Soutenance mémoire
VIRUS A ARN
Les virus à ARN sont parmi les agents pathogènes les plus abondants chez l’homme, les animaux et les plantes. Ils constituent le seul exemple connu d’organismes dont le génome est fait d’ARN. Leur cycle de réplication est indépendant de l’expression des ADN cellulaires (transcription et réplication du génome cellulaire). Les mécanismes de réplication font appel à des enzymes ARN (ou ADN) polymérases-ARN dépendantes qui sont capables d’utiliser l’ARN du virus comme matrice. Contrairement aux ADN polymérases ADN dépendantes des bactéries et des virus à ADN, ces enzymes n’ont pas la capacité de corriger les erreurs de lecture (« proof-reading ») pendant la réplication virale, et sont susceptibles d’entraîner des mutations au niveau du génome des virus nouvellement synthétisés. Ces mutations peuvent créer des variants génétiques au sein d’un même isolat (quasi-espèces). Dans ce chapitre, nous décrirons les différents mécanismes de la diversité génétique des virus à ARN et les conséquences de cette variabilité génétique sur le génome viral. Nous prendrons comme exemples deux groupes différents de virus à ARN : le virus de l’hépatite C (VHC) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Ces 2 groupes des virus partagent des propriétés communes : leur génome est constitué par un ARN monocaténaire (simple brin), non segmenté et de polarité positive. Ces virus enveloppés se multiplient dans le cytoplasme de la cellule hôte et se libèrent par bourgeonnement à la surface de la membrane cytoplasmique.
Réponses immunitaires à médiation humorale
Les anticorps (Ac) ou les immunoglobulines (Ig) apparaissent en moyenne 7 à 8 semaines après le début de l’infection et sont dirigés contre la plupart des protéines virales. La réponse est toujours forte et stable vis-à-vis de la capside et de la protéine NS3. Cette réponse persiste après l’élimination virale puis disparaît progressivement en commençant par la protéine NS3 suivie de NS4, NS5 et la capside. La région HVR1 en position N-terminale de la glycoprotéine d’enveloppe E2 est l’antigène viral le plus apte à induire la synthèse d’Ac neutralisants. L’efficacité de la réponse humorale dans l’élimination du VHC est controversée. Certaines études affirment que les Ac anti-VHC jouent un rôle important dans le devenir de l’infection. Ils peuvent être responsables par une action directe d’une éradication virale (Zibert et coll., 1997) comme, d’une manière indirecte, d’une persistance virale, en étant incapables de neutraliser les nombreux variants de la région HVR1 dans le cadre d’un échappement immunitaire (Manzin et coll., 2000). D’une manière générale, la réponse humorale ne semble jouer un rôle majeur ni dans la résolution de l’infection ni dans le maintien d’une immunité acquise : les sujets guéris présentent en effet une disparition progressive des anticorps alors qu’ils conservent une immunité cellulaire spécifique.
EPIDEMIOLOGIES MOLECULAIRES : SEROPREVALENCE ET DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DES GENOTYPES DES VIRUS DE L’HEPATITE C
La pandémie actuelle de l’hépatite C constitue un problème majeur de santé publique. Elle touche plus 170 millions d’individus dans le monde, soit 3% de la population mondiale dont 4 millions se trouvent aux Etats-Unis et 5 millions en Europe Occidentale. Les taux de prévalence de l’infection dans le monde varient d’un pays à l’autre (0,5% à plus de 10%). En Europe, la proportion d’individus atteints varie de 0,5 à 2% en fonction des pays, avec un gradient croissant Nord-Sud. En Europe de l’Est, certains pays sont particulièrement touchés avec une prévalence qui peut atteindre jusqu’à 3 à 4%. En France, 1 à 1,2% de la population est estimé être infecté par le VHC. A Madagascar, le taux de prévalence dans la population générale est estimé à 3,3% (WHO, 1999). Les génotypes 1, 2 et 3 de VHC sont des souches ubiquitaires (Figure 