Génomique des bactéries lactiques

Génomique des bactéries lactiques

Les méthodes de vraisemblance sont plus probabilistes. En se basant sur le taux de substitution pour chaque élément de base (nucléotide pour les séquences d’ADN) au cours du temps, on estime la vraisemblance de la position et de la longueur des branches. En taxonomie actuelle, les méthodes de maximum de vraisemblance et de Bayesian permettent la meilleure optimisation des données de séquences et l’obtention de résultats de phylogénie les plus robustes.

Séquençage du génome total d’un lactocoque thermotolerant :

Certains termes techniques ne trouvent pas de traduction ni d´équivalent corrects dans la langue française. Ils seront donc employés en langue anglaise tout au long de ce manuscrit, et ce en italique.

Choix de la souche :

La souche de Lactococcus lactis ssp. Lactis bv. diacetylactis HD9B_GL2 a été sélectionnée pour le séquençage. Cette souche, isolée en 2009 du lait cru de chamelle á Tindouf, une région chaude du sud algérien et rassemblant plusieurs propriétés d’intérêt biotechnologique laitier (Drici et al. 2010). L’originalité de l’isolat 9B réside aussi dans sa capacité à se développer à 50°C et à une spécificité d’hydrolyse des caséines différente de celles des PrtPs de type PI et PIII des lactocoques laitiers actuellement connus. La souche HD9B_GL2 héberge plusieurs plasmides dont trois dénommés pPrtP9B (10 kb), pLac9B (12 kb) et pCit9B (25 kb) sont impliqués dans trois différentes fonctions métaboliques : l’hydrolyse des caséines du lait (pPrt9B), la fermentation du lactose (pLac9B) et du citrate (pCit9B). La souche HD9B_GL2 a été retenue aussi car elle montre un phénomène de transfert horizontal de gène car le système cit responsable du transport et du métabolisme du citrate porté par le plasmide pCit 9B (25 kb), est identique à celui de la souche Leuconostoc paramesenteroides J1. Il est composé du gène citI et de l’opéron cit-MCDEFGRP au lieu de l’opéron citQRP habituel des biovariants diacetylactis, le cluster citI-citMCDEFGRP a été acquis d’autres bactéries lactiques (Leuconostoc).

Préparation de l’ADN génomique pour le séquençage haut- débit Illumina :

Une colonie pure est repiquée sur 2ml du milieu M17 liquide et incubée à 30°C pendant 18 heures. L’ADN génomique total de la souche 9B a été extrait par DNeasy blood and tissue kit (DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN GmbH, Hilden, Allemagne). L´ADN génomique ainsi purifié et élué dans 50 μl dans du tampon AE du même kit et envoyé dans un Eppendorf au prestataire après avoir vérifié sa concentration et sa qualité au Nanodrop (Peqlab, VWR international GmbH, Erlangen, Allemagne). La concentration de  ´ADN génomique á séquencer selon Illumina doit être 1-2μg au minimum (20 ng/μl).

Principe du séquençage par la technique Illumina (séquençage par terminaison cyclique réversible):

L´entreprise Solexa a commercialisé son premier séquenceur avec succès en 2006 : le génome Analyzer (GA). La spécificité de cette technologie repose sur une amplification en pont (bridge PCR) des fragments á séquencer. Elle a lieu sur une surface de verre appelée flow cell (FC), similaire á une lame de microscope, divisée en huit lignes (á  ´origine, une ligne par échantillon). Les fragments de la librairie á séquencé possèdent des adaptateurs á leurs extrémités. Ceux-ci vont leur permettre de se fixer de façon aléatoire sur la FC, par hybridation sur les amorces qui en couvrent la surface (voir Figure 7). Un nouveau brin est alors synthétisé par une polymérase (Figure 7a) : il est fixé de façon covalente á la FC. Le brin d´origine est alors éliminé par dénaturation (b) et  extrémité libre du brin restant s´hybride á une amorce adjacente pour former un pont  ADN double brin (d) puis les deux copies sont libérées par dénaturation (e). Le cycle  amplification en pont (étapes c á e) recommence pour former á terme un regroupent  ADN clonal en une zone appelée cluster (f). Les brins antisens (correspondant aux amorces vertes) sont ensuite clivés (g) : c´est la linéarisation. L´extrémité 3´ libre des fragments  ´ADN est bloquée et l´amorce de séquençage s´y hybride (voir Figure 8). Le séquençage s´effectuent sur des centaines de millions de clusters simultanément, grâce á une chimie de terminateurs réversibles : des nucléotides bloqués marqués par fluorescence sont ajoutés, l´un d´entre eux est incorporé, la fluorescence émise est relevée puis le fluorophore et le bloqueur sont clivés permettant l´ajout d´un nouveau nucléotide. A chaque cycle d´incorporation, une base peut être déterminée.

