Identification de petits ARN putatifs induits in vivo et en conditions de stress

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Les petits ARN codés en trans

La deuxième catégorie de sARN désigne des ARN codés dans une région génomique éloignée de leur ARNm cible (codés « en trans »). Contrairement aux sARN antisens, ils partagent généralement une complémentarité limitée avec leur ARNm cible, et leur zone de liaison varie généralement de 10 à 25 bases environ (Waters et Storz, 2009). Beaucoup de ces sARN agissent en se liant au niveau du site de liaison du ribosome RBS (Ribosome Binding Site), bloquant la traduction (Figure 6, A). D’autres sARN peuvent au contraire se lier au niveau d’une zone normalement capable de former une structure secondaire, et agissent en empêchant ce repliement, ce qui libère le site RBS et déclenche la traduction (Figure 6, B) (Gottesman et Storz, 2011). Parfois, la liaison se produit hors du site RBS ; la régulation de l’ARNm cible se fait alors par une augmentation de la sensibilité aux RNases, qui dégradent le complexe sARNARNm, comme c’est le cas pour les sARN SgrS et RyhB de E. coli, dont l’action est conjointe à la RNase E (Morita et al., 2005).
Beaucoup de sARN de ce type sont impliqués dans la virulence. Par exemple, le sARN VRRNA chez Clostridium perfringens régule positivement des gènes codant pour les toxines α et κ, et est lui-même régulé par un système à deux composants, VirR/VirS (VR-RNA pour « VirR regulated RNA ») (Shimizu et al., 2002)

Cas particuliers

Il existe des cas particuliers de sARN codés en cis, mais qui agissent également sur d’autres ARNm que leur cible complémentaire. Chez Staphylococcus aureus, RNAIII est connu comme étant un ARN antisens capable de réprimer toute une classe d’ARNm de gènes impliqués dans la virulence. Sa liaison avec son ARNm cible (codé en cis) crée un long ARN double brin qui est ensuite pris en charge par les RNases, en particulier la RNase III, ce qui conduit à sa dégradation. Il se fixe également par complémentarité imparfaite de base à l’ARNm du gène rot (codé en trans), ce dernier codant un régulateur transcriptionnel impliqué lui aussi dans la virulence (Boisset et al., 2007).

Les ARN liant les protéines

Certains ARN sont capables de moduler l’activité des protéines en s’y liant directement. Il s’agit alors d’une régulation au niveau post-traductionnel (Figure 4). Leur action consiste le plus souvent à séquestrer une protéine cible agissant sur l’ADN ou l’ARN en ayant une séquence mimant celle de la cible de la protéine (Figure 7)

Les CRISPR

Les CRISPR (Clustured Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sont composés de régions constantes : des courtes séquences palindromiques (24 à 47 paires de bases) répétées de 2 à 249 fois sur et de séquences variables complémentaires des acides nucléiques de bactériophages et de plasmides entre autres. Les CRISPR sont un moyen de défense contre l’ADN exogène dont les bactériophages : en se fixant sur leur ADN, elles empêchent la réplication et/ou la transcription de ceux-ci. Elles sont aussi impliquées dans des mécanismes qui empêchent la conjugaison de plasmides (Waters et Storz, 2009). Des gènes Cas (CRISPRassociated) flanquent les CRISPR et codent des protéines essentielles à leur fonctionnement qui permettent la liaison avec leur ADN ou ARN cible. L’association entre les CRISPR et la protéine Cas-9 constitue un puissant outil de biologie moléculaire, grâce à sa capacité de clivage ciblé de l’ADN (Charpentier, 2015; Luo et al., 2016).

Les ϱ’UTR (UnTranslated Region) régulatrices

Les 5’UTR sont des portions d’ARN localisées à l’extrémité 5’ de certains ARNm. Ces régions sont transcrites avec l’ARNm, mais ne sont traduites en protéines. Elles contiennent notamment la séquence de Shine-Dalgarno (SD, ou RBS) et ont une fonction régulatrice.

