Soutenance mémoire
Les hydrogels sont définis comme des réseaux polymères gonflés d’eau. Leurs propriétés sont très variables en fonction des polymères utilisés et de leurs interactions avec le solvant. Un hydrogel est dit stimulable s’il peut subir des changements physiques ou chimiques en réponse à un stimulus. La découverte de tels matériaux a ouvert les portes d’un vaste domaine de recherche et leur conception a fait l’objet de nombreuses applications notamment dans le domaine de la culture cellulaire, de la délivrance de médicaments, mais également dans des capteurs ou systèmes de micro fluidiques. Différents stimuli externes ont été utilisés pour solliciter de tels systèmes, par exemple la température, le pH ou encore la lumière. La versatilité des hydrogels en fait des matériaux ajustables, sur mesure, dédiés à l’application désirée. De nombreux travaux réalisés au cours des dernières années ont utilisé des hydrogels biocompatibles comme plateformes de culture cellulaire en deux ou trois dimensions.
Dans les tissus, les cellules perçoivent leur environnement par l’intermédiaire de signaux biochimiques et mécaniques. Ceux-ci influencent les comportements cellulaires, tels que leur prolifération, leur migration ou leur différenciation. Les hydrogels permettent d’étudier les comportements biologiques dans des environnements ressemblant à la matrice extra-cellulaire, qui entoure les cellules dans leur milieu naturel. Cependant, des hydrogels statiques, aux propriétés immuables, ne suffisent pas pour comprendre les mécanismes biologiques complexes, qui ont lieu dans une matrice en constant changement. La nécessité de trouver de nouveaux systèmes, dynamiques, a ouvert un champ de recherche important en biologie, mettant à profit les hydrogels stimulables. Plus précisément, des hydrogels à rigidité contrôlable, qui sont des candidats idéaux pour l’étude approfondie des relations entre développement cellulaire et contraintes mécaniques.
La mécanobiologie s’intéresse aux conséquences des contraintes mécaniques sur les comportements de cellules ou de tissus vivants. La mécanique de la matrice extra-cellulaire régit en effet de nombreux processus biologiques, parmi eux, les phénomènes impliqués dans la fonction cardiaque. De nombreux efforts ont été faits afin de régénérer des tissus cardiaques endommagés. Par exemple, l’utilisation de cellules souches embryonnaires a montré un grand succès pour la réparation de tissus cardiaques. Cependant, des problèmes d’arythmie courants traduisent une mauvaise cohésion des cellules au sein du nouveau tissu. Le tissu cardiaque contractile est particulièrement sensible aux propriétés mécaniques de son environnement. L’application de contraintes mécaniques à l’aide d’un hydrogel stimulable pourrait apporter de nouvelles connaissances en termes de création de cardiomyocytes plus robustes dans le temps. En effet, l’équipe de recherche du Dr. C. Galès, partenaire du projet, de l’Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (I2MC), étudie les relations entre l’architecture du tissu cardiaque (plus précisément des cellules contractiles cardiaques) et les fonctions du cœur. L’objectif initial de ce projet ANR a été le développement d’un hydrogel stimulable qui permettrait de simuler les propriétés mécaniques de la matrice de cellules saines et malades afin d’étudier les réponses cellulaires qui y sont associées. Un tel hydrogel a ensuite été envisagé pour servir de porte-échantillons pour l’imagerie d’échantillons biologiques vivants in vitro en microscopie. Plus particulièrement, la microscopie photonique, qui permet l’imagerie du vivant en trois dimensions, a été une application visée par ce projet de thèse. Un travail de post-doctorat effectué par le Dr. J. RoyesMir a servi de preuve de concept au travail réalisé lors de cette thèse. Un premier hydrogel à rigidité photo-contrôlable avait alors été mis au point. Ce gel mettait en jeu la formation et dissociation de complexes hôte/invité sensibles à la lumière, qui modifiaient ses propriétés mécaniques. Il s’agit de l’un des premiers systèmes montrant des changements de propriétés mécaniques d’une telle amplitude. Cet hydrogel possède néanmoins certains défauts que ce projet propose de pallier. Premièrement, il nécessite de la lumière ultra-violette pour perdre en rigidité et de telles radiations sont peu adaptées à des applications en biologie car elles sont néfastes pour les cellules et pénètrent très peu les tissus. De plus la synthèse du gel n’a pas pu être éxécutée sans l’ajout d’un cosolvant organique, dont on aimerait s’affranchir. L’objectif de ce manuscrit est de décrire les pistes explorées dans l’optique de former des hydrogels à rigidité photo-contrôlable à l’aide de lumière visible pour l’étude de relations entre la mécanique de la matrice extra-cellulaire et les comportements cellulaires.