Analyse bio-informatique des données de séquençage:

L’automatisation est ce qui conduit les technologies à être pratiques pour un nombre important de personnes. En sciences de la vie, l’automatisation permet d’accélérer les découvertes. De plus, l’automatisation augmente la reproductibilité des processus scientifiques. En génomique, trois principales composantes technologiques guident les avancées. La première composante est le séquençage à haut débit de l’ADN (Shendure et al. 2005; Shendure and Ji 2008; Fuller et al. 2009; Ng et al. 2009; Hiatt et al. 2010; Marx 2013). Le séquençage de l’ADN permet de lire le contenu de l’ADN. Les systèmes de séquençage sont largement automatisés et permettent de décoder d’immenses quantités de données. La deuxième composante technologique en génomique est l’approvisionnement automatique de ressources informatiques ex : les superordinateurs. La troisième composante importante dans ce triangle est la disponibilité de logiciels adaptatifs pour la génomique. Un logiciel est dit adaptatif s’il peut s’adapter de façon à utiliser les ressources mises à sa disposition. Les nouvelles technologies de séquençage de l’acide désoxyribonucléique analysent des milliards de molécules en parallèles, permettant désormais l’obtention de très volumineux ensembles de données biologiques. De telles quantités de séquences promettent de répondre à d’importantes questions scientifiques. Cependant, il y a un besoin pressant pour des méthodologies parallèles pour transformer les séquences en connaissances.

Types d’analyse
Principalement deux types d’analyse peuvent être réalisés sur des données de séquençage de l’ADN. Ces deux types sont les alignements (ou les analyses utilisant des alignements) et l’assemblage de novo. Une séquence de référence pour le génome de l’espèce étudiée est nécessaire pour aligner des séquences d’ADN. Ce n’est pas le cas pour l’assemblage de novo. En méta-génomique, l’assemblage de novo est souvent nécessaire puisque les génomes de références nécessaires pour aligner des séquences ne sont pas disponibles.

Alignement
Le reséquençage consiste à obtenir de l’information génétique pour un échantillon et à comparer cette information à une information de référence qui est considérée normale. Les différences entre les informations obtenues et le référentiel suggèrent des changements dans l’architecture génétique qui doit être validée afin d’en vérifier l’impact sur le phénotype. Le terme reséquençage est souvent associé implicitement à des méthodes d’analyse utilisant les alignements. Les structures de données et les algorithmes sont différents dans ces aligneurs. Cependant, ce sont des systèmes similaires qui alignent des lectures d’ADN (format : fastq) sur une référence (format : fasta) et produisent des alignements (format : sam (Li et al. 2009).

Construction de gabarits « Scaffolding »
La construction de gabarits (scaffolds) est une tâche bio-informatique. Elle consiste à ordonner et à orienter les séquences assemblées en utilisant des paires de séquences ou en utilisant des cartes optiques de restriction (Nagarajan et al. 2008). Myers et ses collaborateurs ont proposé un algorithme vorace pour la construction de gabarits (Althaus et al. 2002). Les nouveaux outils utilisés dans ce travail et qui permettent de construire des gabarits génomiques, comme SSPACE (Boetzer et al. 2011), sont des meilleures implémentations (vitesse, facilité d’utilisation).

Estimation de la qualité globale des lectures et filtration des lectures
A chaque nucléotide des lectures de Solexa/Illumina est associé un score de qualité. Ce score est dépendant de la qualité du signal détecté en fonction du bruit de fluorescence. Un score élevé indique une probabilité plus faible que le séquenceur se soit trompé. La qualité de la séquence brute est évaluée. Les lectures possédant des nucléotides non identifiés (représentés par un N dans la séquence) n’ont pas été considérées. Il a été démontré que les lectures dont la longueur est trop faible ou trop élevée ont un nombre plus important d’erreurs. Les seuils de filtration ont été choisis de manière à conserver les lectures de meilleures qualités tout en limitant la perte d’information.

