Huntingtin interacting protein 1-Related (HIP1R)

HUNTINGTIN INTERACTING PROTEIN 1-RELATED (HIP1R)

Mise en évidence de la protéine 

HIPIR est une protéine ubiquitaire, se retrouvant principalement dans le cerveau, le pancréas, les reins et l’estomac (The Human Protein Atlas, site consulté en mai 2014). Son gène se situant sur le chromosome 12 en position q24.32, a une partie codante de 3204 paires de bases et sera traduit en une protéine de 1068 acides aminés (Chopra et al., 2000). La protéine a été mise en évidence par l’équipe de Seki et al. en 1998 sur la base de son homologie de séquence avec la protéine Huntingtin interacting protein 1 (HIP1), protéine impliquée dans la maladie de Huntington par sa liaison à la protéine huntingtine (Kalchman et al., 1997). La protéine de Seki et al. (1998) était toutefois incomplète; c’est plutôt Chopra et al. (2000) qui ont mis en évidence la protéine complète. Malgré que HIP1 et HIPIR partagent à 66% la même séquence d’acide aminés, HIPIR ne contient pas le site de liaison à l’huntingtine, ce qui ne l’implique pas dans la physiopathologie de la maladie de Huntington (Chopra et al., 2000). HIP1 et HIPIR peuvent former aussi bien des homodimères in vivo que des hétérodimères in vitro (Legendre-Guillemin et al., 2002), mais leur forme privilégiée reste l’homodimère (Wilbur et al., 2008). Ce résultat est logique puisque le pic d’expression d’HIPl chez des souris est au 13e jour du stade embryonnaire, HIPIR n’étant qu’à peine détectable à ce moment, alors que le taux d’expression d’HIPlR augmente graduellement de la naissance jusqu’à l’âge adulte (Legendre-Guillemin et al., 2002).

Structure de la protéine 

HIPIR est une protéine possédant plusieurs domaines fonctionnels (figure 1). Il y a trois domaines principaux : le domaine N-terminal ANTH (API80 N-terminal Homology), le domaine central hélicoïdal (CC, pour «coiled coil») et le domaine C-terminal THATCH (TalinHIPl/R/Sla2p-Actin-Tethering C-terminal Homology). Le domaine ANTH se termine avec le 150e acide aminé. C’est le domaine qui permet à HIPIR de se lier aux lipides membranaires, les phosphatidylinositol bi et triphosphates (PIP) (Ford et al., 2001). Il a la faculté de faire une liaison avec plusieurs types (PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3), mais les liaisons préférentielles sont faites avec les PI(3,4)P2 et les PI(3,5)P2 (Hyun et al., 2004b). Le domaine ANTH isolé de HIPIR peut également, in vitro, se lier à la tubulinc (Hussain et al.. 2003). une protéine essentielle du processus mitotique (Alberts et al., 2008).

Entre les domaines ANTH et central hélicoïdal, aux acides aminés 302-348. se trouve un site de liaison faible à la chaine lourde de la clathrine (CHC) (Legendre-Guillemin et al., 2002). Cette liaison se fait par le domaine N-tcrminal de la CHC (Lcgcndrc-Guillcmin et al.. 2002; Metzleretal., 2001).

On retrouve au niveau du domaine central hélicoïdal le site de liaison d’HIPIR avec la chaine légère de la clathrine (CLC) (Legendre-Guillemin et al., 2002). site dépendant des acides aminés 4(OELL de HIP1R (Legendre-Guillemin et al.. 2005). Le domaine CC est aussi le site principal de dimérisation de la protéine, avec elle-même ou avec HIP1. Cette capacité de dimérisation est indépendante de sa liaison à la CLC (Legendre-Guillemin et al.. 2005). De plus. il a été montré que HIP1R contient un motif «leucinc zipper» dans ce domaine (acides aminés 507-535) (Engqvist-Goldstein et al., 1999: Seki et al.. 1998) et que ces motifs sont impliqués dans la dimérisation et les interactions protéiques (John et al., 1994; Pearlman et al.. 1994). Ce motif peut donc contribuer à ce que la liaison HIP1R-HIP1/HIP1R soit possible.

Le domaine THATCH est composé de deux autres domaines, soient Core (771-971) et Latch (972-1012) (Brett et al., 2006). Le domaine Core contient le site de liaison d’HIPIR à l’actine, aux acides aminés «  »KVK. Cette liaison n’est possible que lorsque HIP1R forme un homodimère. une conformation régulée par le domaine Latch (Brett et al.. 2006). Il y a finalement un site de liaison à la cortactinc. protéine impliquée dans l’organisation de l’actine. dans la région riche en l’acide aminé proline (PRD) dans la région C-terminalc (1017-1068). Cette liaison se fait via le domaine SH3 (Src Homology 3) de la cortactine. et la liaison cortactine/HIP IR est plus forte lorsque le domaine ANTH est présent (Le Clainche et al., 2007).

MÉCANISMES CELLULAIRES DANS LESQUELS HIP1R EST IMPLIQUÉE

L’endocytose médiée par la clathrine 

Le mécanisme par lequel les cellules font l’internalisation du matériel extracellulaire se nomme endocytose (Alberts et al., 2008). Il y a différentes voies de l’endocytose qui ont été mises en évidence, mais celle qui implique HIP1R est celle médiée par la clathrine. Plusieurs fonctions essentielles sont régies par l’endocytose médiée par la clathrine (EMC), comme l’internalisation de nutriments, le remaniement des membranes ou la communication intercellulaire (Ramanan et al., 2011).

