Hybridation ADN-ADN

Hybridation ADN-ADN

Bacillus cere us sensus stricto

L’espèce B. cereus au sens strict est capable de coloniser différents habitats. Elle est fréquemment isolée à partir du sol, de plantes et de l’intestin de différents animaux. Elle est capable de synthétiser des enzymes extracellulaires d’intérêt industriel, des toxines et des antibiotiques. En 1887, Frankland et Frankland ont isolé Bacil/us cereus à partir de l’air d’une étable au Royaume-Uni. La bactérie isolée est la souche type de B. cereus (ATCC 14579) (Skerman et al., 1980). Depuis 1906, plusieurs épidémies d’empoisonnements alimentaires ont été déclarées en Europe.

De 1947 à 1949, Steinar Hauge, un chercheur norvégien, a examiné quatre cas d’empoisonnement alimentaire chez 600 personnes. Il a remarqué que le dessert consommé par ces personnes contenait de la farine de maïs qui était contaminée avec des spores de B. cereus (104 spores par gramme). Il devient alors le premier chercheur à fournir un rapport complet sur les cas d’empoisonnements et à prouver l’implication de B. cereus dans ces intoxications alimentaires (Hauge, 1955). En 1961, les autorités sanitaires américaines reconnaissent pour la première fois le rôle de B. cereus dans l’empoisonnement alimentaire. La pathogénicité de B. cereus provient de sa capacité à produire plusieurs facteurs de virulence tels que des phospholipases, des entérotoxines et des toxines émétiques (céreulides) entrainant des toxi-infections alimentaires. Les souches pathogènes de B. cereus sont capables de contaminer toutes sortes de nourriture comme le lait, les légumes, la viande, le poisson, le riz, la pomme de terre, le fromage, etc. Les spores des souches pathogènes de B. cereus adhèrent à l’épithélium de l’intestin grêle, germent et produisent des toxines (Granum et Lund, 1997; Kotiranta et al., 2000). Aussi, certaines souches de B. cereus sont responsables d’ infections locales ou systémiques sévères chez l’homme comme la septicémie et l’énophtalmie (Drobniewski, 1993; Helgason et al., 2000; Kotiranta et al., 2000).

Bacillus thuringiensis

L’espèce B. thuringiensis est caractérisée par la production d’une inclusion parasporale au moment de la sporulation. Cette inclusion parasporale, appelée également cristal, présente chez certaines souches des propriétés insecticides. La bactérie Bacillus thuringiensis a été isolée initialement en 1901 par le bactériologiste japonais Shigetane Ishiwata à partir de larves mortes de vers à soie (Bombyx mori, Lepidoptera: Bombycidae). Il l’a alors appelé «Sottokin », ce qui signifie «mort soudaine Bacillus ». Ishiwata a décrit les symptômes observés chez les larves de vers à soie quand elles étaient exposées à ce Baci/lus. Ensuite, il a conclu que les intoxications observées étaient provoquées par des toxines (Ishiwata 1905a, 1905b). En 1911, un scientifique allemand, Ernst Berliner, a isolé une bactérie similaire à partir de larves mortes de la pyrale de la farine (Anagasta kuehniella, Lepidoptera : Pyralidae) dans l’état de Thuringe en Allemagne (Berliner 1911, 1915). Berliner a fourni une description scientifique de cette bactérie qu’il a ensuite nommé Baci/lus thuringiensis en utilisant la nomenclature scientifique binomiale. En 1916, deux scientifiques japonais, Aoki et Chigasaki ont rapporté que la toxicité de l’isolat d’Ishiwata était présente dans une culture sporulée, mais absente dans une jeune culture composée de cellules végétatives. D’après leurs données sur l’inactivation de la toxine par des acides, le phénol, le chlorure de mercure et la chaleur, ils conclurent que la toxine était de nature protéique.

Vers 1930, on assistait à la première utilisation de B. thuringiensis comme insecticide biologique, d’abord en Hongrie, ensuite en Yougoslavie. Suite aux résultats prometteurs, la France a entamé la première production commerciale de B. thuringiensis qu’elle a nommée Sporeine. Vers 1950, l’intérêt grandissait aux États-Unis pour utiliser B. thuringiensis afin de contrôler les lépidoptères ravageurs de cultures. Grâce au succès des formulations à base de B. thuringiensis contre les insectes de l’ordre des lépidoptères, les recherches pour trouver d’autres bactéries entomopathogènes contre les insectes ravageurs des ordres des diptères et coléoptères se sont intensifiées. Aujourd’hui, on estime que plus de 50000 souches de B. thuringiensis (Sanchis et al., 1996) sont conservées dans les collections publiques et privées constituant ainsi un « réservoir» potentiel pour de nouvelles toxines. Le système initial utilisé pour identifier et classifier les souches de B. thuringiensis était basé sur les caractéristiques morphologiques et biochimiques (Heimpel et Angus, 1958). Ce système a été graduellement remplacé par les analyses sérologiques appelées sérotypie. Cette dernière, qui correspond à la réaction immunologique à l’antigène flagellaire H, a permis l’établissement d’un nouveau système de classification pour B. thuringiensis. Basé sur des caractères stables et spécifiques, ce nouveau système a permis de grouper les milliers de souches de B. thuringiensis isolés dans le monde entier dans des H-sérotypes (de Barjac et Bonnefoi, 1962, 1968). En 1999, les résultats issus de la sérotypie ont été mis à jour par Lecadet (Lecadet et al., 1999). Maintenant, il existe 69 H-sérotypes différents et 82 sérovars.

