Soutenance mémoire
Généralités sur T. gondii, un parasite Apicomplexa
Présentation des parasites Apicomplexa
Le phylum des Apicomplexa représente une partie des Aveolata, un groupe de protistes qui comprend les ciliés et les dinoflagellés (Fast et al., 2002). Dans ce groupe, les Apicomplexa regroupent un nombre important de parasites strictement intracellulaires obligatoires, soit environ plus de 6000 espèces (Adl et al., 2007) ; (Blader et al., 2015) et qui causent diverses maladies aussi mortelles tant pour les animaux que pour les humains (Janouškovec et al., 2019). Parmi ces parasites figurent T. gondii, P. falciparum, Cryptospridium parvum et Isospora spp qui infectent l’homme avec un niveau d’émergence croissant et constituent de véritable menace pour la santé mondiale (Beck et al., 2009) ; (Campo et al., 2019). T. gondii cohabite dans le groupe des Sarcocystidae avec Neospora et Isospora, deux parasites Apicomplexa qui sévissent actuellement comme T. gondii dans le monde (Figure 1) (Elsheikha et al., 2005) ; (Beck et al., 2009). Eimeria spp, Neospora spp, Babesia spp et de Theileria spp sont également des parasites émergeants qui infectent strictement les animaux et constituent ainsi de véritables problèmes pour l’élevage mondial (Elsheikha et al., 2005) ; (Füssy et Oborník, 2017) ; (Janouškovec et al., 2019).
Cryptosporidium spp
Le genre Cryptosporidium spp regroupe plusieurs espèces dont C. ducismarci, C. testudinis, C. hominis, C. andersoni, C. muris, C. tyzzeri, C. erinacei et C. parvum (Kostopoulou et al., 2015) ; (Qi et al. 2015) ; (Deng et al., 2017) ; (Inácio et al., 2017) identifiées le plus souvent dans les aliments y compris l’eau (Couso-Pérez et al., 2020). Ces parasites opportunistes causent la cryptosporidiose, une maladie diarrhéique mortelle chez les personnes immunodéprimées et les enfants de moins de 5 ans dans le monde (Troeger et al., 2018), (O’Connor et al., 2011) ; (Vinayak et al., 2015). D’après l’OMS en 2017, le taux de mortalité annuel de la diarrhée chez les enfants est estimé à près d’un tiers du taux de contamination annuel qui est plus de 1,7 millions (https://www.who.int/en/news room/factsheets/detail/diarrhoeal-disease); (Troeger et al., 2018). Les pays de l’Asie du sud et l’Afrique subsaharienne dont le Bénin enregistrent la majeur partie de ce taux de mortalité mondial (Kotloff et al., 2013). En France le taux de décès dû à la cryptosporidiose est plus enregistré chez les personnes immunodéprimées et est causé essentiellement par Cryptosporidium parvum (Costa et al., 2020).
Eimeria spp
Les parasites du genre Eimeria affectent exclusivement les animaux (domestique et sauvage) en causant la coccidiose, une maladie qui provoque de véritable perte économique sur le plan mondial (Beck et al., 2009) ; (Balta et al., 2021). Parmi ces parasites figurent plusieurs espèces dont : Eimeria bovis, Eimeria zuernii, Eimeria alabamensis, Eimeria brasiliensis, Eimeria bukidnonensis, Eimeria canadensis, Eimeria cylindrica, Eimeria ellipsoidalis, Eimeria subspherica et Eimeria zuernii (Velásquez et al., 2021) ; (Pyziel et al., 2014) ; (Cruvinel et al., 2018). Au Bénin, la prévalence de la coccidiose était estimée à 36,6% chez les troupeaux et oiseaux (Dakpogan et Salifou, 2013). Le taux de mortalité de la coccidiose chez les perdrix était compris entre 46,5%-52,1% en France (Naciri et al., 2011).
Plasmodium spp
Le genre Plasmodium spp regroupe les espèces comme P. falciparum, P. vivax, P. ovale curtisi, P. malariae et P. knowlesi responsables du paludisme dans le monde (Calderaro et al., 2013) ; (Beck et al., 2009). Le paludisme dû au P. falciparum est la forme la plus grave surtout chez les femmes enceintes et les enfants à travers le monde surtout en Afrique (Kalanon et McFadden, 2010).