3). Les soustypes 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, et 3a sont responsables de plus 90% de infections en Amérique du Nord et du Sud, en Europe, et au Japon. Aux Etats-Unis, le génotype 1 est responsable approximativement de 70% des infections mais les sous-types 1a et 1b sont les plus dominants. Ces sous-types sont également prédominants en Europe. Au Japon, le sous-type 1b est responsable jusqu’à de 73% des cas d’infection par le VHC. Même si les sous-types 2a et 2b soient relativement communs en Amérique du Nord, en Europe et au Japon, le sous-type 2c se trouve généralement dans le nord de l’Italie. Les génotypes 1 et 2 sont également prédominants en Afrique de l’Ouest (Ghana, Bénin, Burkina Faso et Guinée) et en Afrique du Nord (Candotti et coll., 2003 ; Jeannel et coll., 1998). Le génotype 3a est particulièrement répandu en Europe et aux Etats-Unis chez les utilisateurs de drogue par voie intraveineuse. Les autres sous-types du génotype 3 (3b à 3f) ont été spécifiquement décrits en Asie du Sud, comme au Népal, au Bangladesh, en Inde et au Pakistan. Le génotype 4 est prédominant en Afrique du Nord et en Afrique sub-saharienne et au Moyen-Orient. Le sous-type 4a constitue la majorité des infections en Egypte. Les autres sous-types de génotype 4 (4b à 4k) ont été mentionnés en Afrique Centrale (Zaïre et Gabon), en Afrique du Nord et au Moyen-Orient. Le génotype 5 semble être confiné en Afrique du Sud. L’infection avec le sous-type 5a constitue un problème particulier en Afrique du Sud parce qu’il est responsable pour plus de 50% des infections. Le génotype 6 se trouve en Asie du Sud-Est (Hong Kong, Vietnam et Indonésie). Le sous-type 6a est responsable de la majeure partie des infections à Hong-Kong (Figure 3). La grande diversité génétique et la prévalence des quelques génotypes de VHC dans quelques parties du monde telles que l’Afrique de l’Ouest (pour le génotype 2 : 2c à 2l), l’Afrique Centrale (pour le génotype 4 : 4b, 4c, 4e à 4m) et l’Asie du Sud-Est peut indiquer que ces génotypes sont endémiques et ont beaucoup circulé dans ces populations depuis longtemps. Inversement, la diversité limitée de sous-types dans les pays d’Amérique du Nord, d’Europe et du Japon peut supposer que l’introduction de ces virus dans ces pays est récente. (Shepard et coll., 2005 ; Simmonds, 2004 ; Simmonds et coll., 2005).
Tests de détection qualitative de l’ARN du VHC
Les tests de détection qualitative de l’ARN du VHC sont toujours utilisés car ils sont en général plus sensibles (environ 10 fois) que les tests quantitatifs. Le seuil de sensibilité de cette technique est de l’ordre de 100 copies de génome/mL soit environ 50 UI/mL. Cette technique permet de pallier les différences notables de sensibilité, de spécificité et de reproductibilité. Ces tests sont fondés sur le principe de l’amplification de la cible c’est-à-dire la synthèse au cours d’une réaction enzymatique cyclique d’un grand nombre de copies du génome viral qui peuvent ensuite être détectées par différentes méthodes. La polymerase chain reaction (PCR) utilise une ADN polymérase thermostable et des cycles successifs de températures différentes pour synthétiser des copies d’ADN double-brin. La transcription-mediated amplification (TMA) utilise une T7 ARN polymérase à température constante pour synthétiser des copies d’ARN simple-brin. Les inconvénients de ces méthodes d’amplifications résident dans la possibilité de trouver des faux positifs qui peuvent être dûs à une contamination (soit de l’échantillon, soit lors de la réalisation du test) ou de faux négatifs (présence d’inhibiteurs de réaction RT-PCR). Il existe des tests qui se présentent comme des kits commerciaux :
– Amplicor® HCV 2.0, Roche Molecular Systems (seuil de détection : 50 UI/mL) ;
– Cobas Amplicor HCV 2.0, Roche Diagnostics (seuil de détection : 50 UI/mL) ;
– Versant HCV RNA, Chiron (seuil de détection : 10 UI/mL).
