Soutenance mémoire
HISTORIQUE DE LA TUBERCULOSE
On a pu prouver l’existence de la tuberculose depuis 2400 AV–JC par la mise en évidence de la présence du bacille tuberculeux sur la momie d’un Egyptien (Nerlich et al. 1997). La tuberculose était appelée « phtisie », terme qui englobait toutes les maladies pulmonaires tuberculeuses ou non. C’est Rend Laënnec (1781-1826) qui a proposé une conception de la tuberculose comme une maladie autonome dont la lésion anatomique de base est un tubercule. Rilliet et Barthez décrivaient deux principales formes de tuberculose : pulmonaire et pleurale (Daffe et al. 1983). Avant le 24 mars 1882, date de la découverte par Robert Koch (1843 1910) du bacille tuberculeux (BK), l’existence de nombreuses familles de tuberculeux évoquait que la tuberculose était héréditaire. Ce n’est qu’en décembre 1865 que Villemin a montré que la tuberculose était une maladie infectieuse, contagieuse et inoculable. Entre 1908 et 1920, Albert CALMETTE et Alfonse GUERIN mettent au point un vaccin contre la tuberculose reposant sur l’injection de bacilles tuberculeux vivants mais de virulence atténuée appelé « Bacille de Calmette et Guérin » ou « BCG » qui fut utilisé pour la première fois en juillet 1921. En 1944, S.A. WAKSMAN, un microbiologiste américain, a découvert le premier antibiotique actif contre le bacille tuberculeux, la streptomycine. Cette découverte a ouvert la voie de la chimiothérapie. Au cours des années suivantes, d’autres médicaments bactériostatiques et bactéricides ont été trouvés, ce qui a ouvert la voie de la polychimiothérapie.
Caractéristiques bactériennes
Les mycobactéries sont des bacilles légèrement incurvés ou droits de 1 à 10 µm de longueur et de 0,2 à 0,6 µm de diamètre. Elles sont parfois assemblées en filaments ou pseudomycelium qui se fragmentent en bâtonnets sous agitation. Elles n’ont ni flagelle ni appendice de type pilis ou fibriae, ni capsule et ne forment pas de spore. Elles sont exigeantes pour la culture qui nécessite la présence de nombreux facteurs de croissance. Le temps de génération, est élevé d’environ 20 heures, ce qui explique la lenteur de la croissance de 3 à 8 semaines sur les milieux solides et de 10 à 15 jours pour les milieux liquides. Elles se multiplient à un pH neutre. Du point de vue physiologique, les mycobactéries sont aérobies ou microaérophiles. La température optimale de croissance varie selon les espèces entre 30 et 40°C. Les mycobactéries synthétisent des catalases et produisent des acides à partir des sucres par la voie oxydative. Certaines synthétisent des pigments caroténoïdes non diffusibles, conditionnés par l’exposition de culture à la lumière visible (espèces dites photochromogènes) ou même à l’obscurité (scotochromogènes). Sur milieu solide, les différentes mycobactéries donnent des colonies de types différents : colonies lisses ou rugueuses, eugoniques (grande taille) ou dysgoniques (petite taille). Les mycobactéries ont tendance à se ranger parallèlement pour constituer des « cordes » ou des « serpentines » ; cette propriété est associée à la présence de glycolipide toxique « cord factor ». La faible perméabilité de l’enveloppe mycobactérienne aux solutés est généralement due à la présence des acides mycoliques qui formeraient une barrière hydrophobe (Minnikin et al. 1982). Ces acides mycoliques sont également responsables de l’acido-alcoolo-résistance de mycobactéries. Cette propriété constitue la base de la technique de coloration de Ziehl Neelsen, mise au point par Robert Koch et améliorée par F. Ziehl et F.C. Neelsen en 1885. Les mycobactéries colorées à la fuchsine phénique retiennent le colorant après un traitement par l’alcool acidifié alors que les autres bactéries sont rapidement décolorées.