Régulation par blocage ou déclenchement de la traduction

Cette régulation s’opère souvent via la formation de structures secondaires, qui, en fonction de leur conformation, peuvent bloquer ou déclencher la traduction (Ruiz de los Mozos et al., 2013) ( Figure 8). La régulation par ces 5’UTR peut aussi impliquer des protéines de liaison à l’ARN ou des sARN, comme par exemple la 5’UTR du gène chiR (codant un facteur de transcription induisant les gènes codant des chitinases) chez Serratia marcescens qui est la cible du sARN répresseur ChiX (Suzuki et al., 2016).
Il existe également des types particuliers de 5’UTR, tels que les riboswitches et les thermosenseurs (Oliva et al., 2015).
Les riboswitches sont des 5’UTR capables de fixer un métabolite. Cela produit un changement de conformation de l’ARN, ce qui induit ou réprime la transcription ou la traduction du(es) gène(s) en aval, qui est(sont) le plus souvent impliqué(s) dans l’acquisition ou l’utilisation de ce métabolite (Waters et Storz, 2009; Oliva et al., 2015). Certains riboswitches permettent la résistance aux antibiotiques. En effet, Jia et al. ont mis en évidence l’existence d’un riboswitch répondant aux aminoglycosides et présent dans la région 5’UTR de gènes impliqués dans la résistance à cette famille d’antibiotique (Jia et al., 2013).
Les thermosenseurs, quant à eux, sont des 5’UTR capables de moduler l’expression des gènes par des changements de conformations dus à des variations de température (Oliva et al., 2015). Classiquement, une augmentation de la température défait des structures secondaires bloquant la séquence RBS. Le thermosenseur fourU par exemple est situé sur la 5’UTR de plusieurs gènes de virulence chez des bactéries pathogènes comme Yersinia pestis, Samonella Typhimurium et Listeria monocytogenes (Kortmann et Narberhaus, 2012).

Régulation par terminaison prématurée de la transcription

D’autres 5’UTR agissent en provoquant une terminaison prématurée de la transcription de l’ARNm (Ruiz de los Mozos et al., 2013) par la formation d’un terminateur sur le fragment d’ARN néo-transcrit. Ce terminateur peut être déroulé par exemple par l’action d’un antiterminateur ou d’une autre molécule effectrice.
Ainsi chez E. coli, l’opéron bgl est constitué de deux gènes, bglG et bglF, le premier codant pour l’anti-terminateur, et le deuxième pour un système PTS spécifique des β-glucosides. Le rôle de BglG est d’auto–réguler l’opéron bgl en déroulant le terminateur situé sur sa 5’UTR (Amster-Choder, 2005) (Figure 9).

Les protéines impliquées dans le métabolisme des ARN

La régulation par les ARNs met également en jeu des protéines impliquées dans leur stabilisation ou leur dégradation.

Les protéines chaperonnes à ARN

La liaison entre un sARN et un ARNm peut être modulée par une protéine chaperonne, comme la protéine Hfq découverte chez E. coli, et présente chez de nombreuses espèces bactériennes mais aussi chez certaines Archeae (Attaiech et al., 2017; Santiago-Frangos et Woodson, 2018).
Son rôle est de faciliter la liaison entre les sARN et leur ARNm cible, mais elle est aussi impliquée dans d’autres mécanismes tels que la traduction et le quorum-sensing (Lenz et al., 2004; Santiago-Frangos et Woodson, 2018). Cependant, les Firmicutes des genres Lactococcus, Streptococcus et Enterococcus ne possèdent pas cette protéine (Sun et al., 2002). D’autres protéines chaperonnes de l’ARN ont été découvertes, comme ProQ chez Salmonella enterica, ou RocC chez Legionella pneumophila, mais il s’avère que ces protéines sont également absentes chez les Firmicutes (Attaiech et al., 2017). Chez E. faecalis, une Cold-Shock Protéine, CspR, est soupçonnée de tenir ce rôle de chaperonne de l’ARN (Michaux et al., 2012).