L’environnement cellulaire
La matrice extra-cellulaire (MEC)
La matrice extra-cellulaire (MEC) regroupe l’ensemble des composantes extracellulaires qui forment un réseau en trois dimensions. C’est elle qui donne au tissu ses propriétés biomécaniques et structurelles. Il s’agit d’un système très dynamique qui régit de nombreux processus cellulaires .
La composition précise et la structure de la MEC varie selon les tissus. Ses deux composantes majoritaires sont des protéines fibreuses (collagène, laminine, fibronectine, élastine) et les glycanes (protéoglycanes (PGs) et glycosaminoglycanes (GAGs) . Les GAGs remplissent les interstices de la MEC. Ils sont chargés négativement et séquestrent les molécules de signalisation telles que les facteurs de croissance. Le collagène (souvent de type I ou II) est associé à d’autres protéines ainsi qu’aux PGs pour former une matrice fibrillaire structurée en 3D . Cette matrice joue un rôle essentiel dans le contrôle des fonctions et mécanismes cellulaires, notamment de par ses propriétés mécaniques.
Cellules et rigidité de la MEC
La MEC est sécrétée par les différentes cellules de l’organisme, épithéliales, endothéliales, immunitaires, fibroblastes etc… Toutes ces cellules sont entourées et intégrées dans le réseau de matrice. Elles interagissent par ailleurs avec la MEC grâce à leurs récepteurs de surface comme les intégrines, les récepteurs à domaine discoïdine, les PGs de surface ou les récepteurs d’acide hyaluronique CD44 . Ainsi, les cellules sont capables de recevoir des signaux de la MEC qui dictent leur comportement. Des facteurs de croissance tels que des cytokines ou chimiokines sont intégrés à la MEC et peuvent être libérés, quand les conditions nécessaires sont réunies, pour agir sur les cellules. Notamment, les modifications de rigidité de leur environnement influencent l’adhésion, la dynamique des cellules et leur activité métabolique ainsi que leur morphologie et la conformation de l’intégrine . En effet, les cellules possèdent des récepteurs qui leur permettent de sentir la rigidité de leur environnement changer. Ainsi, la MEC peut guider les cellules en jouant sur ses propriétés internes comme la porosité, la rigidité ou encore la topographie. Par exemple, grâce à sa forte rigidité sur le site d’une blessure, la MEC attire les cellules nécessaires à la réparation des tissus . Cette capacité qu’ont les cellules à suivre un gradient de rigidité de la MEC est appelée durotaxie.
De nombreux autres phénomènes biologiques tels que la croissance, la migration, la différentiation, la survie, l’homéostasie, et la morphogenèse , sont ainsi régis ou guidés par les propriétés de la MEC. Les cellules contribuent également à la constante réorganisation spatiale de la MEC en contrôlant sa production et sa dégradation. En effet, c’est par l’intermédiaire d’enzymes produites par les cellules, les métalloprotéases matricielles (MMPs pour « matrix metalloproteinases »), que celles-ci peuvent dégrader la MEC pour, ensuite, la remodeler . Les modifications et réarrangements de la MEC sont des mécanismes importants puisqu’ils permettent de réguler les fonctions et processus cellulaires comme le renouvellement de cellules souches ou encore la cicatrisation .
La MEC est un environnement complexe et dynamique qui régule les comportements cellulaires. La coordination multifactorielle entre cellules et MEC participe au bon fonctionnement des organismes, cependant, il n’est pas rare d’observer des anomalies dans le fonctionnement de cette dynamique complexe.
Anomalies et développement de pathologies
Une dynamique anormale de la MEC engendre des migrations, proliférations et morts cellulaires dérégulées, ainsi qu’une perte de différenciation. Les conséquences de tels événements sont graves puisqu’elles favorisent la formation de fibrose dans les tissus et le développement de cancers . Par exemple, ces dérèglements sont particulièrement probables suite à une blessure, durant le processus de cicatrisation. Ils sont dus à une altération de l’équilibre entre la dégradation de la MEC et sa production. Dans ces conditions, la MEC est surproduite, à cause d’une suraffluence de fibroblastes, et donc très rigide. Ces zones où la MEC a remplacé le tissu natif sont dites fibreuses, atteinte de fibrose. Le tissu perd ainsi en fonctionnalité, ce qui peut conduire au dysfonctionnement d’organes vitaux . La fibrose peut survenir dans presque toutes les parties du corps et représente une cause majeure de morbidité et mortalité dans le monde . Lorsqu’elle touche le cœur, la fibrose génère notamment de l’arythmie et de l’insuffisance cardiaque . Il a également été montré que la rigidité des tissus fibreux jouait un rôle de catalyseur dans la prolifération de certains cancers .