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Table des matières
I- INTRODUCTION
II- REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1- Virus à ARN
1-1- Virus de l’hépatite C (VHC)
1-1-1- Classification
1-1-2- Notion de quasi-espèce et VHC
1-1-3- Organisation génomique de VHC
1-1-3-1- Région 5’NC
1-1-3-2- Région de la phase ouverte de lecture ou ORF
1-1-3-2-1- Protéine de la capside ou protéine « core » (C)
1-1-3-2-2- Glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2
1-1-3-2-3- Protéine p7
1-1-3-2-4- Protéine F
1-1-3-2-5- Protéine NS2
1-1-3-2-6- Protéine NS3
1-1-3-2-7- Protéine NS4a
1-1-3-2-8- Protéine NS4b
1-1-3-2-9- Protéine NS5a
1-1-3-2-10- Protéine NS5b
1-1-3-3- Région 3’NC
1-1-4- Réponses immunitaires et VHC
1-1-4-1- Evolution naturelle de l’infection avec le VHC
1-1-4-2- Réponses immunitaires à médiation cellulaire
1-1-4-2-1- Réponse des lymphocytes TCD4 ou T helper (Th)
1-1-4-2-2- Réponse des lymphocytes TCD8 ou T cytotoxiques (CTL)
1-1-4-3- Réponses immunitaires à médiation humorale
1-1-5- Epidémiologies moléculaires : séroprévalence et distribution géographiques des génotypes des virus de l’hépatite C
1-1-6- Méthodes de diagnostic biologique du VHC
1-1-6-1- Modalités et délais de transport des prélèvements
1-1-6-2- Diagnostic biologique du VHC
1-1-6-2-1- Tests sanguins indirects
a- Tests sérologiques de détection des anticorps anti-VHC
b- Tests sérologiques de détermination du génotype ou sérotypage
1-1-6-2-2- Tests sanguins directs
a- Tests de détection qualitative de l’ARN du VHC
b- Test de détection quantitative de l’ARN du VHC
c- Tests de détermination du génotype viral
d- Tests de détection et quantification de l’antigène de capside du VHC
1-2- Virus de l’immunodéficience humaine (VIH)
1-2-1- Classification du VIH
1-2-2- Organisation génomique du VIH-1
1-2-2-1- Régions LTR (Long Terminal Repeat)
1-2-2-2- Gène gag (group antigen)
1-2-2-3- Gène pol (polymerase)
1-2-2-4- Gène env (envelope)
1-2-2-5- Gène tat (trans-activator of transcription)
1-2-2-6- Gène rev (regulation of expression of virions)
1-2-2-7- Gène nef (negative factor)
1-2-2-8- Gène vif (viral infectivity factor)
1-2-2-9- Gène vpr (virion protein R)
1-2-2-10- Gène vpu (viral protein U)
1-2-3- Réponses immunitaires de l’organisme face au VIH
1-2-3-1- Evolution de l’infection avec le VIH
1-2-3-2- Réponse immunitaire à médiation cellulaire
1-2-3-3- Réponse immunitaire à médiation humorale
1-2-4- Epidémiologies moléculaires de VIH : séroprévalence et distribution géographiques des génotypes
1-2-5- Diagnostic biologique du VIH
1-2-5-1- Tests sanguins indirects
1-2-5-1-1- Dépistage des anticorps anti-VIH
1-2-5-1-2- Tests mixtes
1-2-5-1-3- Détection d’anticorps plus spécifiques d’enveloppe par immuno-empreinte
1-2-5-2- Tests sanguins directs
1-2-5-2-1- Isolement de VIH
1-2-5-2-2- Détection des constituants et du génome viral
a- Détection du génome du VIH-1
b- Détection et quantification de l’antigène p24
1-2-5-2-3- Détermination de la charge virale
2- Génération de la diversité génétique chez les virus à ARN
2-1- ARN polymérase-ARN dépendante et ADN polymérase-ARN dépendante (transcriptase inverse ou RT)
2-1-1- Enzyme polymérase NS5b de VHC
2-1-2- Enzyme transcriptase inverse RT du VIH
2-2- Réplications virales
2-2-1- Cycle de réplication de VHC
2-2-1-1- Attachement et entrée
2-2-1-2- Décapsidation – traduction et maturation de la polyprotéine
2-2-1-3- Réplication de l’ARN
2-2-1-4- Assemblage du virion et relargage
2-2-2- Cycle réplicatif de VIH-1
2-2-2-1- Phase pré-intégrative
2-2-2-1-1- Reconnaissance, fusion membranaire et entrée du virus dans la cellule hôte
