Homéostasie de la relation hôte-microbiote au niveau de la muqueuse intestinale

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Microbiote intestinal et diabète de type 2

Une activation du système immunitaire ainsi qu’une inflammation systémique de bas niveau caractérisent le diabète de type 2, ainsi que l’obésité et l’athérosclérose[419-421]. Par ailleurs, un lien avec la composition du microbiote intestinal est mis en évidence dans ces pathologies. Bien que le diabète de type 2 soit très souvent étudié en tant que conséquence de l’obésité, nous ne reviendrons pas ici sur le rôle du microbiote intestinal dans le stockage énergétique et l’obésité, point qui a été déjà discuté plus haut. Nous allons plutôt nous intéresser au possible impact du microbiote intestinal sur l’initiation de l’inflammation métabolique, à l’origine de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2.
Des composés provenant de la flore bactérienne intestinale, comme les LPS, l’acide lipoteichoïque, le peptidoglycane, la flagelline ainsi que l’ADN bactérien, peuvent activer le système immunitaire inné. Parmi eux, les LPS induisent une réponse inflammatoire majeure, ce qui a suggéré leur rôle dans les maladies métaboliques[353, 422-424]. La translocation de LPS de la lumière intestinale vers le système circulatoire était initialement considérée comme étant efficacement bloquée par l’épithélium intestinal. Néanmoins, des LPS sont détectés dans le sang d’animaux sains[425] ainsi que dans le plasma humain, en dehors de toute situation pathologique, à des concentrations comprises entre 1 et 200 pg/mL[426-428]. Par contre, les patients atteints de diabète présentent des taux circulants de LPS plus élevés que les individus sains[429, 430]. Dans ce contexte, l’ingestion accrue de matières grasses est considérée comme l’un des facteurs conduisant à l’augmentation de l’endotoxémie[428, 431, 432]. Les LPS, de part leur fraction insoluble (lipide A) et leur structure, peuvent être incorporés dans des micelles, absorbés et intégrés dans les chylomicrons après un repas[425], ce mode de transport pouvant constituer un avantage physiologique car il favorise la clairance hépatique des LPS[433]. Néanmoins, une formation excessive de chylomicrons suite à une alimentation riche en graisses, augmente le risque d’une exposition extra-hépatique aux LPS[425].
Le récepteur des LPS, TLR4, est présent à la surface des cellules immunitaires (monocytes, macrophages, cellules de Kupffer) et d’autres cellules (adipocytes, hépatocytes, cellules endothéliales). La signalisation des LPS conduit finalement à l’activation de la MAPK et du facteur de transcription NF-ĸB, ce dernier activant l’expression de gènes codant pour des protéines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, iNOS, MCP1). Les voies de signalisation activées par la MAPK peuvent induire une résistance à l’insuline via divers mécanismes[ 9, 434]. Par ailleurs, l’administration de faibles doses de LPS à des souris se traduit par une inflammation de bas niveau et une hyperglycémie[422]. Chez l’homme, l’administration de LPS altère également la sensibilité à l’insuline[435, 436].
