HSP90 une cible thérapeutique dynamique

Les protéines sont modulées par des changements structuraux d’amplitudes spatiale et temporelle variées

                   Toutes les protéines sont dynamiques et cette propriété des protéines est encodée dans leur structure qui elle-même dépend de la séquence de ces dernières. La dynamique d’une protéine est caractérisée par un changement dans les coordonnées atomiques de la protéine en fonction du temps (Henzler-Wildman and Kern 2007). Lorsque la dynamique entraine une large modification de la structure de la protéine on dit que cette dernière est alors flexible. Ainsi, les protéines peuvent être flexibles en conséquence de leur dynamique mais le fait qu’elles soient dynamiques n’implique pas forcément qu’elles soient flexibles (Teilum et al. 2009). En effet, toutes les protéines sont dynamiques mais des mouvements d’amplitude spatiale variée en résultent.Ainsi, l’amplitude des mouvements d’une protéine peut varier du centième d’angström à la centaine d’angström mais l’échelle des temps caractéristiques des mouvements conformationnels d’une protéine s’étend également sur une multitude d’ordres de grandeur : de la femto seconde à plusieurs heures (Figure 1.2). Les mouvements d’une protéine fluctuent donc spatialement et temporellement sur une large amplitude. Les vibrations atomiques, couvrant généralement une distance inférieure à 0.5 Å, interviennent dans la gamme de temps de la dizaine/centaine de femto secondes (10-14 – 10-13 s) et l’énergie de ces mouvements vibrationnels provient de l’énergie cinétique inhérente à la protéine (Petsko and Ringe 1984; Skjærven et al. 2011). En plus des fluctuations, deux autres catégories de mouvement peuvent être discernées. On note d’un côté les mouvements collectifs pouvant inclure des mouvements rapides mais peu fréquents tels que la rotation de 180° d’une tyrosine ou des mouvements lents tels que le mouvement d’une boucle ou d’un domaine et d’un autre côté les mouvements induits par une sollicitation externe telle que la liaison d’un ligand à la protéine. Les mouvements appartenant à la première catégorie peuvent échantillonner des distances de quelques dixièmes à plusieurs dizaines d’angströms (Petsko and Ringe 1984). Par exemple, la rotation d’une chaine latérale pourra avoir une amplitude comprise entre 0.5 et 5 Å, les mouvements de domaines, plus larges, auront une amplitude de l’ordre de 5 à 10 Å et le repliement d’une protéine pourra atteindre plusieurs dizaines d’angströms (Samish et al. 2009). Les mouvements appartenant à la seconde catégorie peuvent également couvrir une large amplitude du dixième d’angström pour la liaison du ligand à quelques angströms pour les changements conformationnels du site actif ou les transitions allostériques. Toutefois il est à noter que ces mouvements sont protéines dépendant et ainsi les distances échantillonnées peuvent être plus disperses en amplitudes que les valeurs citées précédemment (Samish et al. 2009). La dynamique des protéines peut, comme mentionné précédemment, impliquer des mouvements de diverses amplitudes. On notera par exemple le mouvement de large amplitude de l’exotoxine pyrogénique streptococcique B (SpeB) pour atteindre sa forme active. SpeB est une protéase à cystéine sécrétée et repliée sous la forme d’un précurseur inactif. Ce dernier est transformé en protéase active par clivage autolytique de 118 résidus du domaine N-terminal, région également appelé prodomaine (Kagawa et al. 2000). Les structures de SpeB sous sa forme active et celle inactive ont été résolues, respectivement par résonance magnétique nucléaire en solution (Wang et al. 2009) et cristallographie aux rayons X (Kagawa et al. 2000). L’ablation du prodomaine entraine un changement conformationnel important : la boucle constituée des résidus 226 