2-2-2-1-2- Décapsidation et transcription inverse de l’ARN génomique
2-2-2-1-3- Transport intranucléaire de l’ADN proviral
2-2-2-1-4- L’intégration de l’ADN proviral
2-2-2-2- Phase post-intégrative
2-2-2-2-1- Expression de l’ADN proviral
a- La phase précoce
b- La phase tardive
2-2-2-2-2 – Assemblage des virions, bourgeonnement et maturation
a- Recrutement des protéines virales dans l’assemblage
b- Recrutement des ARN dans l’assemblage
c- Bourgeonnement et maturation du virion
2-3- Mutations génomiques et variabilités
2-3-1- Fréquences des mutations chez les virus à ARN
2-3-2- Polymorphisme du VHC et traitements
2-3-2-1- Mécanismes de résistance de VHC aux traitements
2-3-2-1-1- Protéine NS5a : ISDR
2-3-2-1-2- Région E2 : HVR1 et Motif PePHD
2-3-3- Antirétroviraux (ARV) et traitement de VIH-1
2-3-3-1- Inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse
2-3-3-2- Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse
2-3-3-3- Inhibiteurs de la protéase
2-3-3-4- Inhibiteur de fusion
2-3-4- Mécanismes de la résistance aux ARV chez les VIH-1
2-3-5- Mutations associées aux résistances aux ARV chez les VIH-1
2-4- Recombinaisons génomiques et variabilités
2-4-1- Recombinaison homologue
2-4-2- Recombinaison non homologue (ou hétérologue)
III- MATERIEL ET METHODES
1- Populations et échantillons d’étude
1-1- Pour les virus de l’hépatite C
1-2- Pour les virus de l’immunodéficience humaine
2- Génotypage des virus par analyse moléculaire
2-1- Extraction de l’ARN viral
2-2- Amplifications des régions génomiques virales
2-2-1- Choix des régions génomiques étudiées
2-2-1-1- Virus de l’hépatite C
2-2-1-2- Virus de l’immunodéficience humaine de type 1
2-2-2- Amplifications génomiques par RT-PCR
2-2-2-1- Principe
2-2-2-2- Amplifications génomiques de VHC
2-2-2-2-1- Amplification de la région 5’NC à fin de diagnostic
2-2-2-2-2- Amplification de la région 5’NC à fin de génotypage
2-2-2-2-3- Amplification des régions NS5b et E1/E2 à fin de génotypage et de soustypage
2-2-2-3- Amplifications génomiques de VIH
2-2-2-3-1- Amplification par RT-PCR des 3 régions génomiques cibles
2-2-2-3-2- Amplification par PCR-nested des 3 régions génomiques cibles
2-3- Purification des produits d’amplification
2-4- Séquençage des produits d’amplification
2-5- Analyses des séquences et étude phylogénétique
2-5-1- Recherche de sous-type ou de génotype par BLAST
2-5-2- Identification de sous-type ou de génotype par analyse phylogénétique
2-6- Recherche des mutations associées aux résistances aux ARV
2-7- Soumission des séquences à la banque de données
IV- RESULTATS ET DISCUSSIONS
1- Virus de l’hépatite C
1-1- Détection de l’ARN de VHC par amplification génique de la région 5’NC
1-2- Détermination des génotypes par analyse moléculaire
1-2-1- Identification des génotypes par recherche de similarité dans la région 5’NC
1-2-2- Identification des sous-types par construction d’arbres phylogénétiques
1-2-3- Numéros d’accès des séquences de VHC
1-3- Discussion
2- Virus de l’immunodéficience humaine
2-1- Confirmation de la séropositivité VIH par Western Blot
2-2- Identification des sous-types de VIH-1 par analyse moléculaire et recherche des mutations de résistance aux antiretroviraux
2-2-1- Identification des sous-types par recherche de similarité dans les trois régions génomiques RT, PR et env
2-2-2- Identification des sous-types par analyse phylogénétique dans la région env
2-3- Recherche des mutations associées à la résistance aux ARV
2-4- Numéros d’accès des séquences de VIH
2-5- Discussion
V- CONCLUSION ET PERSPECTIVES
VI- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
VII- ANNEXES
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