Le dégradosome

Le dégradosome est un complexe de protéines dont le rôle premier est la dégradation des ARNm. Il est notamment directement impliqué dans la régulation post-transcriptionnelle en dégradant les ARN bicaténaires formés par la liaison entre les sARN et leur ARNm cible. Le rôle du dégradosome est prépondérant pour le fitness de la cellule (Khemici et Carpousis, 2003; Lehnik‐Habrink et al., 2010).
Chez E. coli, les principales protéines du dégradosome sont les exonucléases RNase E et PNPase (polynucléotide phosphorylase), l’hélicase RhlB et l’enzyme glycolytique énolase. L’enzyme centrale de ce mécanisme est la RNase E, qui clive les ARNm par son activité endonucléase. La dégradation de l’ARNm se poursuit ensuite grâce à la PNPase, qui possède une activité 3’exonucléase.
Chez les bactéries à Gram positif, la RNase E est le plus souvent absente. Chez B. subtilis et S. aureus, les acteurs principaux du dégradosome ont été identifiés : la RNase J1, la RNase J2, la RNase Y, la PNPase, l’énolase, la phosphofructokinase PfkA et une hélicase à motif DEAD (CshA) (Figure 10) (Lehnik‐Habrink et al., 2010; Roux et al., 2011).
Le rôle de l’énolase est peu connu, bien que son importance dans la dégradation des ARNm ait déjà été démontrée (Carpousis, 2007; Lehnik‐Habrink et al., 2010). Chez B. subtilis, elle interagit avec la phosphofructokinase PfkA, toutes deux étant des enzymes glycolytiques, et avec la RNase Y, elle-même associée à la RNase J1, indiquant un rôle dans la coordination de la formation du dégradosome (Newman et al., 2012; Lehnik-Habrink et al., 2012).

Les RNases

La RNase Y de B. subtilis est une endoribonucléase considérée comme l’équivalent fonctionnel de la RNase E d’E. coli. Liée à la membrane, elle initie la dégradation des ARN en interagissant avec le reste du dégradosome (Lehnik-Habrink et al., 2011) et en effectuant un clivage interne des ARN à extrémité triphosphate, générant un ARN à extrémité monophosphate (Laalami et Putzer, 2011). Elle est également impliquée dans le turnover des ARN, dans le fonctionnement de certains riboswitches, et dans la dégradation d’ARNm très structurés (Lehnik‐Habrink et al., 2010; Roux et al., 2011).
Les RNases J1 et J2 sont deux enzymes paralogues (70% de similarité d’acides aminés chez B. subtilis) possédant des activités endonucléolytique et exonucléolytique. Elles jouent un rôle prépondérant dans la maturation des ARN, mais aussi dans leur dégradation. Elles sont en effet des acteurs principaux du dégradosome chez B. subtilis et S. aureus. Elles exercent ensemble une activité de clivage interne équivalente à celle de la RNase Y et de la RNase E d’E. coli (Roux et al., 2011; Jamalli et al., 2014), mais aussi une activité exonucléasique des ARN à extrémités monophosphate issus de tels clivages (Laalami et Putzer, 2011).
La RNase III est une autre RNase présente chez E. coli et chez certaines bactéries à Gram positif comme E. faecalis (39% d’identité protéique, Johnson et al., 2011), ou S. aureus (Lioliou et al., 2012). Elle a un rôle dans la dégradation des ARN, notamment par sa capacité à cliver les ARN à extrémité triphosphate, fonction absente chez les RNases E, J1 et Y. Les ARN à extrémité monophosphate ainsi produits sont ensuite ciblés par les autres RNases du microorganisme.
Elle est également capable de cliver les ARN double brins, ce qui indiquerait un rôle dans la dégradation des complexes sARN-ARNm. Elle est aussi connue pour son activité de répression sur l’expression de plusieurs gènes codant pour des facteurs de virulence chez S. aureus (Johnson et al., 2011; Lioliou et al., 2012).
La PNPase est une RNase avec une activité exonucléasique 3’–5’. Son rôle est de dégrader les ARN de petite taille générés par les clivages des RNases J1 et Y (Lehnik-Habrink et al., 2012).