L’utilisation de B. thuringiensis constitue une alternative de grande valeur par rapport aux pesticides chimiques, grâce d’une part à sa grande spécificité et au respect de l’environnement, et d’autre part au faible coût de sa production. Les bio-insecticides à base de B. thuringiensis occupent ainsi 80-90 % du marché mondial des agents de contrôle biologique (Gough et al., 2002). Les premières formulations à base de B. thuringiensis étaient utilisées contre les lépidoptères qui étaient les pnnClpaux ravageurs. Les années 1960 ont été marquées par la découverte de la souche B. thuringiensis sérovar kurstaki RD 1 qui était 2 à 200 fois plus toxique que la souche utilisée dans les formulations précédentes (Dulmage, 1970). Les formulations à base de B. thuringiensis sérovar kurstaki HD 1 contre les lépidoptères ont été largement utilisées en agriculture et en foresterie. En 1976, une nouvelle souche de B. thuringiensis très toxique contre les diptères a été découverte en Israël et fut nommée B. thuringiensis sérovar israelensis (de Barjac, 1978; Goldberg et Margalit, 1977). Cette découverte est arrivée à un moment crucial en raison de la résistance des moustiques et des mouches noires aux pesticides chimiques.

Considérant que les moustiques et les mouches noires sont des vecteurs de plusieurs maladies pour l’homme, de nouvelles formulations à base de B. thuringiensis sérovar israelensis ont été produites. En 1983, une nouvelle souche très toxique contre les coléoptères a été découverte en Allemagne et fut nommée B. thuringiensis sérovar morrisoni, biotype tenebrionis. Les efforts se sont poursuivis pour isoler des souches de B. thuringiensis présentant de nouvelles spécificités insecticides et pesticides. L’activité entomopathogène de B. thuringiensis s’est étendue pour inclure les insectes de l’ordre des hyménoptères (Garcia-Robles et al., 2001) et d’autres invertébrés comme les nématodes (Marroquin et al., 2000; Wellman-Desbiens et al., 2011).

La psychrotolérance

La psychrotolérance (du latin tolerare, supporter) décrit la capacité d’un microorganisme de survivre à un climat froid et à une forte variation de température (von Stetten et al., 1999). Contrairement aux bactéries psychrophiles (du grec psukhros, froid; ph ilein , aimer) qui colonisent les environnements naturels froids de façon permanente telle que les régions polaires, les océans et les hautes montagnes, les bactéries psychrotolérantes coexistent avec les mésophiles dans des habitats variés. Les bactéries psychrotolérantes préoccupent énormément les autorités sanitaires et l’industrie alimentaire puisqu’elles sont actives à basse température et, par conséquent, capables de dégrader et de réduire la durée de conservation des produits alimentaires. Les bactéries psychrotolérantes du genre Bacil/us et Paenibacil/us sont les plus importantes parce qu’elles sont capables de produire des endospores qui vont leurs permettre de survivre et de se proliférer après décontamination des produits alimentaires par la chaleur ou par des produits chimiques.

En plus, les bactéries psychrotolérantes du genre Bacil/us sont capables de produire des enzymes telles que les lipases et protéases affectant considérablement la qualité et la stabilité des produits alimentaires. Parmi les espèces du groupe Bacil/us cereus, B. weihenstephanensis constitue un contaminant important des produits réfrigérés à cause de sa capacité à croître à basse température et de synthétiser des entérotoxines et des toxines émétiques (cereulides) (Lechner et al., 1998; Stenfors et al., 2002; Thorsen et al., 2006). Plusieurs industries ont su tirer profit des molécules produites par les bactéries psychrotolérantes. Ces demieres fournissent plusieurs protéines et enzymes qui sont utilisées dans des secteurs divers notamment en cosmétique, en médecine et dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique (Gounot, 1991).

