rappel sur la nature des composés phénoliques présent dans la vigne, nous avons choisi fort naturellement d’orienter notre recherche bibliographique sur les différentes méthodes de purifications et les techniques d’isolement des stilbénes connus dans la vigne, qui s’avèrent peu nombreuse ( chromatographie liquide haute performance semi-préparative et chromatographie de partage centrifuge). Dans la deuxième partie de ce mémoire ont été rapportés les résultats personnels, la mise au point d’une méthode de séparation et de purification des composés phénoliques, alliant la chromatographie centrifuge de partage et la chromatographie haute performance nous à permit l’isolation de huit substances pures. Dans la troisième partie, la caractérisation et l’identification de ces substances par les méthodes spectroscopiques nous permettent d’affirmer que les deux composés A et B correspondent respectivement à la picéatannol et l’ampilopsine, nous avons détecter des produits trans resvératrol glycosylées qui sont C et D , deux dimères K et L correspendent aux resveratrol et l’ε-viniférine. Nous avons identifé, pour la première fois dans la plante étudier les composés M et N qui sont qui le tétramère trimère du resvératrol ne correspondent pas à des composés déjà identifiés dans notre plante. Ces traveaux sur l’isolement de polyphénols à partir de la vigne ne peuvent qu’encourager d’autres investigations pour l’identification de nouvelles structures polyphénoliques. Compte tenu de diverses propriétés pharmacologiques accordées aux stilbènes, il est nécessaire d’envisager une étude biologique des nouvelles molécules stilbèniques. Il serait également intéressant de savoir si ces substances possèdent des activités biologiques.
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Table des matières
I.INTRODUCTION
II – GENERALITES SUR LES POLYPHENOLS
II. 1 – Origine biogénétique des polyphénols dans Vitis vinifera
II. 2 – Connaissance de composition de la vigne
A .Les polyphénols de la vigne
A.1.Composition phénolique
A.1.1.Les non-flavonoïdes
A.1.1. 1-les acides phénols
A.1.1.2-Les stilbénes
A.1.2 les flavonoïdes
A.1.2.1. Les flavonols
A.1.2.2. Les anthocyanes
B . Polyphénols de la vigne et santé humaine
B.1 – Quelques données épidémiologiques
B.2 – Effets cardiovasculaires des polyphénols
B.3 – Propriétés antioxydantes des polyphénols
B.3.1 – Mode d’action des antioxydants biologiques
B .4- Mode d’action des polyphénols
B.4.1 – Biodisponibilité des polyphénols chez l’Homme
III -TECHNIQUES DE SEPARATION
III-1- Chromatographie sur couche mince (CCM)
III. 2 – Chromatographie liquide de Haute Performance, KONTRON
III .3- LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE
III- 3-1 PRICIPE
III-3-2 AVANTAGE
III-3-3 INCONVENIENTS
III-3-4- Le sens de pompage de la phase mobile
III. 3.5– Système biphasique de solvant
a) Sélection du système de solvant
IV- SEPARATION DES COMPOSES STLIBENIQUES
IV – I – La stratégie de purification
IV-2. MATERIELS ET METHODES
IV .2.1- MATERIL VEGETAL ET EXTRACTION
IV-2.2- -Fractionnement et isolement des stilbénes
IV-2.2. 1 Sélection du système de solvant biphasique
IV-. 2. 2. 2- Remplissage de la colonne par la phase stationnaire
IV- 2. 2. 3- obtention de fractions enrichies en stilbénes
IV-2.2.4- Caractérisation des stilbénes
IV-2.2.5 -Purification des stilbènes
A- Purification des stilbénes existant dans la CPC sys K
a) Purification des stilbénes existant dans les fractions 22-29
b) Purification des stilbénes existant dans les fractions 89-104 mode ascendant et 114-117 mode descendant
c) Purification des stilbénes existant dans les fractions 16-19
d) Purification des stilbénes existant dans les fractions 12-15
B- Purification des stilbénes existant dans la CPC sys M
a) purification des stilbénes existant dans les fractions 25-53
b) Purification des stilbénes existant dans les fractions 61-93
V .Détermination structurale des substances isolées
V. 1- GENERALITES
V 1.1- la RMN 2D
A- Corrélation homonucléaires
a)- COSY
b)- ROESY
B – Corrélations hétéronucléaires
a) – HMQC
b) –HMBC
V.2 -TRAVAUX PERSONNELS
V. 2-A. Analyse structurale des composés isolés
V . 2- A . 1. Détermination structurale du composé A :Picétannol
V 2- A . 2. Détermination structurale du composé B :L’ampilopsine
V 2- A . 3. Détermination structurale des composés C et D: Stilbènes glucoside
a) Etude de la structure du composé C
b) Etude de la structure du composé D
V 2- A . 3. Détermination structurale du composé K : Resvératrol trans-déhydrodimère
V . 2- A . 4. Détermination structurale du composé L : L’ε-Viniférine
V . 2- A . 5. Détermination structurale du composé M : la Vitisin C
V . 2- A . 6. Détermination structurale du composé N
VI. CONCLUSION
VII. PARTIE EXPERIMENTALE
VII.1 – GENERALITES
VII.1 . A –Méthodes chromatographiques
a) – chromatographie sur couche mince (CCM)
b) – chromatographie liquide haute performance semi préparative (HPLC)
c) – Chromatographie de partage centrifuge (CPC)
VII . 2- Spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN)
VII . 3- Matériel végétal et extraction
VII . 4 – Fractionnement par chromatographie de partage centrifuge (CPC)
VII.4.1 – Purification des fractions par chromatographie liquide haute performance (HPLC)
VII . 4.1 .a – Purification des fractions 22-29
VII . 4.1 .b – Purification des fractions 89-104 et 105-106
VII . 4.1 .c – Purification des fractions 16-19
VII . 4.1 .d – Purification des fractions 12-15
VII . 4.1 .d – Purification des fractions 12-1
1) Purification des fractions 25-53
2) Purification des fractions 61-93
– Bibliographie
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