Les hélicases à motif DEAD

Les hélicases à ARN jouent un rôle crucial dans le métabolisme des ARN. Elles forment 6 superfamilles avec les hélicases à ADN et les translocases à ADN et ARN, selon leur séquence en acides aminés. Ces superfamilles regroupent des enzymes eucaryotes comme procaryotes, les hélicases bactériennes appartenant aux superfamilles 2 et 5 (Kaberdin et Bläsi, 2013). De manière générale, les hélicases à ARN sont capables de modifier les structures de l’ARN et les interactions protéines-ARN. Elles sont ainsi impliquées dans de nombreux processus essentiels pour la cellule tels que le turnover des ARN, la synthèse des ribosomes, la traduction et le métabolisme des petits ARN (Owttrim, 2013; Khemici et Linder, 2016).
Les hélicases à motif DEAD sont une famille d’hélicases monomériques ou dimériques faisant partie de la superfamille 2. Elles possèdent au moins 12 motifs conservés en acides aminés (Figure 11), dont celui qui leur a donné leur nom, le motif DEAD (pour les 4 acides aminés qui le compose : Asp – Glu – Ala – Asp). Ces motifs sont contenus dans deux domaines répétés en tandem, appelés « RecA-like » en raison de leur ressemblance structurelle avec la protéine recombinase RecA. Ces deux domaines forment une crevasse qui correspond au site de liaison de l’ATP (Linder et Jankowsky, 2011). Leurs domaines terminaux (N-terminal, C-terminal ou les deux), déterminent leur spécificité avec leur substrat ARN ou un cofacteur protéique (Cordin et al., 2006; Owttrim, 2013). Contrairement aux autres hélicases, elles ne sont capables de dérouler que des structures ARN ou ADN-ARN courtes (Khemici et Linder, 2016), mais elles sont impliquées dans presque l’ensemble des métabolismes de l’ARN, de leur synthèse à leur dégradation (Cordin et al., 2006).

Souches et conditions de culture

La souche Enterococcus faecalis V19 a été utilisée pour cette étude et a été cultivée à 37°C en milieu M17 supplémenté en glucose (0,5%) (GM17) ou en ribose (0,5%) (RM17) pour les tests devant être réalisés en absence de répression catabolique. Pour les conditions stressantes, le milieu a été supplémenté en sels biliaires (0,06%) ou son pH a été ajusté à 5,8. Le milieu a été supplémenté avec du chloramphénicol (10 µg/ml) pour les souches contenant le plasmide pAGEnt, pLT06 ou pNZ273, et avec de l’agmatine (40mM) pour toutes les souches contenant pAGEnt. Les souches E. coli DH5α ont été cultivées en milieu LB à 37°C. Pour les souches contenant le plasmide pLT06, les cultures ont été incubées à 30°C. Lactococcus lactis utilisé pour la réalisation des constructions dans le plasmide du pAGEnt a été cultivé en GM17 à 30°C.

Techniques de biologie moléculaire

Les PCR ont été réalisées avec les enzymes Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, USA) ou GoTaq DNA Polymerase (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Le kit 5’/3’ RACE kit, 2nd generation (Roche, Bâle, Switzerland), a été utilisé suivant les recommandations du fournisseur pour les 5’RACE-PCR. Celles-ci ont été obtenues en ajoutant des extensions poly-A ou poly-C à l’ADN complémentaire et en utilisant les amorces SP1, SP2 et SP3 (Tableau 3). Ce même kit a été utilisé pour les 3’RACEPCR après avoir ajouté une extension poly-A en 3’ des ARN, avec le kit poly(A) polymerase tailing kit (Epicentre, Madison, Wisconsin, USA). Toutes les purifications de produits PCR ont été effectuées à l’aide du kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany), et toutes les extractions plasmidiques ont été réalisées avec le kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel).