« Mycobacterial Interspersed Repetitive Units Variable
Number of Tandem Repeat » (MIRU – VNTR) Les MIRU-VNTR type I et II ont été identifiés pour la première fois dans la région intercistronic de l’operon appelé SenX3/RegX3 codant respectivement un régulateur transcriptionnel et un senseur de système à deux composants chez Mycobacterium tuberculosis ; les MIRU-VNTR type III sont identifiés dans le cosmide Y1a11 du M. tuberculosis (Supply et al. 1997), une étude récente suggère qu’ils jouent un rôle dans l’évolution du génome bactérien (Nowak 1994 ; Nadir et al. 1996). Les MIRU-VNTR sont des éléments de 40 à 100 paires de bases directement répétés en tandem et dispersés dans les 41 régions inter géniques du génome des bactéries du complexe M. tuberculosis et M. leprae (Magdalena et al. 1998 ; Supply et al. 1997 ; Supply et al. 2000). Ils sont donc comparables aux microsatellites trouvés chez l’homme (Supply et al. 2000). La variabilité au niveau des loci MIRU-VNTR est due à des additions ou des délétions séquentielles d’unités de taille identique (Savine et al. 2002). Le chromosome de M. tuberculosis H37 Rv contient au moins 41 loci MIRU-VNTR (figure 1) qui sont classifiés en 3 types majeurs (Supply et al. 1997) : les séquences de type I qui ont environ 77 pb, les MIRUVNTR de type II qui ont une délétion de 24 pb du côté 3’ du type I et les MIRU-VNTR de type III qui ont une délétion de 15 pb du 5’ du type I. Bien que les loci MIRU–VNTR soient polymorphes, la séquence nucléotidique des régions flanquantes est hautement conservée pour chacun des loci, à l’exception d’une très rare substitution d’une paire de bases (Supply et al. 2000).
« LE SPOLIGOTYPING » OU SPOLIGOTYPAGE
Le « spoligotyping » est basé sur le polymorphisme de 43 « spacers » intercalant les séquences DR du locus DR dans le génome du complexe M. tuberculosis. La présence ou l’absence d’une ou plusieurs de ces séquences, dénommées « spacer 1 » à « spacer 43 » détermine le « spoligotype » d’une souche (Kamerbeek et al. 1997). Les spacers sont amplifiés par PCR en utilisant deux amorces Dra et Drb complémentaires de la partie 5’ de chaque brin d’ADN de la séquence DR. Les amplicons (produits de la PCR) sont ensuite hybridés avec des sondes oligonucléotides correspondant aux 43 spacers. L’amorce Dra est marquée à la biotine. Les ADN synthétisés seront donc marqués par la biotine ce qui permet leur détection avec la streptavidine couplée à la peroxydase et la révélation par chimioluminescence. Cette technique est avantageuse, peu coûteuse et facile à mettre en œuvre. De plus, les résultats sont facilement interprétables ce qui rend possible les échanges interlaboratoires. Comme elle est basée sur l’amplification par PCR, elle est rapide à mettre en œuvre et ne demande pas de culture bactérienne pour avoir suffisamment d’ADN. Elle est plus discriminante que la RFLP IS6110 pour les M. bovis qui comporte une ou deux copies IS6110 (Aranaz et al. 1996 ; Aranaz et al. 1996 ; Cousins et al. 1998; Kamerbeek et al. 1997 ; Kremer et al. 1999). Néanmoins, elle présente quelques désavantages puisqu’elle s’avère moins discriminante que la RFLP IS6110 pour les souches ayant plus de cinq copies IS6110 (Aranaz et al. 1996) et le polymorphisme génétique est restreint à un seul locus, le « DR cluster ».
DOSAGE DE L’ADN GÉNOMIQUE
Le dosage de l’ADN génomique se fait par l’électrophorèse sur minigel d’agarose de 0,8%. Dans un erlen de 100ml contenant 25ml TBE N, on fait fondre 2g d’agarose au four à microondes. On laisse refroidir jusqu’à une température d’environ 50°C, puis on ajoute 2µl de BET (10mg/ml). Le gel est coulé dans un moule (support de minigel de 8 cm de large et 12 cm de long) dans lequel est placé un peigne (pour avoir des puits) et on laisse le gel se solidifier pendant environ 30 minutes. Après avoir retiré le peigne, on le met dans la cuve électrophorèse, les puits du côté de l’électrode chargé négativement. Un mélange de 2µl d’ADN + 3µl d’eau + 1µl de bleu 6N est déposé par puits. Dans les deux puits situés au deux extrémités, on dépose respectivement 2µl et 4µl de λ DNA (50 ng/µl). La migration est réalisée à 70 volts pendant 1 heure. On estime la concentration d’ADN génomique contenu dans le dépôt en comparant l’intensité de la bande par rapport à celle du marqueur λ DNA.