à 244 se déplace et ce, de plus de 25 Å (Figure 1.3). Le mouvement de cette boucle va permettre de libérer une seconde boucle contenant l’histidine 195 catalytique. His-195 pourra ainsi adopter sa conformation active dans laquelle une interaction avec la cystéine 47 est possible et SpeB sera fonctionnelle (Teilum et al. 2009). De plus petits mouvements que le réarrangement structural effectué par SpeB, tel que notamment la rotation de 180° des chaines latérales des acides aminés comportant un cycle aromatique, ont également été observés dans les protéines depuis les années 1970. Toutefois, les détails structuraux concernant le réarrangement des acides aminés localisés à proximité du cycle aromatique en rotation ainsi que les détails structuraux sur la rotation de ce dernier demeuraient peu connus. Une récente étude par Mariño Pérez et al. (Mariño Pérez et al. 2022) a analysé la dynamique du domaine replié SH3 de la protéine JIP1. JIP1 est une protéine de 711 acides aminés contenant des régions intrinsèquement désordonnées mais également deux domaines repliés : SH3 (Src Homology 3) et PID (Phosphotyrosine Interaction Domain). Dans le domaine SH3, la chaine latérale d’une tyrosine enfouie dans le cœur hydrophobe du domaine est en rotation et les réarrangements structuraux de la protéine se produisant à proximité de la tyrosine ont été examinés. Cette étude révèle, en utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution, que SH3 est en échange entre deux conformations dans la gamme de temps µs-ms (~ 2600 s-1). La structure cristallographique de SH3 a dévoilé une conformation éclipsée du cycle aromatique de la tyrosine dans l’état majoritaire (~ 97 %). Mariño Pérez et al. ont conçu, en se basant sur une analyse de séquences de SH3 et de structures cristallographiques, des mutants stabilisant la conformation minoritairepeuplée par le domaine SH3. Ils ont montré que le segment 517-522, intrinsèquement dynamique, se réarrangeait pour stabiliser le cycle aromatique dans une conformation décalée. La RMN et la dynamique moléculaire ont permis de conclure que la rotation du cycle aromatique de 180° ne contribuait que très peu au processus d’échange entre l’état majoritaire et minoritaire, cette dernière étant rapide, de l’ordre de la dizaine de nanosecondes. Ainsi, le domaine SH3 est en échange entre deux conformations, l’une majoritaire avec le cycle aromatique de la tyrosine en position éclipsée et une seconde minoritaire avec le cycle aromatique de la tyrosine en position décalée. Pendant la transition entre l’une et l’autre des conformations se crée un volume de vide autour de la tyrosine, permettant la rotation de 180° de la chaine latérale de cette dernière. Ce volume vide, augmentant de plus de 65 Å le volume de la poche, est principalement créé par la réorientation de la chaine latérale du résidu 520, localisé au sein du segment 517-522 intrinsèquement dynamique. Lorsque le cycle aromatique est stabilisé en position décalée on observe un réarrangement structural associé à une diminution du volume libre autour de la tyrosine, c’est un évènement rare se produisant dans une échelle de temps lente de l’ordre de la milliseconde (Figure 1.4). Ces résultats récents montrent que la présence d’un acide aminé spécifique peut être à l’origine de dynamique et amènent à une compréhension structurale des mouvements associés à la rotation d’un cycle aromatique enfoui. Un changement subtil dans l’environnement d’une protéine dans une conformation énergétiquement défavorable peut conduire à des changements structuraux importants. Cette étude met en valeur l’importance de l’étude des phénomènes dynamiques en parallèle d’une étude structurale afin d’améliorer la compréhension du lien entre structures d’états parfois peu peuplés et fonctions de la protéine d’intérêt.