CoŶstƌuctioŶ d’uŶ plasŵide peƌŵettaŶt la surexpression de SRC65

Le plasmide pAGEnt (Linares et al., 2014) a été utilisé pour surexprimer SRC65 grâce au promoteur inductible par l’agmatine. Le plasmide a été amplifié par les oligonucléotides RPV_AGEnt+1 et FRV_AGEnt_Term, sans inclure le His-Tag et la séquence Shine-Dalgarno.
Le fragment à insérer a été amplifié avec les oligonucléotides FPI_SRC65_+2 et RPI_SRC65_Term qui possèdent des queues flottantes complémentaires au plasmide (Tableau 3). L’ensemble a été assemblé par recombinaison in vivo, ou avec le kit NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, USA) en utilisant L. lactis MG1363 comme hôte. Le plasmide a ensuite été extrait et introduit dans E. faecalis V19.

Construction du mutant ΔSRCϲϱ

La souche mutante ΔSRC65 a été construite chez E. faecalis V19 et en utilisant la souche E. coli DH-5α pour toutes les étapes de clonage. Le plasmide pLT06 a été amplifié avec lesamorces pLT06-1 et pLT06-2, et les régions flanquantes de SRC65 ont été amplifiées avec les couples d’oligonucléotides SRC_65_1/SRC_65_2 et SRC_65_3/SRC_65_4 (Tableau 3). Le clonage a été réalisé à l’aide du kit NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England BioLabs) et le plasmide obtenu a été utilisé pour transformer E. coli. Un fois répliqué, le plasmide a été introduit chez E. faecalis par éléctroporation selon le protocole décrit par Bae et al., 2002 (avec 10 g/ml de lysozyme et mutanolysine 10 U pour le traitement des cellules compétentes) et intégré dans le chromosome par double crossing over, comme décrit auparavant (Thurlow et al., 2009). Le mutant a été vérifié par PCR et par séquençage avec les amorces SRC_65_5 et SRC_65_6. La procédure utilisée pour la tentative de construction du mutant ΔSRC90 a été la même, avec les oligonucléotides SRC_90_1, SRC_90_2, SRC_90_3, SRC_90_4, SRC_90_5 et SRC_90_6.

Northern blot

Les expériences ont été réalisées avec 10 µg d’ARN total comme décrit antérieurement (Shioya et al., 2011). La sonde utilisée a été synthétisée par PCR avec les couples d’oligonucléotides SRC65_Forward/SRC65_SP1 et src90_Forward/SRC90_SP1 pour SRC65 et SRC90, respectivement (Tableau 3). Des dATP-[α32P] ont été incorporés aux sondes lors de l’étape d’élongation de la PCR.

Extraction d’ARN total

Pour les conditions non stressantes, 10 à 100 ml de cultures en bouillon GM17 ont été incubés à 37°C jusqu’à DO600 0,5. Pour les conditions stressantes, les bactéries ont été cultivées jusqu’à DO600 0,3, centrifugées et resuspendues dans du GM17 liquide supplémenté en sels biliaires (0,06%) ou avec un pH ajusté à 5,8 et incubées à 37°C pendant 30 minutes. Les cellules ont été centrifugées puis lysées au FastPrep (MP Biomedicals, Illkirch Graffenstaden, France).
L’extraction des ARN a été réalisée au moyen d’une séparation avec du TRIzol Reagent (ThermoFisher) et du chloroforme isoamylique. Puis les ARNs ont été purifiés à l’aide du kit Direct-Zol RNA Miniprep kit (Zymo-Research, Irvine, Californie, USA), et quantifiés au Nanodrop™ 2000 (ThermoFisher). Leur qualité a été vérifiée par migration sur un gel d’agarose contenant de la javel, comme précédemment décrit (Aranda et al., 2012).