Ce type d’endocytose nécessite une invagination de la membrane plasmique, qui est recouverte d’un manteau de clathrine, du côté cytoplasmique. Ce manteau permet à la vésicule qui se détache de la membrane d’être acheminée vers les endosomes. Le contenu de la vésicule peut alors être recyclé vers la membrane plasmique ou dirigé vers les lysosomes pour être dégradé (Alberts et al., 2008).

Le mécanisme de l’EMC peut être divisé en cinq grandes étapes : la nucléation, la sélection du cargo, l’assemblage du manteau de clathrine, la scission de la vésicule de transport puis le démantèlement de celle-ci . L’EMC est initiée par la formation aux sites endocytiques de modules de nucléation qui sont formés des protéines FCH domain only (FCHO), EGFR pathway substrate 15 (EPS 15) et d’intersectines. Ces modules créent une courbure initiale dans la membrane plasmique, ce qui recrute la protéine adaptor protein 2 (AP2) (McMahon and Boucrot, 2011). La molécule à être internalisée, ou cargo, se fixe à une protéine adaptatrice générale, comme AP2, ou à une protéine adaptatrice spécifique au cargo. C’est la protéine adaptatrice qui est fixée aux lipides membranaires, gardant ainsi le cargo à l’intérieur de la vésicule (McMahon and Boucrot, 2011). L’étape qui suit est la formation du manteau de clathrine autour de la vésicule. Le constituant de ce manteau détermine la destination de la vésicule; la clathrine fait en sorte que la vésicule est destinée au transport entre la membrane plasmique et les endosomes ou le trans Golgi et les lysosomes (Alberts et al., 2008). La molécule de clathrine est constituée de trois chaines lourdes (CHC) et de trois chaines légères (CLC) qui s’assemblent en triskèles, structure tridimensionnelle qui contribue à accentuer la courbure dans la membrane (McPherson, 2010 ).

HIP1R dans l’EMC 

Au tout début du processus de l’EMC, HIP1R est recrutée aux sites endocytiques où elle participe à induire l’assemblage des triskèles de clathrine (Engqvist-Goldstein et al., 2001). Ensuite, HIP 1R peut faire le lien entre les vésicules endocytiques et le cytosquelette d’actine pour permettre à celles-ci de migrer dans la cellule, étant donné la capacité de HIP1R de lier les lipides membranaires, la clathrine et l’actine (Engqvist Goldstein et al.. 1999; Hyun et al., 2004b; Le Clainche et al., 2007; Legendre-Guillemin et al., 2002). On sait d’ailleurs que la polymérisation de l’actine-F (filamenteuse) se produit en partant de la membrane plasmique vers les endosomes, au moment où les vésicules endocytiques commencent à se former (Merrifield et al., 2002). Cette polymérisation est dirigée par certaines protéines, telles que le complexe Arp2/3, la neural Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) et la cortactine (Engqvist-Goldstein et al., 2004; Merrifield et al., 2004). La polymérisation de l’actine peut être un des moyens qui permet aux vésicules de migrer dans la cellule, via leur liaison avec des protéines intermédiaires comme HIP1R (Le Clainche et al., 2007). On sait aussi que HIP1R participe à ce que la polymérisation de l’actine aux sites endocytiques se fasse correctement, par sa liaison avec la clathrine ou les lipides membranaires et la cortactine (Wilbur et al., 2008).

Table des matières

Chapitre 1  Introduction 
1.1 Huntingtin interacting protein 1-related (HIP1R)
Mise en évidence de la protéine
Structure de la protéine
1.2 Mécanismes cellulaires dans lesquels HIP1R est impliquée
L’endocytose médiée par la clathrine
HIPlR dans l’EMC
La mitose
Les étapes principales de la mitose
Le contrôle de la mitose
L’endocytose durant la mitose
HIP 1R dans la mitose
Les autres protéines de l’endocytose dans la mitose
L’apoptose
HIP 1R dans l’apoptose
Les autres protéines de l’endocytose dans l’apoptose, et vice versa
1.3 Problématique et objectifs
Chapitre 2  Matériel et méthodes 
2.1 Clonage moléculaire
2.2 Culture cellulaire
2.3 Knock-down (KD)
2.4 Quantification du KD
2.5 Transfection d’ADN
2.6 Immunofluorescence
2.7 Immunoprécipitation (IP)
2.8 Endocytose de la transferrine
2.9 Effet d’HIPlR sur la mitose
2.10 Analyse de la phosphorylation d’HIPlR durant la mitose
2.11 Isolation des mitochondries
2.12 Évaluation de 1’activation de lacaspase-9 et 3 par immunoblot
2.13 Évaluation de l’activation de lacaspase-3 par fluorimétrie
2.14 Analyses statistiques
Chapitre 3  Résultats 
3.1 Clonage moléculaire
Colocalisation avec l’actine et la cortactine
Colocalisation avec l’a-tubuline
Immunoprécipitation de GFP-HIP1R
3.2 Knock-down d’HIPlR
3.3 Effet d’HIPlR sur le cytosquelette d’actine
3.4 Effet d’HIPlR sur l’endocytose de la transferrine
3.5 Effet d’HIPlR sur la mitose
3.6 Effet d’HIPlR sur l’apoptose
Chapitre 4  Discussion 
4.1 Clonage moléculaire
4.2 Effet d’HIPlR sur l’endocytose
4.3 Effet d’HIPlR sur la mitose
4.4 Effet d’HIPlR sur l’apoptose
Chapitre 5  Conclusion

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