Les mécanismes potentiels reliant l’absorption de graisses à une augmentation de l’endotoxémie sont divers. Une alimentation riche en graisses peut augmenter la perméabilité intestinale chez la souris[437] et de plus, une réduction de l’expression de protéines des jonctions serrées a été rapportée chez des rats sous régime gras[438, 439]. Une autre conséquence de la consommation d’un régime riche en graisses est l’augmentation de la production de bile[439]. La bile possède des effets antibactériens et il est évident que certaines bactéries sont capables d’y résister, comme par exemple les Lactobacillus spp.[440] ou les Bacteroides spp.[441], et que certains pathogènes expriment des facteurs de virulence en réponse à la présence d’acides bilaires, comme Salmonella typhimurium[442, 443]. Un accroissement de la sécrétion de bile peut ainsi induire des mécanismes de résistance de la part des bactéries intestinales qui peut en fait se traduire par une surcroissance bactérienne dans l’intestin grêle et conduire finalement à une augmentation de la translocation bactérienne et de l’endotoxémie[444]. L’endotoxémie peut également résulter d’un effet direct de la bile sur la perméabilité intestinale[445].
Un régime diabétogène très riche en graises (49,5%) induit également des modifications dans la composition du microbiote intestinal, avec une réduction des Bifidobacterium spp., du groupe Clostridium coccoides-Eubacterium rectale et des Bacteroides spp. (technique semi-quantitative de FISH). Dans cette étude, une corrélation négative a de plus été révélée entre les Bifidobacterium spp. et l’endotoxémie[353]. Il est par ailleurs établi qu’un régime gras peut induire des modifications du microbiote intestinal indépendamment du développement de l’obésité. Ainsi chez le rat, un régime gras entraine une réduction du nombre total de bactéries dans le cæcum avec une augmentation de la proportion relative des bactéries appartenant aux ordres Bacteroidales et Clostridiales[438]. Chez l’homme, des patients atteints de diabète de type 2 montrent dans leur microbiote fécal, une diminution de la proportion de bactéries appartenant au phylum Firmicutes et plus particulièrement à la classe Clostridia, avec de plus, un ratio Bacteroidetes sur Firmicutes corrélé positivement avec la glycémie mais pas avec l’index de masse corporelle[446]. Une étude humaine à grande échelle a récemment révélé dans la flore fécale de patients atteints de diabète de type 2, une diminution de la proportion de bactéries productrices de butyrate (Clostridiales, Eubacterium rectale, Faecalibacterium praunitzii, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans) et une augmentation de la présence de pathogènes opportunistes[ 447]. Le butyrate contribue au renforcement de la barrière mucosale[146], notamment en stimulant la migration des cellules épithéliales[147] et en augmentant l’expression des mucines[148, 149]. La diminution de la quantité de bactéries produisant du butyrate peut ainsi conduire à une altération de la fonction de barrière mucosale et faciliter le passage d’agents bactériens pro-inflammatoires comme les LPS pour alimenter une inflammation métabolique.