Toxoplasma gondii
La toxoplasmose est une maladie cosmopolite aussi bien animale qu’humaine et qui est causée par T. gondii, l’unique espèce du genre Toxoplasma. La prévalence de la toxoplasmose humaine au Bénin est estimée à 48% chez les femmes (Ogouyèmi-Hounto et al., 2014). Au Bénin, T. gondii est à la base de près de 27% des cas de perte fœtale et d’environ 36% de mortalité néonatale chez les animaux (Tonouhewa et al., 2020). En Europe, la prévalence de la toxoplasmose était d’environ 67% chez les chats (Montazeri et al., 2020) alors que son estimation était de 27% chez les femmes (Nogareda et al., 2014). Faisant partie du phylum des Apicomplexa, la classification taxonomique de T. gondii se présente comme suit Règne : Protista, Phylum : Apicomplexa, Classe : Coccidia, Famille : Sarcocystidae, Sous-famille : Toxoplasmatinae, Genre : Toxoplasma et Espèce : gondii (Barta, 2001) ; (Levine, 1988).
Biologie de T. gondii, agent causal de la toxoplasmose
Cycle biologique de T. gondii et les différents stades parasitaires
Le cycle de vie de T. gondii se déroule en deux grandes phases : la phase sexuée et la phase asexuée. En effet, lors de son évolution Toxoplasma effectue la phase sexuée de son cycle chez les félidés dont le chat qui est l’hôte définitif. Quant à la phase asexuée, elle se déroule chez les êtres vivants tels que : les mammifères, les oiseaux et les animaux aquatiques qui représentent l’hôte intermédiaire du parasite (Dubey et al., 1998) ; (Dubey, 2009). Lors de ce cycle complexe, le parasite alterne ses différentes formes à savoir le tachyzoïte, le bradyzoïte et le sporozoïte (oocyste sporulé) au sein de ces différents hôtes (Figure 2). Le tachyzoïte (Figure 2A) est la forme virulente du parasite et est doté d’une multiplication plus rapide et est typiquement identifié dans les infections aiguës. S’agissant du bradyzoïte (origine des kystes tissulaires) (Figure 2B), c’est la forme de multiplication lente du parasite et caractéristique des infections chroniques chez l’hôte intermédiaire, contrairement au sporozoïte (Figure 2C) produit uniquement chez l’hôte définitif donc lors de la reproduction sexuée (Attias et al., 2020).
Phase sexuée
Chez T. gondii, la phase sexuée encore appelée la gamétogonie se déroule uniquement chez le chat son hôte définitif de référence (Kochanowsky et Koshy, 2018). Le chat s’infecte par les kystes toxoplasmiques qui se situent dans les petits oiseaux ou rongeurs. Dans l’estomac, en raison du probable niveau faible du pH, la paroi kystique est perturbée par l’action des enzymes protéolytiques libérant ainsi les bradyzoïtes (Figure 2D). Ces derniers vont envahir les cellules épithéliales et gagner ensuite les entérocytes au niveau desquelles il y a la schizogonie (une série de division asexuée) générant des schizontes qui s’individualisent par fragmentation cytoplasmique en des mérozoïtes (Attias et al., 2020). Ces mérozoïtes se différencient par la suite en des microgamétocytes mâles et macrogamétocytes femelles dont les zygotes donnent des oocystes après fécondation. Possédant une taille de 10 à 12 μm de diamètre, ces oocystes sont entourés d’une double couche formant ainsi la paroi qui les protège. Dans l’environnement, le chat excrète ces oocystes qui sont sporulés dans un délai de 21 jours pour donner les oocystes sporulés (sporozoïtes haploïdes) très infectant pour les autres hôtes (Dubey et al., 1970). Les oocystes sporulés peuvent survivre jusqu’environ 15 mois à température ambiante, ou au moins 54 mois à 4°C ou encore à six mois dans l’eau de mer à température ambiante ou à 4°C (Dubey et al., 1998) ; (ANSES, 2011).