L’assemblage des données issues du séquençage nouvelle génération
Un assembleur est programme informatique dont la tâche est de combiner les lectures obtenues après séquençage en séquences contigües, aussi appelées contig, en se basant sur l’identité de séquences entre les lectures. De cette façon, deux lectures se chevauchant proviennent vraisemblablement de la même région. L’étape de « scaffolding» (échaffaudage) a pour but d’orienter et de placer les contigs les uns par rapport aux autres pour obtenir une séquence unique, bien que possédant des lacunes (soit des trous dans la séquence finale). Ces lacunes seront corrigées lors de l’étape de finition du génome qui vise à combler les trous restant dans l’assemblage par des méthodes expérimentales, comme la PCR ou l’extension d’amorces. Des indices statistiques tels que le N50 (Le N50 est la taille du plus petit contig tel que 50 % de la longueur cumulée de l’ensemble des contigs obtenus après assemblage soit contenue dans des contigs de taille égale ou supérieure), la taille moyenne ou la taille cumulée des contigs permettent d’estimer la qualité d’un assemblage. Le postulat est que plus les contigs formés sont grands, moins il y aura de trous dans la séquence génomique reconstituée. Toutefois, il est nécessaire de vérifier la justesse des contigs formés (la présence de contigs chimériques notamment).

Les méthodes d’assemblage des séquences:

La méthode « overlap-layout-consensus »

Cette méthode est l’une des premières utilisées avec succès pour assembler une séquence génomique (Miller et al. 2010). Le principe général est de fusionner des séquences chevauchantes, en commençant par celles ayant les chevauchements les plus significatifs, jusqu’à formation d’une séquence unique (figure 14). La première étape, dite overlap, sert à calculer le meilleur alignement possible entre deux lectures en tenant compte des éventuelles erreurs de séquençage. Chaque alignement est pondéré par un score qui va tenir compte du pourcentage d’identité nucléotidique et de la longueur de cet alignement entre deux lectures. L’étape de layout permet de déterminer l’ordre dans lequel les lectures vont être assemblées. Pour la plupart des assembleurs, des paires de lectures sont sélectionnées en fonction de leur score (les scores les plus élevés en premier) et, si l’alignement est considéré comme cohérent, les deux séquences sont fusionnées pour former un contig. Cette étape est la plus complexe de par la difficulté à déterminer la cohérence de l’alignement entre deux lectures. En effet, il est nécessaire de discriminer un chevauchement réel, où les différences entre les deux séquences sont dues aux erreurs de séquençage, d’un chevauchement dû à une répétition, où les différences sont dues aux mutations ou de vraies variations génétiques. La dernière étape dite de consensus, sert, comme son nom l’indique, à établir la séquence consensus des contigs obtenus lors de l’étape de layout. La méthode la plus simple est de déterminer à chaque position quelle base est la plus représentée.

L’approche du graphique « De Bruijn »
L’assemblage de novo de génomes est le processus par lequel une grande quantité de morceaux d’ADN – lesquels sont appelés les lectures – sont mis ensemble afin de reconstruire des morceaux de plus grande taille (Nagarajan et al. 2008; Pop 2009). Ce type d’analyse nécessite des graphes, comme un graphe de de Bruijn, pour stocker et travailler sur les données. Cette méthode d’assemblage a été mise au point pour s’affranchir de l’étape complexe de Layout utilisée par la méthode « overlap-layout consensus » (Pevzner et al. 2001). Les lectures qui doivent être assemblées sont préalablement fragmentées en sousséquences chevauchantes de taille constante. Ces sous-séquences sont appelées K-mer (avec K correspondant à la longueur). Deux Kmer vont être assemblés si leurs séquences ne divergent que par le premier de l’un et le dernier nucléotide de l’autre (figure 9). Ainsi une identité parfaite doit être partagée entre les deux séquences qui se chevauchent. De cette façon il est théoriquement possible d’établir un lien entre chacun des K-mer, la présence des répétitions empêchant ce cas idéal dans la pratique, et de reconstituer une séquence génomique (figure 9). Il semble paradoxal de fragmenter des lectures alors que leur longueur est importante pour la résolution des répétitions. Cependant, cette méthode demande peu de ressources computationnelles par rapport au nombre de lectures qu’il est possible d’assembler. En effet, la recherche de chevauchements par la méthode « overlap-layoutconsensus » nécessite de calculer des alignements entre chaque lectures. Ainsi, plus la quantité de données à analyser augmente, plus le temps et les ressources informatiques nécessaires à l’assemblage augmentent. Pour l’approche de« de Bruijn », cette étape de layout n’a pas à être opérée pour l’assemblage, car une identité de séquence parfaite doit exister entre deux lectures pour qu’elles se chevauchent. Cette approche d’assemblage est devenue la référence pour assembler des séquences issues de techniques de séquençage produisant un grand nombre de données comme celles d’Illumina/Solexa ou de SOLiD. Toutefois, ce principe d’assemblage est particulièrement sensible aux erreurs car une identité parfaite entre K-mer est requise pour valider un lien. Ainsi en pratique, l’assemblage de séquences par cette méthode demande des lectures possédant peu d’erreurs pour être efficace.