Potentiel thérapeutique de la manipulation du microbiote dans le diabète de type 2

Les prébiotiques ont montré des effets intéressants sur le métabolisme, en réduisant notamment le statut inflammatoire induit par un régime gras. Les bactéries du genre Bifidobacterium et dans certains cas également du genre Lactobacillus, sont connues pour être favorisées en réponse à l’administration de certains prébiotiques[450, 451]. En conditions physiologiques, les bactéries du genre Bifidobacterium sont d’ailleurs capables de diminuer l’endotoxémie[422, 451]. L’administration d’oligofructoses chez l’homme améliore la tolérance au glucose et augmente la satiété[357, 358]. De plus, ces effets ont été démontrés chez la souris comme étant dépendants de l’action du polypeptide anorexigène GLP-1[ 355]. Mais les tentatives pour transposer ces observations chez l’homme sont ambigües, notamment en ce qui concerne les effets sur la satiété[452, 453]. Des évidences émergent ainsi supportant l’hypothèse que les prébiotiques peuvent influencer la composition du microbiote et ainsi impacter bénéfiquement le métabolisme. Mais le nombre de ces évidences est limité et nécessite des essais cliniques randomisés à plus grande échelle[350].
Les probiotiques par contre, contiennent des bactéries vivantes qui, si elles sont administrées de manière adéquate, affectent seulement de manière transitoire le microbiote[454]. De plus, certaines données suggèrent que les probiotiques influencent seulement le microbiote luminal mais pas mucosal[455]. Les études à propos de l’effet des probiotiques sur les caractéristiques du diabète de type 2 ont été principalement menées chez l’animal, et rapportent les bénéfices de diverses souches du genre Lactobacillus[456-458]. Une étude plus récente décrit les effets antidiabétiques et anti-inflammatoires de Lactobacillus casei chez des souris nourries d’un régime gras[459]. Même si les résultats sont encourageants chez l’animal, leur possible transposition chez l’homme reste incertaine. En effet, aucune des études citées ci-dessus ne montre de relation entre les effets métaboliques observés et la composition du microbiote. De plus, les Lactobacillus spp. sont largement utilisées dans l’industrie de l’élevage avicole notamment, et résultent en une prise de poids des animaux[460, 461]. Cet effet a été confirmé chez l’enfant et chez l’homme adulte[462-464].
Les synbiotiques par ailleurs, allient des souches probiotiques avec des prébiotiques. La part prébiotique étant sélectionnée sur la base de sa capacité à stimuler la croissance du probiotique, le synbiotique est alors plus efficace[350]. Une étude randomisée menée en double aveugle chez des patients diabétiques entre 50 et 60 ans, a montré une augmentation significative du taux de cholestérol HDL ainsi qu’une réduction significative de la glycémie à jeun suite à la consommation d’un mélange synbiotique contenant Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum et de l’oligofructose, en comparaison avec le groupe placebo[465]. Une publication récente, rapporte dans un modèle d’induction du diabète par la streptozotocine chez le rat, une diminution de la triglycéridémie et une augmentation du taux de cholestérol HDL en réponse à un traitement avec un mélange de yacon (Smallanthus sonchifolius) et de bactéries probiotiques (Enterococcus faecium, Lactobacillus helveticus). Par contre, ce synbiotique n’a pas diminué la glycémie des rats[466]. Le potentiel thérapeutique de mélanges synbiotiques dans le diabète de type 2 demande aujourd’hui à être plus amplement exploré.
Les antibiotiques, par ailleurs, impactent largement le microbiote intestinal. Ils sont normalement prescrits pour détruire ou prévenir une colonisation bactérienne, sans ciblage spécifique de certaines bactéries. La destruction des bactéries intestinales suite à l’usage d’antibiotiques cause des altérations dans différentes voies métaboliques induites par les bactéries. La tétracycline permet ainsi une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l’insuline chez les rats diabétiques et les souris obèses[467-469]. Par ailleurs, l’ampicilline et la norfloxacine entrainent une normalisation de la glycémie et une augmentation de la sensibilité à l’insuline chez la souris ob/ob. Par contre, il semble que l’obésité ne soit pas un facteur contributeur à cet effet car ces résultats étaient indépendants de toute modification du poids[470]. Un des mécanismes possiblement impliqués concerne une réduction de l’inflammation. L’endotoxémie et le niveau d’expression de TNF-α corrèlent en effet négativement avec la sensibilité à l’insuline[470]. De plus, un traitement antibiotique permet de diminuer l’endotoxémie chez le rat[471] et chez la souris, avec une inhibition du développement des désordres métaboliques chez la souris[437]. Une étude récente chez la souris C57Bl/6 nourrie d’un régime gras, rapporte un effet bénéfique de l’ampicilline sur l’amélioration de la tolérance au glucose, sans modification du poids ni du nombre de Treg, de lymphocytes Th1 et de cellules dendritiques tolérogènes dans la muqueuse de l’intestin[472]. Mais par ailleurs, l’exposition précoce aux antibiotiques oraux est associée à un surpoids chez l’enfant[473]. De manière encore plus intéressante, une association a été révélée entre une administration intraveineuse de vancomycine et un gain de poids chez l’homme adulte, probablement via une voie médiée par des Lactobacillus spp., puisque celles-ci sont résistantes à la vancomycine[474].
La transplantation fécale, par ailleurs, est utilisée avec succès en cas de colite pseudomembraneuse chez l’homme[475]. Une étude clinique randomisée en double aveugle, consistant à étudier les effets thérapeutiques d’une infusion de fèces de donneurs maigres sur la résistance à l’insuline de patients avec un syndrome métabolique, a permis d’améliorer le statut métabolique des patients[350]. Cette voie thérapeutique mérite donc également plus d’attention.