Table des matières

TABLE DES MATIÈRES
RE’MERCIE’MENTS
AVANT-PROPOS
RESUME
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ABRÉVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES
CHAPITRE 1 TRODUCTION
1.1 Groupe Bacil/us cereus
1.1.1 Bacillus cereus sensus stricto  
1.1.2 Bacil/us anthracis
1.1 .3 Bacil/us thuringiensis
1.1.4 Bacil/us mycoides et Bacil/us pseudomycoides
1.1.5 Bacil/us cytotoxicus
1.1.6 Bacil/us weihenstephanensis
1.2 La psychrotolérance
1.3 Relation génétique entre les espèces du groupe B. cereus
1.3.1 Hybridation ADN-ADN
1.3.2 L’ARNribosomique16S(ARNr16S)
1.3.3 Életrophorèse des allozymes (MLEE)
1.3.4 Typage par séquençage multilocus (MLST
1.3.5 Analyse par séquençage multilocus (MLSA)
1.4 Les avantages des gènes de ménage
1.5 L’origine de B. thuringiensis sérovars navarrensis, bolivia et vazensis
1.5.1 Bacil/us thuringiensis serovar navarrensis
1.5.2 Bacil/us thuringiensis serovar Bolivia
1.5.3 Bacillus thuringiensis serovar vazensis
1.6 Les souches atypiques de B. thuringiensis
1.7 Les protéines de la couche S
1.8 Résumé de la problématique
1.9 Objectif
1.10 Hypothèses
CHAPITREll BACILLUS THURINGIENSIS SEROVARS BOLIVIA, VAZENSIS AND NAVARRENSIS MEET THE DESCRIPTION OF BACILLUS WEIHENSTEPHANENSIS  
Résumé
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Bacterial strains, culture conditions and DNA isolation
Bacterial cultures at 7 and 43°C
16S rRNA gene
cspA gene amplification
DNA cloning and sequencing
Nucleotide sequence accession number
Results
Bacterial growth curves
16S rRNA gene signature sequence
cspA gene signature sequence
Discussion  ‘
References
Figure legend
CHAPITREill MULTILOCUS SEQUENCE ANALYSIS OF BACILLUS THURINGIENSIS SEROVARS NAVARRENSIS, BOLIVIA AND VAZENSIS AND BACILLUS WEIHENSTEPHANENSIS REVEALS A COMMON PHYLOGENY
Résumé
Abstract
Introduction
Materials and methods
Bacterial strains and culture conditions
Housekeeping genes amplification
DNA cloning and sequencing
Phylogenetic analysis
Nucleotide sequence accession number
Results
Amplification ofhousekeeping genes
Housekeeping gene phylogenetic analyses
Housekeeping gene specific signature sequences and single nucleotide polymorphisms
Discussion
References
Figure legends
CHAPITRE IV BACILLUS WEIHENSTEPHANENSIS CHARACTERISTICS ARE PRESENT IN BACILLUS CEREUS AND BACILLUS MYCOIDES STRAINS
Résumé
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Bacterial strains, culture conditions and DNA isolation
Bacterial cultures at 7 Oc and 43 Oc
Amplification of 16S rRNA, cspA, glpF, gmk,purH and tpi genes
DNA cloning and sequencing
Phylogenetic analysis
B. weihenstephanensis gene signature sequences
Nucleotide sequence accession number
Results
Bacterial cultures at 7 oC and 43 oC
Amplification of 16S rRNA, cspA, glpF, gmk,purH and tpi genes
Phylogenetic analysis
B. weihenstephanensis-specific signature sequences and psychrotolerance
Discussion
References
Figure legends
CHAPITRE V DISCRIMINATION BETWEEN MESOPIDLIC AND PSYCHROTOLERANT STRAINS IN THE BACILLUS CEREUS GROUP BASED ON THE PSTI DIGESTION OF THE PYCA GENE
Résumé
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Bacterial strains and DNA isolation
Bacterial cultures at 7 oC
Amplification ofpycA gene
Pstl digestion
In silico digestion
DNA cloning and sequencing
Nucleotide sequence accession number
Results
Discussion
References
Figure legends
CHAPITRE VI MUTUALLY EXCLUSIVE DISTRIBUTION OF THE SAP AND EAG SLAYER GENES AND THE LYTBILYTA CELL WALL HYDROLASE
GENES IN BACILLUS THURINGIENSIS
Résumé
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Bacterial strains, distribution of sap, eag and lytB/lytA genes and culture conditions
PCR primer design and amplification of sap, eag and lytB/lytA genes
sap S-layer gene
eag S-layer gene
lytB/lytA genes
DNA cloning and sequencing
Phylogenetic analysis
Nucleotide sequence accession number
Results
Organisation and distribution of the sap and eag S-layer and lytB/lytA cell wall hydrolase genes in fully sequenced genomes
Amplification ofsap, eag and lytB/lytA genes
Phylogenetic analyses
Sap
EAl
LytBlLytA   Distribution of the sap and eag S-layer and lytB/lytA cell wall hydrolase genes in B. thuringiensis
Discussion
References
Figure legends
CHAPITRE VII
DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS  
2.1 Caractéristiques de B. weihenstephanensis chez B. thuringiensis sérovars navarrensis, bo/ivia et vazensis
2.2 Analyses par MLSA de B. weihenstephanensis et B. thuringiensis
2.3 Caractéristiques de B. weihenstephanensis chez les autres espèces du groupe
B. cereus
2.4 Développement d’un outil moléculaire pour distinguer les souches psychrotolérantes des mésophiles
2.5 Distribution des gènes de la couche S, sap et eag chez B. thuringiensis
2.6 Conclusion
2.7 Perspectives de recherche
REFERENCES BIBLIOGRAPIDQUES.

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