Les bactéries lactiques sont capables de fermenter les sucres en acide lactique. Ceci représente un outil très important de la technologie industrielle pour la transformation et la conservation de nombreux produits alimentaires d’origine végétale ou animale. Les sucres fermentés par les bactéries lactiques sont nombreux et appartiennent à plusieurs catégories à savoir : les hexoses, les pentoses, les disaccharides et les oligosaccharides. Selon les genres ou les espèces des bactéries lactiques l’une des deux voies suivantes peut être utilisée dans le métabolisme des sucres: (1) la voie homofermentaire est associée aux genres Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus, VagococcusTétragenococcuset Carnobacterium. La glycolyse conduit à la formation exclusive d’acide lactique (CH3-CHOH-COOH) ; (2) la voie hétérofermentaire, appelée ausssi voie des pentoses phosphates, est spécifique des genres Leuconostoc, Oenococcuset Weissella et conduit à la formation de quantité équimolaire d’acide lactique, d’acétate, d’éthanol et de CO2 (Cogan, 1980). Les espèces du genre Lactobacillus sont séparées en trois groupes en fonction du leur type fermentaire : homofermentaires, hétérofermentaires stricts et hétérofermentaires facultatifs qui métabolisent les hexoses en acide lactique par la voie homofermentaire, et qui dégradent aussi les pentoses par voie hétérofermentaire. Le métabolisme des sucres chez les bactéries lactiques requiert d’abord leur transport à l’intérieur de la cellule bactérienne. Selon les espèces, cette internalisation des sucres met en jeu des perméases qui ne modifient pas le soluté au cours du transport, ou un système phosphoénol-transférase (PEP/PTS) qui phosphoryle le sucre au dépend du phosphoénolpyruvate (McKay et al. 1969; McKay et al. 1970; Vaughan et al. 1996). C’est le cas du lactose (C12H22O11) sucre du lait (49 g/L) dont le métabolisme a fait l’objet de plusieurs études approfondies dans des revues (de Vos and Vaughan 1994; Vaughan et al. 1996; Neves et al. 2005). Chez les espèces du genre Lactococcus, le lactose phosphorylé est catabolisé par une phospho-ß-galactosidase (P-ß-gal) alors que chez Leuconostoc c’est une ßgalactosidase qui hydrolyse le lactose. Ainsi, chez les bactéries lactiques, la différence dans les voies métaboliques (homo- ou hétérofermentaires) du lactose est fonction de l’équipement enzymatique.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES:

Cette thèse est constituée de cinq chapitres. Le premier chapitre correspond à une synthèse bibliographique ayant pour but de situer le travail dans son contexte scientifique. Elle comporte une étude sur la génomique des bactéries lactiques, la réponse au stress thermique chez les lactocoques, l´impact de la bioinformatique sur l´étude des bactéries lactique, et les techniques du séquençage. Le deuxième chapitre est la présentation du matériel et méthodes utilisés dans cette étude. Le troisième chapitre, correspond aux résultats obtenus. Ce chapitre est divisé en trois sous-chapitres : Un premier sous chapitre qui comporte une étude sur la diversité génétique des lactocoques dans le lait de chamelle des régions arides d’Algérie. Dans ce chapitre, nous avons identifié des lactocoques á l´échelle de sous-espèce en se basant sur d´autre gènes « single protein » tel que le gène gdpP qui a un pouvoir discriminant plus important que le 16r ADN et avec lequel nous avons remarqué la présence de phénomène de transfert horizontal de gène chez certaine souche utilisée dans ce travail de thèse. Le deuxième sous- chapitre, est principalement une étude de approfondie de l´analyse de la séquence génomique d´un lactocoque thermotolerant afin d´identifier les déterminants génétiques des gènes heat shock impliqués dans la réponse au stress thermique chez ce lactocoques ainsi que leur organisation génétique dans le chromosome bactérien, avec notamment un inventaire des gènes impliqués dans la réponse au stress thermique est présenté. Le troisième sous chapitre, est une étude du consortium microbien présent dans le lait cru de chamelle  ´Algérie, tout en se basant sur l´analyse métagénomique d´une microcommunauté microbienne.