Animaux et régimes

Les animaux, des souris C57bL6/J mâles de huit semaines (Laboratoires Charles River), sont hébergés dans un environnement contrôlé, en cycle jour/nuit normal, avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Après une période d’acclimatation de deux semaines, les souris sont laissées sous régime normal pauvre en graisses [NC, 3% d’énergie sous forme de lipides, 21% sous forme de protéines et 64% sous forme d’hydrates de carbone (céréales)] (référence A04, Safe) ou soumises à un régime très riche en graisses et sans hydrates de carbone [HFD, 72% d’énergie sous forme de graisses (30% d’huile de maïs, 70% de lard), 28% sous forme de protéines et moins de 1% sous forme d’hydrates de carbone (cellulose)] (référence U8954 version 1, Safe). Le statut métabolique des souris est contrôlé par un suivi du poids et la réalisation de tests de tolérance au glucose. La masse grasse est déterminée par résonnance magnétique quantitative à l’aide de l’EchoMRI 3-in-1 Composition Analyzer (Echo Medical Systems). A la fin des différents protocoles, les souris sont sacrifiées par élongation cervicale sans mise à jeun préalable. Tous les protocoles expérimentaux sont approuvés et validés par le comité éthique local de l’INSERM.

Analyse de la morphométrie de l’iléon

La portion distale de l’iléon (1 cm) est prélevée délicatement et placée dans 1 mL de fixateur de Carnoy (éthanol absolu/chloroforme/acide acétique glacial) (60/30/10) pendant 2 heures à 4°C, puis transférée dans l’éthanol à 70%. Les échantillons sont ensuite inclus en paraffine et des coupes de 6 μm d’épaisseur sont réalisées. Les mucines sont colorées selon un procédé histochimique par la technique au bleu Alcian/PAS (acide périodique de Schiff). Les mucines acides sont colorées en bleu par le bleu Alcian et la réaction à l’acide périodique de Schiff, correspondant à l’oxydation des polysaccharides neutres par l’acide périodique, donne une couleur rouge. Cette technique combinée permet ainsi de colorer toutes les mucines et si les deux types de mucines (neutres et acides) sont présentes, la coloration peut aller du bleu-violet au violet suivant les proportions de chaque type. Les lames sont déparaffinées par deux bains successifs de 30 minutes dans un substitut du xylène (Microclearing, D-limonène, DiaPath), puis réhydratées par des bains de 5 minutes chacun dans l’éthanol absolu, l’éthanol à 95%, l’éthanol à 70%, l’éthanol à 50% puis dans le TBS (50mM Tris, 66mM NaCl, pH 7.6). Les lames sont ensuite colorées pendant 30 minutes dans une solution de bleu Alcian 8GX (Sigma-Aldrich) (0,001% dans l’acide acétique à 3%, pH 2.5), rincées dans l’eau distillée, placées pendant 5 minutes dans l’acide périodique à 0,5% (Sigma-Aldrich), rincées dans l’eau distillée, placées dans le réactif de Schiff (Sigma-Aldrich) (fuchsine basique : 0,001%, métabisulfite de sodium : 0,0018%, HCl concentré : 1%), rincées dans l’eau distillée, contre-colorées pendant 5 minutes dans l’hématoxyline, puis montées sous lamelle dans le mileu Aqueous Mount (SCYTEK référence AMT060) après un dernier rinçage. Après 24 heures de séchage, les coupes sont observées avec le microscope Zeiss Axio Scope.A1 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH). Les images sont acquises grâce à une caméra AxioCam ICc1 et au logiciel AxioVision 4.8 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH). Les différentes mesures morphométriques sont ensuite effectuées à l’aide du logiciel Axio Vision 4.8 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH).