Principe de la microscopie électronique

                 En microscopie électronique, l’échantillon est irradié par un faisceau d’électrons accéléré à très haute vitesse et les électrons diffusés sont refocalisés par les lentilles du microscope pour obtenir une image de l’échantillon. La principale différence avec la microscopie optique réside dans le pouvoir résolutif des deux méthodes, lui-même lié à la longueur d’onde de la source de radiation. Ainsi les photons émis par la lumière auront une longueur d’onde comprise entre 400 et 750 nm tandis qu’un faisceau d’électron accéléré à 300 kV aura une longueur d’onde d’environ 0.002 nm permettant ainsi d’observer des macromolécules biologiques (Milne et al. 2013). La détermination de la structure de la bactériorhodopsine (petite protéine présente chez les archées fonctionnant comme pompe à protons) avec une résolution proche de 7 Å en 1975 (Henderson and Unwin 1975) a démontré l’utilité de la microscopie électronique en biologie structurale et pavé la voie d’études résolvant à une résolution presque atomique les cartes de densité de cette même protéine ainsi que d’autres protéines membranaires (Henderson et al. 1990; Gonen et al. 2006; Milne et al. 2013). Cependant, on notera que les échantillons biologiques sont sensibles à l’irradiation par un faisceau d’électrons et qu’avec cette technique des dommages tels que la rupture de certaines liaisons chimiques et la création de radicaux libres peuvent se produire, ainsi limiter la dose d’électrons appliquée sur les échantillons est primordiale. Un second désavantage de la technique est son faible rapport signal sur bruit. En effet, les principaux composants des macromolécules biologiques sont le carbone l’azote et l’oxygène, des éléments avec un faible numéro atomique, qui diffusent plus difficilement les électrons car ils possèdent moins d’électrons autour de leur noyau. Une technique développée pour pallier ce problème de rapport signal sur bruit pour l’observation des macromolécules biologiques est la microscopie électronique à coloration négative. Cette méthode permet d’obtenir des images basse résolution d’échantillons biologiques en ajoutant à ces derniers des sels d’atomes lourds tels que l’acide phosphotungstique, le molbydate d’ammonium ou l’acétate d’uranyl. Les colorants ajoutés vont permettre d’augmenter le contraste en se liant préférentiellement autour des particules biologiques, ainsi on obtiendra une empreinte négative de la protéine d’intérêt en se focalisant sur les zones de faible diffusion. En règle générale, cette méthode de faible résolution (~20 Å) (Ohi et al. 2004) est utilisée pour évaluer les conditions employées et obtenir des informations sur l’homogénéité, la taille, la forme et la dispersion de l’échantillon. Mais comment obtenir avec la microscopie électronique à transmission des images à haute résolution d’un échantillon biologique sans entrainer de dommages sur ce dernier ?

Principe de la cristallographie aux rayons X

                  En cristallographie aux rayons X, un cristal de protéine purifiée est irradié par un faisceau de rayons X donnant lieu à des motifs de diffraction (Figure 1.12). Ces derniers vont ensuite être analysés afin d’accéder à de nombreuses informations sur le cristal tels que la taille de ses unités de répétition, le système cristallin, et permettre ensuite de calculer une carte de densité électronique qui, utilisée en même temps que la séquence de la protéine va conduire à la structure de la macromolécule cristallisée. L’étape cruciale de la cristallographie aux rayons X réside dans l’obtention d’un cristal de l’échantillon souhaité. En effet, non seulement la protéine doit être soluble et homogène, mais elle doit pouvoir également être hautement concentrée sans précipiter, ni agréger, afin d’induire la nucléation de cristaux. Une quantité considérable de variables joue un rôle important dans cette phase de cristallisation tels que le tampon dans lequel se trouve la protéine, son pH, la nature des précipitants utilisés ainsi que leurs concentrations, la température et la technique de cristallisation employée. Cette phase de nucléation puis de croissance des cristaux est à l’heure actuelle l’étape limitante de la plupart des projets de cristallographie et est souvent la moins bien comprise (Smyth and Martin 2000). Les rayons X irradiant le cristal peuvent être issus, entre autres, d’électrons accélérés provenant d’anneaux de stockage d’un synchrotron et doivent être focalisés et collimatés pour générer un faisceau d’électrons parallèles. Plusieurs paramètres doivent être optimisés avant d’obtenir un motif de diffraction de qualité tels que par exemple la distance entre le cristal et le détecteur et, dans les cas idéaux, les motifs de diffractions obtenus sont acquis sur un seul et même cristal. En pratique, l’irradiation du cristal par le faisceau de rayons X entraine des dommages irréversibles et plusieurs cristaux sont généralement nécessaires. Exposer les cristaux aux rayons X en descendant la température à des températures cryogéniques diminue les dommages et permet à la fois d’améliorer la qualité des données et de diminuer le nombre de cristaux nécessaires pour l’acquisition d’un jeu complet de données (Hope 1990). L’analyse des motifs de diffraction est mathématiquement complexe mais dans ces derniers est encodée la structure de la protéine. Tout d’abord les dimensions de la maille élémentaire tridimensionnelle (plus petite unité de répétition dans le cristal) peuvent être déterminées à partir de l’espace entre deux tâches dans le motif de diffraction. Ilest à noter que plus l’espace entre deux points sera grand plus la dimension de la maille sera petite. La forme de cette maille cristalline permet ensuite d’obtenir des informations sur le système cristallin. Sept systèmes cristallins existent : triclinique, monoclinique, orthorhombique, tétragonal, rhomboédrique, hexagonal et cubique. L’intensité des tâches dans le motif de diffraction apporte quant à elle des informations sur la localisation des atomes dans la maille cristalline (Wlodawer et al. 2008). Chaque tâche diffractée est caractérisée par une phase et une amplitude et tandis que l’amplitude peut être déduite de l’intensité de la tâche, obtenir des informations sur la phase se révèle plus difficile. Différentes méthodes ont été mises en place telles que le remplacement isomorphe et le remplacement moléculaire (Smyth 2000) pour caractériser la phase. La carte de densité électronique peut ensuite être construite (Figure 1.13) et après introduction de la séquence protéique et plusieurs étapes de raffinement une structure tridimensionnelle de la protéine cristallisée peut être obtenue. Depuis la première structure tridimensionnelle de myoglobine publiée en 1958 (Kendrew et al. 1958) avec une résolution de 6 Å et la première structure haute résolution (2 Å) du lysozyme par Blake et al. en 1965 (Blake et al. 1965), le domaine a grandement évolué. Le but ultime des biologistes structuraux est d’observer non plus une structure statique à haute résolution mais une macromolécule en action et ce, toujours à résolution atomique. C’est ainsi que s’est développé la cristallographie aux rayons X résolue en temps.