Table des matières

Introduction 
Problématique
Objectifs de la thèse
Stratégie d’étude
Chapitre 1 : Synthèse bibliographique 
Bactéries lactiques :
Description et utilisation
Taxonomie et classification phylogénétique
Le genre Lactococcus
Génomique des bactéries lactiques
Historique et caractéristiques générales des génomes des LAB
Apports de la génomique sur l’étude des bactéries lactiques
Informations issues d’un génome
Structure du génome
Capacités métaboliques
Comparaison de génomes
Génome de Lactococcus lactis
Les technologies NGS « Next Generation Sequencing »
Bioinformatique et biologie computationnelle
Le processus de séquençage
La méthode de Sanger
Automatisation avec le séquenceur 3730xl
La prochaine génération
Le pyroséquençage 454
Le séquençage Illumina
Autres technologies
Helicos
Pacific Biosciences
Oxford Nanopore
Ion Torrent Ion Torrent
Moleculo
La métagénomique
Séquençage des génomes de LAB
Analyse bio-informatique des génomes et bases de données
Outils d’analyse et d’annotation des séquences
Bases de données
Intérêts du séquençage des génomes de Lactococcus lactis
Réponses au stress chez les bactéries lactiques
La réponse générale au stress
Le stimulon de réponse au stress thermique
Les BL et la régulation des réponses aux stress
Le stress thermique Chez les BL
Lactococcus lactis et le stress hyperthermique
Les protéines de choc thermique chez Lactococcus lactis: synthèse et
régulation; thermotolérance
Introduction
Les protéines du choc thermique
Les chaperonines : dissociation des agrégats et remodelage des protéines
La protéolyse ATP-dépendante chez les bactéries
Identification des substrats
Reconnaissance et fixation du substrat par l’ATPase
Transport du substrat jusqu’au site de protéolyse
Protéolyse et évacuation des produits de dégradation
Les principales protéases ATP-dépendantes bactériennes
La sérine-protéase Lon
La métalloprotéase FtsH
Les complexes protéasiques de ClpP
ClpP
Les chaperonines-ATPases partenaires de ClpP
Régulation de la synthèse des protéines de choc thermique
La thermotolerance
Conclusion
Chapitre 2 : Matériels et méthodes 
Matériel biologique
Test de pureté
Culture sur milieu M17 liquide
Test de pureté sur milieu M17 solide et microscopie
Coloration de Gram
Conservation sur glycérol 30% stérile
Test de thermotolérance
Analyse physiologique
Test de Protéolyse en milieu solide Agar-lait
Conservation dans le lait
Screening des lactocoques thermotolérants
Etude de la cinétique de croissance en milieu M17 (à 30°C et 50°C)
Etude de la cinétique de croissance en milieu lait (à 30°C et 50°C)
Croissance sur différents milieux de cultures
Traitement par l’ultrasonification
Analyse génétique
Obtention des variants
Analyse des variants
Test de thermotolérance des variants
Test d’activité protéolytique et d’hydrolyse du lactose
Curage d’ADN plasmidique et transformation par éléctroporation
Curage
Transformation bactérienne par éléctroporation
Extraction de l’ADN plasmidique
Dosage et contrôle de pureté de l’ADN
Préparation des cellules compétentes
Conditions de transformation
Extraction de l’ADN génomique
Préparation de l’ADN génomique « à la protéinase K »
Extraction de l’ADN génomique par KIT
Amplification par PCR
Amplification des gènes de choc thermique par RT-PCR
Isolement de l’ARN
Synthèse du cDNA et RT- PCR
Séquençage
Séquençage partiel de l’ADNr 16S
Séquençage du gène gdpP
Construction phylogénétique
Séquençage du génome total d’un lactocoque thermotolerant
Choix de la souche
Stratégie de séquençage envisagée
Préparation de l’ADN génomique pour le séquençage hautdébit Illumina
Préparation de la librairie
Principe du séquençage par la technique Illumina (séquençage
par terminaison cyclique réversible)
Analyse bio-informatique des données de séquençage
Types d’analyse
Alignement