Immunomarquage de Muc2, pNF-κB et NF-κB dans l’iléon

La portion distale de l’iléon (1 cm) est prélevée délicatement et placée dans 1 mL de fixateur de Carnoy (éthanol absolu/chloroforme/acide acétique glacial) (60/30/10) pendant 2 heures à 4°C, puis transférée dans l’éthanol 70%. Les échantillons sont ensuite inclus en paraffine et des coupes de 6 μm d’épaisseur sont réalisées. Les lames sont déparaffinées par deux bains successifs de 30 minutes dans un substitut du xylène (Microclearing, D-limonène, DiaPath), puis réhydratées par des bains de 5 minutes chacun dans l’éthanol absolu, l’éthanol à 95%, l’éthanol à 70%, l’éthanol à 50% puis dans le TBS (50mM Tris, 66mM NaCl, pH 7.6). Les coupes sont ensuite incubées avec l’un des 3 anticorps primaires sur la nuit à température ambiante (pNF-κB, Cell Signaling référence 3031, 1/1000 dans du sérum normal de chèvre à 10% dans le TBS) (NF-κB Cell Signaling référence 3034, 1/1000 dans du sérum normal de chèvre à 10% dans le TBS) (Muc2 H-300, Santa Cruz sc-15334, 1/250 dans du sérum normal de chèvre à 10% dans le TBS). Après un rinçage dans le TBS, une incubation est réalisée avec l’anticorps secondaire pendant 2 heures à température ambiante (Goat Anti Rabbit IgG-Biotin, Jackson ImmunoResearch référence 111-065-003, 1/500 dans le TBS). Après rinçage dans le TBS, les coupes sont ensuite mise à incuber avec de l’avidine-FITC (Sigma-Aldrich, 1/500 dans le TBS) pendant 2 heures, rincées dans le TBS, puis contre-colorées avec du DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole, 200 ng/mL, Sigma-Aldrich). Après un dernier rinçage dans le TBS, les coupes sont montées sous lamelle dans le milieu Aqueous Mount (SCYTEK référence AMT060) et laissées sécher pendant 24 heures. Les coupes sont observées à l’aide du microscope inversé à fluorescence Zeiss Axio Observer Z1 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH). Les images sont acquises avec la caméra Zeiss AxioCam MRm et le logiciel AxioVision 4.7.2 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH) et superposées avec Adobe Photoshop CS3 Extended 10.0 (Adobe Systems Inc.).

Marquage des bactéries autochtones dans l’iléon par hybridation in situ en fluorescence (FISH)

La portion distale de l’iléon (1 cm) est prélevée délicatement et placée dans 1 mL de fixateur de Carnoy (éthanol absolu/chloroforme/acide acétique glacial) (60/30/10) pendant 2 heures à 4°C, puis transférée dans l’éthanol à 70%. Les échantillons sont ensuite inclus en paraffine et des coupes de 6 μm d’épaisseur sont réalisées. Les lames sont déparaffinées par deux bains successifs de 30 minutes dans un substitut du xylène (Microclearing, D-limonène, DiaPath), puis réhydratées par des bains de 5 minutes chacun dans l’éthanol absolu, l’éthanol à 95%, l’éthanol à 70%, l’éthanol à 50% puis dans le tampon d’hybridation (20mM Tris, 0,9M NaCl, SDS 0,1%, pH 7.6) à 50°C pendant 20 minutes. Les coupes sont ensuite incubées avec une sonde universelle ARNr 16S couplée au Texas-Red, pendant 20 heures à 50°C et à l’obscurité (EUB338 5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′) (Eurogentec) (100 μg/mL dans le tampon d’hybridation). Un rinçage dans le tampon d’hybridation sans SDS est ensuite effectué pendant 20 minutes à 50°C. Les coupes sont ensuite contre-colorées avec du DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole, 200 ng/mL, Sigma-Aldrich). Après un rinçage dans le TBS (50mM Tris, 66mM NaCl, pH 7.6), les coupes sont montées sous lamelle dans le milieu Aqueous Mount (SCYTEK référence AMT060) et laissées sécher pendant 24 heures. Les coupes sont observées à l’aide du microscope inversé à fluorescence Zeiss Axio Observer Z1 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH). Les images sont acquises avec la caméra Zeiss AxioCam MRm et le logiciel AxioVision 4.7.2 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH) et superposées avec Adobe Photoshop CS3 Extended 10.0 (Adobe Systems Inc.).