FRET et dynamique des protéines

           La méthode FRET sur particule unique (sm-FRET) est employée majoritairement pour deux applications. La première pour étudier la structure d’une protéine en solution en multipliant le nombre d’expériences avec des paires de fluorophores donneur/accepteur différentes pour obtenir des contraintes de distance. La seconde, qui nous intéresse particulièrement dans cette section, a pour but d’étudier la dynamique de la protéine d’intérêt en utilisant un nombre de paires de fluorophores donneur/accepteur restreint. Des interactions protéine-protéine, des clivages enzymatiques, le repliement d’une protéine ou des changements conformationnels peuvent être observés. En effet, en utilisant la technique de FRET à particule unique, les particules arrivent individuellement les unes après les autres dans la zone d’illumination du laser, ainsi des sous-états d’une protéine peuvent être détectés. Si l’expérience avait été effectuée sur un ensemble de particules, les sous-états auraient été moyennés et donc potentiellement non détectés. Additionnellement, une fois les sous-états identifiés, il est possible de suivre la cinétique de chaque état individuellement. Il est toutefois à noter qu’une des principales limitations de la technique employant le FRET pour mesurer la dynamique est l’unique mesure (triple mesure) de distance déterminée, due à l’emploi de deux (ou trois) chromophores. Cependant, lorsque des informations de structure à haute résolution sur la macromolécule d’intérêt sont disponibles, ce qui est très fréquemment le cas, il est possible d’interpréter la(es) distance(s) mesurée(s) par des changements conformationnels. (Henzler-Wildman and Kern 2007). Avec les nombreuses configurations existantes d’appareils de sm-FRET il est possible de suivre la dynamique d’une protéine sur une vaste échelle de temps allant de la picoseconde à quelques secondes. Ces méthodes peuvent être séparées en deux catégories principalement en fonction de la vitesse de la cinétique qu’il leur est possible de couvrir. On notera d’un côté les méthodes qui sont basées sur des particules immobilisées sur une surface pouvant suivre une cinétique allant de la dizaine de millisecondes à la seconde. Ces configurations sont limitées en temps uniquement en raison de la perte de fluorescence des sondes fluorescentes au-delà de quelques secondes. Cependant, la vaste majorité des protéines exercent des mouvements caractérisés par une dynamique beaucoup plus rapide que la gamme de temps milliseconde-seconde. Les méthodes de sm-FRET sur les molécules diffusant librement en solution sont les principales utilisées pour suivre les changements conformationnels rapides allant de la picoseconde à la milliseconde (Mazal and Haran 2019).