Construction de gabarits « Scaffolding »
Estimation de la qualité globale des lectures et filtration des lectures
L’assemblage des données issues du séquençage nouvelle génération
Les difficultés de l’assemblage
Les méthodes d’assemblage des séquences
La méthode «overlap-layoutconsensus»
L’approche du graphique « De Bruijn »
Vue d’ensemble des assembleurs et leur utilisation
Assemblage génomique et méta-génomique
Assembleurs utilisés
Annotation du génome et génomique fonctionnelle
Analyse méta-génomique
La microscopie électronique à balayage (MEB/SEM)
Principe de la microscopie électronique à balayage
Interactions du faisceau électronique avec l’échantillon
Émission d’électrons secondaires
Émission d’électrons rétrodiffusés
Émission de rayons X
Émission d’électrons Auger
Cathodoluminescence
Canalisation d’électrons
Équipement
Préparation des échantillons pour la microscopie électronique
à balayage MEB
A partir du milieu liquide
A partir du milieu solide
Conditions opératoires
Ressources bioinformatiques en ligne ou logiciels utilisés
Chapitre 3 : Résultats et discussion
Partie I : Diversité naturelle des lactocoques dans le lait de chamelle
d’Algérie
Introduction
Etude de la diversité des isolats
Caractéristiques morphologiques
Caractéristiques macroscopiques
Caractéristiques microscopiques
Test de la thermotolérance
Analyse physiologique
Test de Protéolyse en milieu solide Agar-lait
Screening des lactocoques thermotolérants
Etude de la cinétique de croissance en milieu M17 (à 30°C et 50°C)
Etude de la cinétique de croissance en milieu lait (à 30°C et 50°C)
Analyse génétique
Test de thermotolérance des variants
Test d’activité protéolytique et d’hydrolyse du lactose
Expression des gènes de choc thermique par RT-PCR
Analyse phylogénétique
Séquençage de l’ADNr 16S: le lait de chamelle présente une diversité
naturelle parmi les sous espèces de L. lactis
Séquençage de gdpP : Variabilité génétique du gène gdpP parmi les sous
espèces de lactis et signes de transfert horizontal de gènes
Lait de chamelle, une niche écologique propice au transfert entre les sous
espèces Lactococcus lactis
L. lactis subsp lactis biovar diacetylactis HD20A est une chimère entre
ssp. cremoris et ssp. lactis
Partie II : Analyse du génome de Lactococcus lactis subsp. lactis bv.
diacetylactis HD9B_GL2
Introduction
Définitions importantes
Analyse des données de séquençage
Vérification de la qualité des séquences
Suppression des adaptateurs/primers
Filtres des séquences
Assemblage des séquences
Assemblage de novo
Mapping des données sur une référence
Construction de gabarits « Scaffolding »
Annotation
Création de Workflows
Analyse des données génomique de Lactococcus lactis subsp. lactis bv.
diacetylactis HD9B_GL2
Phages et plasmides dans la HD9B_GL2
Diversité de la robustesse chez Lactococcus lactis HD9B_GL2
(robustness related genes)
Analyse de l’organisation génétique des gènes de choc thermique chez L.
lactis ssp. lactis HD9B_GL2
Partie III : Analyse métagénomique d’un consortium bactérien
« Lactococcus, Leuconostoc et Enterococcus » présent dans
l’écosystème lait de chamelle
Introduction
Analyse de la micro-communauté 9B
Identification des trois espèces du « consortium »
Séparation des trois espèces
Caractérisation des trois espèces séparées du consortium microbien
Cinétique de croissance á différentes températures
Propriétés importantes
Observations morphologiques en microscopie électronique à balayage
Caractérisation moléculaire de la Biogenèse des pilis chez Lactococcus lactis
HD9B_GL2 et leur rôle dans l’agrégation et la Formation de Biofilms
Analyse moléculaire d’un nouveau cluster de gènes eps chez L. lactis
HD9B_GL2 et son investigation dans la micro-agrégation
Conclusion et perspectives

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