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Table des matières
Introduction
Partie 1 : Généralités sur T. gondii, un parasite Apicomplexa
I Présentation des parasites Apicomplexa
I-1 Cryptospridium spp
I-2 Eimeria spp
I-3 Plasmodium spp
I-4 Toxoplasma gondii
II Biologie de T. gondii, agent causal de la toxoplasmose
II-1 Cycle biologique de T. gondii et les différents stades parasitaires
II-2 La toxoplasmose
II-3 Les organites caractéristiques de T. gondii : un modèle d’étude des Apicomplexa
III-Biogénèse des trois organites sécrétoires spécifiques chez T. gondii
III-1 Biogénèse des Micronèmes
III-2 Biogénèse des rhoptries
III-3 Biogénèse des granules denses
IV-Composition et fonctionnement du glideosome lors de l’invasion de la cellule hôte
V-Phénomène d’invasion de la cellule hôte par T. gondii et les différentes protéines impliquées
V-1 Liaison de T. gondii à la membrane plasmique de l’hôte
V-2 Orientation du pôle apical de T. gondii
V-3 Mise en place de la jonction mobile
V-4 Mise en place de la vacuole parasitophore et sa membrane
VI-Acquisition des nutriments et division de T. gondii au sein de la cellule hôte par endodyogénie
VI-1 Acquisition des nutriments par T. gondii
VI-2 Division de T. gondii au sein de la cellule hôte par endodyogénie
VII- Trafic intracellulaire chez les Apicomplexa et les facteurs impliqués : cas de T. gondii
VII-1 Transport antérograde des protéines
VII-2 Transport rétrograde et recyclage du récepteur cargo
VII-3 Mécanisme de sécrétion des protéines de micronèmes, rhoptries et granules denses et leurs rôles chez T. gondii
VII-4 Transport des lipides chez T. gondii
VIII Rôles des domaines Bin-Amphiphysin-RVS (BAR), Set Binding Factor (SBF2) et myotubularin-related (MTMR) lipid phosphatases des protéines chez les eucaryotes
Problématique
Partie 2 : Matériels et méthodes
I-Culture cellulaire
I-1 Culture des fibroblastes humains et entretien de T. gondii
I-2 Purification parasitaire
II-Biologie moléculaire
II-1 Extraction de l’ADN génomique des tachyzoïtes de T. gondii
II-2 Extraction de l’ARNm des tachyzoïtes de T. gondii
II-3 Obtention de l’ADNc par rétrotranscription
II-3 Construction du mutant iKO-TgREMIND par clonage dans le plasmide pG13-DT7S4
II-4 Complémentation du mutant iKO-HA-TgREMIND par clonage dans le vecteur pUPRT
II-5 Obtention des parasites transgéniques par la technique de Knock-In
II-6 Obtention du mutant de Knockdown de TgSTART par la technique d’Auxine dégron inductible
II-7 Transfection des parasites
III-Biologie cellulaire
III-1 Test d’invasion
III-2 Mesure de la motilité parasitaire
III-3 Test de plage de lyse
III-4 Immunofluorescence indirecte
III-5 Microscopie électronique
IV-Biochimie
IV-1 Production et purification des protéines recombinantes
IV-2 Electrophorèse en gel d’acrylamide
IV-3 Western Blots
IV-4 GST-pull down
IV-5 Fractionnement cellulaire
V-Analyses statistiques
Partie 3 : Résultats, Discussion, Conclusion et Perspectives
RESULTATS
I- TgREMIND, fixateur des phosphoinositides est essentielle pour la sécrétion des organites chez Toxoplasma et à l’infection de la cellule hôte
II Caractéristiques de START domain containg protein (TgSTART) un des transporteurs de lipide chez T. gondii
II-1 Analyse de la séquence de TgSTART
II-2 Expression de TgSTART chez les parasites transgéniques de T. gondii
II-3 Distribution de TgSTART-HA3x par rapport aux organites et compartiments connus chez T. gondii
II-4 Expression de TgSTART chez les parasites mutants Knockdown inductibles
DISCUSSION
CONCLUSION
PERSPECTIVES