RT-PCR et RT-PCR quantitative (RT-qPCR)

Les étapes de rétrotranscription ont été réalisées à l’aide du kit QuantiTect Reverse Transcritption kit (Qiagen, Venlo, Pays-Bas). Les PCR pour les expériences de RT-PCR ont été réalisées comme une PCR classique, avec une amorce sens complémentaire du gène amont, et une amorce antisens complémentaire du gène aval (Tableau 3). Le kit GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, Wisconsin, USA) a été utilisé pour les expériences de qPCR, avec l’appareil C1000™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, Californie, USA). Les oligonucléotides utilisés (L/R ou G/D) sont listés dans le tableau 3. Les conditions suivantes ont été utilisées pour toutes les expériences : 95°C pendant 3 minutes, suivies de 40 cycles à 95°C pendant 15 secondes et 60°C pendant 1 minute. La spécificité de l’amplification a été vérifiée grâce à une courbe de fusion faisant suite aux cycles d’amplification. Le gène de ménage gyrA (oligonucléotides GyrAL et GyrAR) a servi de gène de référence pour normaliser les niveaux de transcription de chaque gène. L’ADN génomique de la souche V19 a été utilisé pour l’établissement des courbes standards et le calcul de l’efficacité de la qPCR.

Extraction des protéines totales

Pour chacune des extractions, 50 ml de culture ont été incubées jusqu’à DO600 0,5. Les cellules ont été lavées avec du Tampon 2DE (Tris 50 mM pH8.0, 1 mM PMSF) et lysées au FastPrep (MP Biomedicals). Les cellules lysées ont été centrifugées et le surnageant a été récupéré. Les acides nucléiques ont été éliminés en ajoutant 10 µl de Nuclease Mix (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA) par ml de surnageant. L’ensemble a été incubé à température ambiante pendant 45 min. Les protéines ont été précipitées en ajoutant 4 volumes de tampon de précipitation (Acétone 80%, 20% Tris 50 mM pH8.0, DTT 20 mM, TCEP 5mM) et en laissant incuber une nuit à -20°C. Les protéines ont été quantifiées par la méthode de Bradford (Bradford, 1976).

Table des matières

Introduction
I. CoŶtexte de l’Ġtude
II. Le genre Enterococcus
1. Historique
2. Caractéristiques du genre Enterococcus
3. Enterococcus faecalis
a) Environnement et applications
b) Données génomiques
c) Opportunisme et virulence
d) Métabolisme
III. La régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle par les ARN régulateurs
1. GĠŶĠralitĠs sur la rĠgulatioŶ de l’expressioŶ des gğŶes
2. Les petits ARN
a) Les petits ARN codés en cis
b) Les petits ARN codés en trans
c) Cas particuliers
3. Les ARN liant les protéines
4. Les CRISPR
5. Les ϱ’UTR ;UnTranslated Region) régulatrices
a) Régulation par blocage ou déclenchement de la traduction
b) Régulation par terminaison prématurée de la transcription
6. Les ϯ’UTR rĠgulatriĐes
IV. Les protéines impliquées dans le métabolisme des ARN
1. Les protéines chaperonnes à ARN
2. Le dégradosome
a) Les RNases
b) Les hélicases à motif DEAD
V. Les ARNs régulateurs chez E. faecalis
VI. Contexte et objectifs
Matériel et Méthodes
Résultats
Chapitre 1 : Identification de petits ARN putatifs induits in vivo et en conditions de stress
Publication 1 : Identification of the general stress stimulon related to colonization in Enterococcus faecalis
Chapitre 2 : Etude du rôle et de l’aĐtioŶ d’uŶ petit ARN rĠgulateur agissaŶt en trans
Chapitre ϯ : Etude des ŵĠĐaŶisŵes de rĠgulatioŶ d’uŶe ϱ’UTR possĠdaŶt un terminateur de transcription
1. Contexte : dĠĐouverte de la ϱ’UTR
2. Publication 2 : Characterization of a Bgl antiterminator in Enterococcus faecalis
3. Résultats complémentaires
Chapitre ϰ : CaraĐtĠrisatioŶ d’uŶe hĠliĐase à ŵotif DEAD rĠgulĠe par uŶe rĠgioŶ ϱ’ ŶoŶ traduite ;ϱ’UTRͿ
1. Publication 3 : Study of RNA metabolism actors in Enterococcus faecalis
2. Résultats complémentaires
Discussion générale et perspectives
Références

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