Table des matières

1. DYNAMIQUE DES PROTEINES 
1.1 Importance de la dynamique des protéines
1.1.1 Contexte historique
1.1.2 Les protéines sont modulées par des changements structuraux  d’amplitudes spatiale et temporelle variées
1.1.3 Analyse quantitative de la dynamique des protéines
1.1.3.1 Paysage énergétique
1.1.3.2 Apports potentiels d’une meilleure connaissance de la dynamique des protéines
1.2 Exemples de techniques expérimentales pour étudier la dynamique des protéines
1.2.1 Cryo-microscopie électronique
1.2.1.1 Principe de la microscopie électronique
1.2.1.2 Cryo-microscopie électronique (cryo-EM)
1.2.1.3 Etude de la dynamique par cryo-microscopie électronique
1.2.2 Cristallographie aux rayons X résolue en temps
1.2.2.1 Principe de la cristallographie aux rayons X
1.2.2.2 Cristallographie aux rayons X résolue en temps
1.2.2.3 Etude de la dynamique de la bactériorhodopsine par cristallographie aux rayons X résolue en temps
1.2.3 Transfert d’énergie par résonnance de type Förster
1.2.3.1 Principe
1.2.3.2 FRET et dynamique des protéines
1.2.3.3 Exemple
1.2.4 Diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS)
1.2.4.1 Principe
1.2.4.2 SAXS et dynamique
1.2.4.3 Exemple d’étude de dynamique par SAXS
1.3 Résonance Magnétique Nucléaire en solution (RMN)
1.3.1 RMN et relaxation
1.3.2 Méthodes pour quantifier la dynamique des protéines par RMN
1.3.2.1 RMN en temps réel (τex > 1 s / kex < 1 s-1)
1.3.2.2 EXSY (Exchange Spectroscopy) (τex ~ 10-5000 ms / kex ~ 0.2-100 s-1)
1.3.2.3 CEST (Chemical Exchange Saturation Transfert) (τex ~ 2 – 50 ms / kex ~ 20-500 s-1)
1.3.2.4 CPMG-RD (Carr Purcell Meiboom Gill Relaxation – Dispersion) (τex ~ 0.15-10 ms / kex~ 100-6000 s-1)
1.3.2.5 Relaxation dispersion dans le référentiel tournant (τex ~ 20-100 µs / kex ~ 10000-50000s-1)
1.3.2.6 Relaxation de spin nucléaire (τex ~ ps – 10 ns)
2. DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES POUR L’ATTRIBUTION DU DOMAINE N-TERMINAL DE HSP90Α HUMAINE 
2.1 Heat Shock Protein 90
2.2 Données préalables sur l’attribution du squelette de HSP90α-NTD
2.3 Intérêt des groupements méthyles
2.4 Marquage combinatoire des groupements méthyles de HSP90-NTD
2.5 Stratégies d’attribution des groupements méthyles d’une protéine
2.5.1 Transfert d’attribution du squelette aux groupements méthyles
2.5.1.1 Contexte
2.5.1.2 Développement des stratégies de marquage depuis les années 2010
2.5.1.3 Leucines et Valine pro-S : problématique
2.5.1.4 Développement d’un nouveau précurseur pour faciliter le transfert d’attribution du squelette aux groupements méthyles pro-S des leucines et valines
2.5.2 Attribution des groupements méthyles par mutagénèse
2.5.3 Attribution des groupements méthyles employant des méthodes basées sur la structure
2.5.3.1 Méthodes d’attribution automatique se basant sur l’effet paramagnétique
2.5.3.2 Méthodes d’attribution automatique employant l’effet NOE
2.6. Application des différentes stratégies d’attribution à HSP90-NTD Apo – Article I
2.7. Application des différentes stratégies d’attribution à HSP90-NTD en complexe avec deux ligands
2.7.1. HSP90-NTD en complexe avec un ligand conservant l’empreinte spectrale de la protéine
2.7.2 HSP90-NTD en complexe avec un ligand modifiant très largement l’empreinte spectrale de la protéine
3. ETUDE STRUCTURALE ET DYNAMIQUE DU DOMAINE N-TERMINAL DE HSP90 APO
3.1 Variabilité structurale de HSP90-NTD
3.1.1 Rôle et cycle fonctionnel d’HSP90
3.1.2 Etat de l’art de la PDB
3.1.3 Analyse des structures de la PDB
3.1.4 Structure de HSP90-NTD en solution à température ambiante
3.2 HSP90-NTD échantillonne plusieurs conformations distantes de plus de 30 Å