Dosage des mucines par fluorimétrie directe

La réaction est basée sur la libération spécifique des O-glycosylations par beta-élimination en conditions alcalines modérées et la dérivatisation des extrémités réduites avec le 2-cyanoacétamide en présence de borate de sodium. La mesure de la fluorescence émise à 425 nm, contre une gamme étalon de N-acétylgalactosamine, permet finalement de calculer la quantité de O-glycosylations initiales et donc la quantité de mucines car les O-glycosylations sont spécifiques des mucines dans l’intestin. Mis à part les échantillons de muqueuse intestinale qui sont conservés à -20°C, tous les réactifs nécessaires sont préparés de manière extemporanée. Après décongélation sur glace, la muqueuse de l’iléon, prélevée par grattage de l’intérieur de l’iléon (8 cm distaux), est reprise dans du PBS pH 7.4 et chauffée pendant 10 minutes à 95°C pour inhiber les glycosidases. Les mucines sont ensuite solubilisées pendant 90 minutes à 37°C sous agitation. La beta-élimination et la dérivatisation sont ensuite réalisées de manière simultanée pendant 30 minutes à 100°C en présence d’une solution de 2-cyanoacétamide (Sigma-Aldrich) à la concentration de 0,1M dans l’hydroxyde de sodium 0,15M (Sigma-Aldrich). Un témoin négatif constitué de PBS seul ainsi qu’une gamme étalon de N-acétylgalactosamine (Sigma-Aldrich) subissent la réaction de beta-élimination et de dérivatisation dans les mêmes conditions que les échantillons. Du tampon borate pH 8.0, composé de borate de sodium 0,6M (Sigma-Aldrich) dans l’hydroxyde de sodium 0,15M (Sigma-Aldrich), est ensuite ajouté en excès à l’ensemble. Après homogénéisation, la lecture de la fluorescence se fait à 425 nm (excitation à 320 nm) sur 300 μL de la solution finale, à l’aide du fluorimètre Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific).

Mesure de la perméabilité intestinale au FITC-dextran 4kDa in vivo

Une quantité de 25 mg de FITC-Dextran 4 kDaltons (Sigma-Aldrich) est administrée par voie orale aux souris (200 μL d’une solution à 125 mg/mL dans du PBS pH 7.4), les souris n’étant pas à jeun. Après 1 heure, du sang est prélevé par voie rétro-orbitale à l’aide de capillaires pour micro-hématocrite. Le sang est ensuite centrifugé à 8000 g pendant 5 minutes à 4°C, et 80 μL de plasma sont ensuite déposés dans une plaque 96 puits noire. Le plasma d’une souris gavée avec 200 μL de PBS, constitue le témoin négatif. Une gamme étalon est réalisée par dilution de la solution mère de FITC-Dextran qui a servi à gaver les souris. La lecture de la fluorescence se fait à 425 nm (excitation à 320 nm) à l’aide du fluorimètre Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific).

Table des matières

CHAPITRE 1 Recherche bibliographique
A l’origine étaient les procaryotes
L’origine de la vie : une coévolution de la biochimie et de la géochimie
L’alternance prédation/symbiose comme dynamique de l’évolution
Les grandes divisions du monde du vivant
Les interactions entre microbes et eucaryotes
La coévolution microbes-eucaryotes, « pour le meilleur et pour le pire ? »
La microflore normale du corps humain
Homéostasie de la relation hôte-microbiote au niveau de la muqueuse intestinale
Perte de l’homéostasie hôte-microbiote intestinal et conséquences
La translocation bactérienne : où se situe vraiment l’interface hôte-microbiote ?
Potentiel thérapeutique de la manipulation du microbiote intestinal
Le diabète de type 2
Les coûts du diabète
Le diabète de type 2 est une maladie inflammatoire
Microbiote intestinal et diabète de type 2
Potentiel thérapeutique de la manipulation du microbiote dans le diabète de type 2
Objectifs de la thèse
CHAPITRE 2 Adhérence et translocation bactériennes au cours du diabète
CHAPITRE 3 Microbiote tissulaire et intestinal au cours du diabète
CHAPITRE 4 Relation hôte-microbiote intestinal avant le diabète
CHAPITRE 5 Conclusion générale
Annexe
Bibliographie

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