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Table des matières
I INTRODUCTION
II GENERALITES
II.1 LA TUBERCULOSE
II.1.1 HISTORIQUE DE LA TUBERCULOSE
II.1.2 LES MYCOBACTÉRIES
II.1.2.1 Classification
II.1.2.2 Caractéristiques biochimiques des mycobactéries
II.1.2.3 Caractéristiques bactériennes
II.1.3 PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TUBERCULOSE
II.1.4 DIAGNOSTIC ET TRAITEMENT
II.2 GENOTYPAGE DES SOUCHES DU COMPLEXE Mycobacterium tuberculosis
II.2.1 LES MARQUEURS GÉNÉTIQUES
II.2.1.1 Séquence d’insertion IS6110
II.2.1.2 Séquence répétitive DR (Direct Repeat)
II.2.1.3 « Mycobacterial Interspersed Repetitive Units Variable Number of Tandem Repeat » (MIRU – VNTR)
II.2.1.4 SNPs ou « Single Nucleotide Polymorphism »
II.2.1.5 Polymorphic GC-rich repeat sequence (PGRS)
II.3 METHODES DE TYPAGE
II.3.1 TYPAGE MOLÉCULAIRE PAR « RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM » AVEC IS6110 (OU RFLP–IS6110)
II.3.2 LE SPOLIGOTYPING OU SPOLIGOTYPAGE
II.3.3 GÉNOTYPAGE des MIRU-VNTRs
II.4 BASES DE DONNEES
II.5 EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE DE LA TUBERCULOSE A MADAGASCAR
III MATERIELS ET METHODES
III.1 MATERIELS
III.1.1 MATÉRIELS BIOLOGIQUES
III.1.2 THERMOCYCLEUR
III.1.3 RÉACTIFS
III.1.3.1 Réactifs pour l’extraction de l’ADN génomique Mycobacterium tuberculosis
III.1.3.2 Réactifs pour l’amplification par PCR
III.1.3.3 Réactifs pour l’électrophorèse d’ADN
III.2 METHODES
III.2.1 EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE PAR LA MÉTHODE AU CTAB
III.2.2 DOSAGE DE L’ADN GÉNOMIQUE
III.2.3 MÉTHODE DE GÉNOTYPAGE AVEC LES MARQUEURS MIRU – VNTR
III.2.3.1 Principe
III.2.3.2 Amplification par PCR des MIRU – VNTR
III.2.3.2.1 Principe
III.2.3.2.2 L’ADN de travail
III.2.3.2.3 Préparation des amorces
III.2.3.2.4 Mise au point des réactions PCR
III.2.3.3 Electrophorèse sur gel d’agarose
III.2.3.3.1 Préparation du gel d’agarose 1,5 %
III.2.3.3.2 Electrophorèse
III.2.3.3.3 Interprétation des résultats
III.2.3.4 Enregistrement des résultats
III.2.3.5 Analyse des résultats
III.2.3.5.1 Recherche des génotypes MIRU–VNTR des souches testées dans la base de données MIRU–VNTRplus
IV RESULTATS
IV.1 RESULTAT DE LA MISE AU POINT DE L’AMPLIFICATION PAR PCR DES LOCI MIRU-VNTR
IV.2 DIVERSITE ALLELIQUE DES MIRU-VNTR
IV.3 ANALYSE DES PROFILS MIRU–VNTR
IV.3.1 ANALYSE DES RÉSULTATS AVEC 7 DES 9 LOCI MIRU–VNTR
IV.3.2 ANALYSE DES SOUCHES AVEC LE 12 LOCI MIRU–VNTR
IV.3.3 ANALYSE AVEC LES 15 LOCI MIRU–VNTR
IV.3.4 ANALYSE AVEC LES 24 MIRU–VNTR
IV.3.5 ANALYSE AVEC LES 6 LOCI LES PLUS POLYMORPHES
IV.4 ANALYSE DES PROFILS MIRU–VNTR SELON LE SPOLIGOTYPE
IV.4.1 ANALYSE DES 7 LOCI MIRU-VNTR ASSOCIÉS AVEC LE SPOLIGOTYPE
IV.4.2 ANALYSE DES 12 LOCI MIRU-VNTR ASSOCIÉS AVEC LE SPOLIGOTYPE
IV.4.3 ANALYSE DES 15 MIRU-VNTR ASSOCIÉS AVEC LE SPOLIGOTYPE
IV.4.4 ANALYSE DES 24 MIRU-VNTR ASSOCIÉS AVEC LE SPOLIGOTYPE
IV.4.5 ANALYSE AVEC LES 6 LOCI MIRU-VNTR LES PLUS POLYMORPHES ASSOCIÉS AU SPOLIGOTYPING
IV.5 IDENTIFICATION DE LA FAMILLE SPOLIGOTYPE PAR LA METHODE MIRU– VNTR
IV.6 LES LOCI LES PLUS DISCRIMINANTS POUR CHAQUE FAMILLE SPOLIGOTYPE
IV.7 COMPARAISON DES GENOTYPES MIRU–VNTR DES SOUCHES TESTEES DANS LA BASE DE DONNEES MIRU–VNTRPLUS
V DISCUSSION
VI CONCLUSION et PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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