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 : Introduction bibliographique
I. L’environnement cellulaire
I.1.La matrice extra-cellulaire (MEC)
I.2.Cellules et rigidité de la MEC
I.3.Anomalies et développement de pathologies
II. Généralités sur les hydrogels
II.1. Définitions
II.2. Les hydrogels naturels
II.3. Les hydrogels de synthèse
III. Molécules photo-sensibles et photo-commutables
III.1. Définition et intérêt
III.2. L’azobenzène
III.3. Azobenzènes stimulables directement et de façon réversible dans le visible
III.4. Activation via transfert d’énergie dans le visible
IV. Complexes d’inclusion avec les cyclodextrines
IV.1. Les cyclodextrines
IV.2. Modélisation de l’interaction hôte/invité avec l’AZO
IV.3. Paramètres influençant la formation du complexe AZO/CD
IV.4. Complexes supramoléculaires entre dérivés d’azobenzène et cyclodextrine
V. Hydrogels sensibles à la lumière au service de la biologie
V.1. Hydrogels à rigidité contrôlable par la lumière
V.2. Systèmes réversibles à base d’azobenzène
VI. Conclusion et objectifs de la thèse
CHAPITRE 2 : Propriétés physico-chimiques de dérivés d’azobenzène solubles dans l’eau et de leurs complexes avec les cyclodextrines
I. Etude préliminaire d’un azobenzène soluble dans l’eau
I.1.Méthodologie globale de l’étude
I.2.L’azobenzène-POE (AZO-POE)
I.3.Formation et caractérisation de complexes supramoléculaires avec les cyclodextrines
II. Caractérisation physico-chimique des azobenzènes tétra-fluoré et dichloro-difluoré
II.1. Synthèses
II.2. Thermosensibilité du POE et mise en évidence de LCST
II.3. Isomérisation photochimique des 4F-AZO et 2Cl2F-AZO
II.4. Isomérisation thermique des 4F-AZO-POE et 2Cl2F-AZO-POE
II.5. Complexation des 4F-AZO-POE et 2Cl2F-AZO-POE avec la β-CD
III. Conclusion
CHAPITRE 3 : Synthèse et caractérisation d’hydrogels photo-stimulables
I. Synthèse d’hydrogels photo-stimulables
I.1.Choix des briques utilisées pour la synthèse de gels
I.2.Synthèse, préparation et caractérisation des briques utilisées dans la synthèse d’hydrogels photo-sensibles
I.3.Choix des formulations, plans d’expériences
I.4.Premières synthèses d’hydrogels et optimisation du protocole de synthèse
I.5.Synthèse de gels optimisés à base de β-CD-m-POE selon le deuxième plan d’expériences
I.6.Autres synthèses d’hydrogels
II. Caractérisation des hydrogels photo-stimulables
II.1. Taux de gonflement des hydrogels macromoléculaires
II.2. Caractérisation de la microstructure des hydrogels pas microscopie électronique à balayage (MEB)
II.3. Photo-stimulation d’un hydrogel
II.4. Détermination de la rigidité par test de compression
II.5. Caractérisation des propriétés mécaniques des hydrogels par microscopie à force atomique (AFM)
III. Etude des propriétés du terpolymère et de son interaction avec la β-CD
III.1. Complexation de 4F-AZO-terpolymère avec la β-CD ?
III.2. Auto-organisation du terpolymère dans l’eau
III.3. Alternatives envisagées pour forcer la complexation
IV. Conclusion
CHAPITRE 4 : Propriétés et biocompatibilité d’hydrogels photo-stimulables
I. Etude de gels modèles d’agarose
I.1.Sensibilité des cellules à la rigidité de la matrice extra-cellulaire
I.2.Caractérisation mécanique de gels d’agarose de différentes rigidités
I.3.Agarose au contact de HEK 293T
I.4.Conclusion
II. Biocompatibilité des gels macromoléculaires
II.1. Incubation avec le milieu de lavage conditionné
II.2. Incubation directe au contact de l’hydrogel après lavage
II.3. Conclusion
III. Imagerie de tissus cardiaques de souris encapsulés dans un hydrogel macromoléculaire
III.1. Organisation du tissu cardiaque
III.2. Imagerie en microscopie confocale
III.3. Imagerie en microscopie à feuille de lumière (SPIM)
IV. Conclusion
CONCLUSION GENERALE
MATERIEL ET METHODES
Références
Annexes