3.2.1 Analyse de NOEs NH-NH et CH3-CH3
3.2.2 Incompatibilité des NOEs observés
3.2.3 Calcul de structure a un puis deux conformères
3.3 Mutants pour stabiliser individuellement chacune des conformations
3.3.1 Conception
3.3.2 Production des mutants
3.3.3 HSP90-NTD-R60A mutant stabilisant le segment [98-136] en position ouverte
3.3.4 HSP90-NTD-R46A mutant stabilisant le segment [98-136] en position fermée
3.4 Etude de la dynamique d’HSP90-NTD Apo
3.4.1 Acquisition des données de CPMG 15N et 13CH3
3.4.2 Traitement des données de relaxation-dispersion
3.4.2.1 Sélection des profils de relaxation-dispersion
3.4.2.2 Théorie de la relaxation dispersion et paramètres ajustés
3.4.2.3 Influence de chacun des paramètres sur l’ajustement
3.4.2.4 Vers un ajustement global des données de relaxation dispersion
3.4.2.5 Sélection des paramètres initiaux de l’ajustement global
3.4.2.6 Processus d’échange commun et ajustement global
3.4.2.7 Analyse critique des erreurs
3.4.3 Identification de l’état excité
3.4.3.1 Corrélation entre structures et observation des NOEs
3.4.3.2 Dépendance de la température
3.4.4 Caractérisation thermodynamique et cinétique de l’échange
3.4.5 Extraction des valeurs d’enthalpie et d’entropie entre l’état fondamental et excité
3.5 Article III
4. MODULATION DU PAYSAGE ENERGETIQUE DU DOMAINE N-TERMINAL DE HSP90 PAR LA LIAISON DE DIFFERENTS INHIBITEURS 
4.1 HSP90 et cancer
4.1.1 HSP90 : une cible thérapeutique majeure
4.1.2 Différents types d’inhibiteurs de HSP90
4.1.2.1 Inhibiteurs de type ansamycine
4.1.2.2 Dérivés de résorcinol
4.1.2.3 Analogues de la purine
4.1.2.4 Stratégies de conception d’inhibiteurs de HSP90
4.2 HSP90 et inhibiteurs de type résorcinol
4.2.1 Deux familles de ligands
4.2.1.1 Une même affinité envers HSP90-NTD
4.2.1.2 Propriétés thermodynamiques et cinétiques différentes pour chaque catégorie de ligands
4.2.1.3 Influence des ligands reportée dans la littérature lors de la liaison à HSP90-NTD
4.2.2 Sélection de ligands pour comparer les deux familles
4.3 Caractérisation de l’interaction du ligand à court temps de résidence avec HSP90
4.3.1 Etat fondamental
4.3.2 Etat excité
4.3.3 Influence du ligand « LtRCourt » sur la dynamique de HSP90-NTD à 293 K
4.3.4 Influence du ligand « LtRCourt » sur la dynamique de HSP90-NTD sur la plage de température [278-313 K]
4.4 Caractérisation de l’interaction du ligand à long temps de résidence avec HSP90
4.4.1 Etat fondamental – une nouvelle structure
4.4.2 Etat excité
4.4.3 Influence du ligand « LtRLong » sur la dynamique de HSP90-NTD à 293 K
4.4.4 Influence du ligand « LtRLong » sur la dynamique de HSP90-NTD sur la plage de température [278-313 K]
4.5 Discussion
4.5.1 HSP90-NTD Apo et en complexe avec le ligand « LtRCourt » – un comportement similaire
4.5.2 HSP90-NTD complexe avec le ligand «LtRLong»
4.5.3 Extraction des valeurs de population de l’état excité et de différences de déplacements chimiques par CPMG-RD lorsque l’on tend vers un régime d’échange rapide
4.5.4 Vers un modèle à trois états pour HSP90-NTD
5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 241
5.1 Attribution de HSP90-NTD Apo
5.2 Structure et dynamique de HSP90-NTD Apo
5.3 Influence de la liaison de ligands à HSP90-NTD
5.3.1 Attribution de HSP90 en complexe avec deux ligands ayant des propriétés différentes
5.3.2 Structure et dynamique de HSP90-NTD en complexe
5.4 Modèle décrivant la différence de temps de résidence des deux ligands
6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
7. ANNEXES 
7.1. Informations Supplémentaires Article I
7.2. Informations Supplémentaires Article III.

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